任戈一，馬雪蓮，潘 麗，齊海雯，冰瑪拉措，張書(shū)堯，顏海燕

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

我國(guó)是畜禽肉類(lèi)生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，2019 年我國(guó)畜禽肉總產(chǎn)量為7758.78 萬(wàn)t[1]，其中牛肉產(chǎn)量為667萬(wàn)t。然而，在牛肉的生產(chǎn)消費(fèi)過(guò)程中，牛骨作為主要副產(chǎn)物，約占?？傮w重的20%～30%。膠原蛋白為牛骨中主要蛋白質(zhì)，含量高達(dá)90%以上[2]，膠原蛋白具有乳化、凝膠、起泡等功能特性，同時(shí)還具有促進(jìn)新陳代謝，延緩衰老等生理功能。此外，其中含有多種人體必需氨基酸，含量為39.6 mg/100 g[3]，能夠滿(mǎn)足不同人群對(duì)氨基酸的需求，因此骨膠原蛋白的提取及應(yīng)用已經(jīng)成為科研工作者的關(guān)注熱點(diǎn)。

目前，膠原蛋白提取的常用方法有：酸法、酶法、堿法、水熱法。酸法提取反應(yīng)迅速、提取時(shí)間較短，且原料提取較徹底，得到的膠原蛋白結(jié)構(gòu)較為完整，但由于酸具腐蝕性，設(shè)備易老化，設(shè)備費(fèi)用增加；酶法提取是加入特定的蛋白酶以增進(jìn)膠原蛋白非螺旋區(qū)段肽鍵降解，通常不會(huì)引起膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)變化[4]，且能夠維持其特有的生物活性[5]；堿法提取雖比較迅速，但堿性條件下會(huì)破壞膠原蛋白中的羥基和巰基并使得某些氨基酸消旋，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終影響其功能特性，產(chǎn)生“三致”毒害性[6]，此方法逐漸被酸法或酶法所替代；熱水提取的膠原蛋白由于長(zhǎng)時(shí)間在較高的溫度下浸提，破壞其部分結(jié)構(gòu)，從而影響其功能特性。

現(xiàn)階段，有關(guān)膠原蛋白的提取主要集中于提取方法及其條件優(yōu)化的研究，但不同提取方法得到的膠原蛋白結(jié)構(gòu)差異的研究少有報(bào)道。膠原蛋白結(jié)構(gòu)決定膠原蛋白功能特性，研究不同提取方法下膠原蛋白結(jié)構(gòu)的差異，可為其后續(xù)的功能特性的研究提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)。因此，本課題采用酸法及酶法提取工藝提取牛骨膠原蛋白，研究不同提取方法下膠原蛋白結(jié)構(gòu)特性的差異并分析其中的原因，為有效利用牛骨資源和研究牛骨膠原蛋白的相關(guān)功能特性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西門(mén)塔爾牛股骨 石河子市友好超市；胃蛋白酶（3000U/mg） 上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷、MD10 透析袋（8～14 kDa） 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、溴酚藍(lán) 德國(guó)Meker 公司；冰乙酸、檸檬酸、溴化鉀等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PG-360 型強(qiáng)力碎骨機(jī) 廊坊市惠友機(jī)械有限公司；GNM-130AQ 型骨泥磨 廊坊市惠友機(jī)械有限公司；X7 型酶標(biāo)儀 基因有限公司；T2A 型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Red 公司；FEI Quanta 200 型掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI 公司；TENSOR 27 型傅里葉變換紅外光譜儀 瑞士Bruker 公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫脂脫鈣骨粉的制備

1.2.1.1 原料前處理 去除新鮮牛骨表面的碎肉、脂肪、軟骨等雜質(zhì)，將其處理成為約10 cm×10 cm 大小碎塊，破骨機(jī)對(duì)牛骨塊破碎后用紗布吸水分并晾干，碎骨物料于骨泥機(jī)研磨，重復(fù)上述吸水步驟，真空包裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 堿洗 根據(jù)公維潔等[7]的方法稍作改動(dòng)。以料液比1:5 g/mL 加入并于4 ℃條件下震搖浸泡12 h，每隔6 h 更換一次溶液，目的是除去雜蛋白質(zhì)，提高膠原蛋白純度。

1.2.1.3 脫脂處理 根據(jù)秦娜娜[8]的方法稍作改動(dòng)。將堿洗所得的原料反復(fù)沖洗至中性，瀝干后以體積比1:5 加入并于4 ℃條件下震搖脫脂，每5 h 更換一次溶液，至溶液表面無(wú)明顯脂肪液滴。

1.2.1.4 脫鈣處理 采用南學(xué)敏[9]方法稍作改動(dòng)。將脫脂所得原料反復(fù)沖洗至中性，瀝干后，于4 ℃條件下脫脂物料以體積比1:10 混合，每隔6 h 更換一次溶液，外液中鈣含量參照國(guó)標(biāo)GB 5009.92-2016[10]的EDTA 滴定法測(cè)定，至溶液中無(wú)鈣含量則表明脫鈣完全。

1.2.2 膠原蛋白的提取

1.2.2.1 酸法提取 向骨樣中分別加入0.5 mol/L 乙酸溶液、0.5 mol/L 檸檬酸溶液，料液比為1:5 g/mL，震搖浸提24 h，收集上清液，調(diào)節(jié)上清液中NaCl 終濃度至0.9 mol/L，加入三羥甲基氨基甲烷（Tris）（6 g/L），調(diào)節(jié)pH7.5，攪拌均勻靜置過(guò)夜后，4 ℃、5000 r/min 離心15 min，沉淀物真空冷凍（-59.6 ℃，88～90 mT）干燥后得酸溶性膠原蛋白，分別記為ASC1、ASC2。

1.2.2.2 酶法提取 采用Shaik 等[11]方法稍作改動(dòng)，向骨樣中分別加入0.5 mol/L 的乙酸溶液和胃蛋白酶，0.5 mol/L 的檸檬酸溶液和胃蛋白酶，胃蛋白酶添加量均為20 U/mg，料液比為1:5 g/mL，震搖浸提24 h。收集上清調(diào)節(jié)pH＞8 滅酶，并調(diào)節(jié)溶液NaCl終濃度至0.9 mol/L，并加入Tris（6 g/L），pH 調(diào)至7.5，攪拌均勻靜置過(guò)夜后，4 ℃、5000 r/min 離心15 min，沉淀物真空冷凍（-59.6 ℃，88～90 mT）干燥后得酶溶性膠原蛋白，分別記為PSC1、PSC2。

1.2.2.3 膠原蛋白得率計(jì)算 對(duì)不同提取方法下得到的酸溶性膠原蛋白與酶溶性膠原蛋白的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算膠原蛋白得率。膠原蛋白得率計(jì)算公式如下：

1.2.3 膠原蛋白純化 參考劉麗莉等[12]的方法稍作改動(dòng)。對(duì)所得膠原蛋白粗品用0.5 mol/L 冰醋酸再次溶解后裝入透析袋（8～14 kDa），先用0.1 mol/L 冰醋酸透析2 d，再用蒸餾水透析2 d，每隔12 h 換一次透析袋外液。透析結(jié)束后沉淀物冷凍（-59.6 ℃，88～90 mT）干燥即得相對(duì)較純的骨膠原蛋白，凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 膠原蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.2.4.1 紫外光譜分析 參考李秋雨等[13]方法并稍作修改。2 mg/mL 的膠原蛋白溶液。室溫條件下用紫外分光光度計(jì)于200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)間隔為1 nm，以蒸餾水為空白對(duì)照。

1.2.4.2 掃描電子顯微鏡分析 參考賈偉[14]方法并稍作改動(dòng)。使用手術(shù)刀將適量?jī)龈珊蟮呐９悄z原蛋白切成約3×3×2 mm 的薄片均勻粘貼在雙面導(dǎo)電膠上，真空噴金后進(jìn)行牛骨膠原蛋白微觀(guān)結(jié)構(gòu)掃描觀(guān)察，放大倍數(shù)為500 倍，加速電壓為1.0 kV。

1.2.4.3 SDS-PAGE 分析 將蛋白質(zhì)樣品溶液與2x 樣品緩沖液按照1:1 比例混合后，沸水浴5 min，冷卻后取上清液15 μL 上樣。濃縮膠10%，分離膠5%。采用直壓恒流電源，濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓160 V，結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色40 min，脫色至透明后，用凝膠成像儀觀(guān)察分析[15]。

1.2.4.4 傅里葉紅外色譜分析 參考蔡路昀等[16]的方法：取一定質(zhì)量的牛骨膠原蛋白與等量的溴化鉀混合研磨壓片，置于多次衰減全反射附件上掃描，采用OMNIC 軟件記錄光譜圖，掃描波長(zhǎng)范圍設(shè)置為4000～450 cm-1，分辨率為1 cm-1

1.2.4.5 蛋白質(zhì)表面疏水性測(cè)定 1 mg/mL 蛋白樣品溶液取1 mL 加入100 μL 1 mg/mL 的溴酚藍(lán)（BPB），混合5 min 后，于4 ℃下，5000 r/min 離心15 min，取上清液在595 nm 下測(cè)定其吸光值，記作A。同時(shí)以磷酸鹽緩沖液作空白對(duì)照，記作A0[17]，計(jì)算如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)指標(biāo)至少平行測(cè)定三次，利用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，結(jié)果用Mean±SD 來(lái)表示，并采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性分析（ANOVA）檢驗(yàn)（P＜0.05）。使用Origin 2018 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表繪制并進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白得率

不同提取方法下膠原蛋白得率如圖1所示。由圖1可知，ASC1，ASC2 膠原蛋白得率分別為2.23%、2.02%，PSC1，PSC2 膠原蛋白得率則可達(dá)到3.23%、3.01%。酶法提取膠原蛋白得率顯著高于酸法（P＜0.05），且乙酸的提取效率略高于檸檬酸。酶法（PSC1和PSC2）膠原蛋白得率高于酸法（ASC1 和ASC2）的原因可能是在最適反應(yīng)條件下，酶促反應(yīng)的高效性和專(zhuān)一性使得膠原蛋白得率更高。ASC1 與ASC2相比，ASC1 的得率高于A(yíng)SC2 的原因可能是相同摩爾濃度下（0.5 mol/L），H+的解離程度不同，使得最終溶液的pH 不同，因此，相同濃度下，檸檬酸的pH 高于乙酸，影響膠原蛋白的提取效果，最終造成ASC1的得率高于A(yíng)SC2。王曉軍等[18]使用乙酸和胃蛋白酶提取牦牛骨膠原蛋白，其酸法和酶法提取膠原蛋白的得率分別為2.24%、3.32%。胡建平[19]采用胃蛋白酶在不同酸性環(huán)境下酶解魚(yú)鱗得到膠原蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙酸的提取率高于檸檬酸和鹽酸，本研究結(jié)果為酶法膠原蛋白得率高于酸法，與上述結(jié)論相符。

圖1 不同提取方法下的膠原蛋白得率Fig.1 Collagen yield under different extraction methods

2.2 紫外光譜分析

由圖2可知，不同方法提取得到的牛骨膠原蛋白的紫外光譜分別位于228、231、233、231 nm 處。四種膠原蛋白的紫外光譜基本一致，這是由于膠原蛋白不含有色氨酸，且苯丙氨酸和酪氨酸含量極低，使得紫外掃描下膠原蛋白在280 nm 處基本不出現(xiàn)吸收峰，而在230 nm 波長(zhǎng)附近出現(xiàn)最大吸收峰，這可能由于膠原蛋白中的羰基、羧基和酰胺基團(tuán)共同作用所致[20]。酸法和酶法提取得到的膠原蛋白紫外吸收峰不一致，可能是酶法提取過(guò)程中蛋白質(zhì)的特定切割位點(diǎn)使最終得到的氨基酸組成和種類(lèi)存在部分差異。ASC1 和ASC2 紫外最大吸收峰差異可能是由于提取膠原蛋白的酸種類(lèi)及pH 不同影響其特定氨基酸的比例的大小，從而使得提取得到的膠原蛋白于230 nm 處發(fā)生向左或向右的偏移。何蘭[21]利用酸法、酶法提取長(zhǎng)骨中膠原蛋白在223、219 nm 處有最大紫外吸收值，Madhuri[22]報(bào)道的魚(yú)皮膠原蛋白在230 nm 波長(zhǎng)附近具有最大紫外吸收值，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 不同提取方法下的膠原蛋白紫外光譜Fig.2 Ultraviolet spectra of collagen under different extraction methods

2.3 SDS-PAGE 凝膠電泳分析

對(duì)不同提取方法下得到的牛骨膠原蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，如圖3所示。由圖3可知，不同提取方法制得的膠原蛋白均具有β（約250 kDa）、α1（約135 kDa）、α2（約130 kDa）三條顯著條帶。ASC1、ASC2 的β鏈條帶細(xì)、顏色淺，而PSC1、PSC2 的β鏈條帶較為明顯，這可能是由于胃蛋白酶的存在促使膠原蛋白中γ鏈降解為β鏈而造成PSC1、PSC2 的β鏈條帶較深。ASC1、ASC2 的α1、α2肽鏈含量略低于相應(yīng)的PSC1、PSC2 的兩條α肽鏈，這可能是胃蛋白酶的作用使部分膠原蛋白降解成小分子，使PSC1 和PSC2 的兩條α肽鏈含量增多。β二聚體為兩條α鏈形成的膠原分子，β鏈的存在是膠原蛋白高度交聯(lián)的表現(xiàn)，由此可判斷出所得到的膠原蛋白符合Ⅰ型膠原蛋白的特征；與上述紫外光譜結(jié)果一致。本研究結(jié)果與海蜇[23]、紅鼓魚(yú)鱗[24]、尼羅羅非魚(yú)鱗[25]等其他來(lái)源的Ⅰ型膠原蛋白電泳圖相似。此外，與酸溶性膠原蛋白相比，酶溶性膠原蛋白在100 kDa 附近存在淺細(xì)的條帶，其原因可能是酶法提取過(guò)程中酶的作用使膠原蛋白酶解為其他小分子[26]。

圖3 不同提取方法下膠原蛋白的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of collagen under different extraction methods

2.4 表面疏水性分析

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)疏水性在其構(gòu)象和溶解性、乳化性等功能特性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此對(duì)疏水性進(jìn)行測(cè)定可以評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。本研究通過(guò)測(cè)定并計(jì)算結(jié)合態(tài)溴酚藍(lán)的量來(lái)表征膠原蛋白的疏水性[27]。對(duì)不同提取工藝下牛骨膠原蛋白的表面疏水性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，PSC1 膠原蛋白的表面疏水性可達(dá)5.49 μg，ASC2 膠原蛋白的表面疏水性低至2.64 μg。且ASC2、PSC1、PSC2 表面疏水性差異顯著（P＜0.05），但ASC1 和PSC2 差異不顯著。酶法提取的膠原蛋白疏水性較高可能是由于在提取過(guò)程中，胃蛋白酶切割牛骨蛋白的非螺旋區(qū)段，使所得膠原蛋白疏水性大幅增大；此外，胃蛋白酶特定的酶切位點(diǎn)使膠原蛋白的疏水性基團(tuán)暴露，特別是疏水性氨基酸含量增多，表面疏水性增加。ASC1 顯著（P＜0.05）高于A(yíng)SC2 的原因可能是乙酸的pH 較低，在此條件下提取的膠原蛋白的表面疏水基團(tuán)（如色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸和蛋氨酸等疏水性氨基酸）暴露更多，因此ASC1 較ASC2 的表面疏水性大。

圖4 不同提取方法下牛骨膠原蛋白的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of bovine collagen under different extraction methods

王立宇等[28]采用酸酶法提取了室溫下堿發(fā)的毛肚中膠原蛋白并利用溴酚藍(lán)法測(cè)定其表面疏水性，其值達(dá)到72～75 μg。與上述研究結(jié)果對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得膠原蛋白的表面疏水性較小，可能是由于膠原蛋白的來(lái)源、提取方法等因素的差異，使得疏水性氨基酸被包裹在內(nèi)部，游離的疏水性氨基酸較少，造成牛骨膠原蛋白表面疏水性小。

2.5 紅外光譜分析

圖5為采用酸法（ASC1、ASC1）及酶法（PSC1和PSC2）提取工藝下牛骨膠原蛋白在波數(shù)4000～450 cm-1紅外吸收譜圖。如圖5所示，從下而上的四種膠原蛋白的紅外光譜特征吸收峰相似，酸溶性膠原蛋白與酶溶性膠原蛋白在3400 cm-1附近均出現(xiàn)明顯的吸收峰，其為酰胺A 帶，這是由于N-H 收縮振動(dòng)引起，說(shuō)明肽鏈之間存在氫鍵，且其為蛋白質(zhì)的特殊吸收峰；圖中四種膠原蛋白酰胺Ⅰ帶吸收峰分別為1551.75、1605.75、1618.18、1581.54 cm-1，這是由于C-O 伸縮振動(dòng)會(huì)引起酰胺Ⅰ帶（1550～1660 cm-1）出現(xiàn)吸收峰，其與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；四種膠原蛋白分別在1421.45、1558.39、1504.39、1492.82 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，其值在酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰1400～1600 cm-1范圍內(nèi)，酰胺Ⅱ帶與蛋白質(zhì)的C-N 收縮振動(dòng)和N-H 彎曲振動(dòng)有關(guān)；此外，還與甘氨酸骨鏈及脯氨酸側(cè)鏈的-CH2 擺動(dòng)引起的振動(dòng)有關(guān)[3]，從而使得膠原蛋白在1400～1500 cm-1存在復(fù)雜的吸收峰；四種膠原蛋白分別在1317.30、1300.82、1213.12、1323.09cm-1出現(xiàn)酰胺Ⅲ帶的特征吸收峰，可能是側(cè)鏈基團(tuán)會(huì)出現(xiàn)多種類(lèi)型的變形振動(dòng)造成的。因此，紅外光譜表明四種膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)保留完整，間接說(shuō)明了所提的膠原蛋白保留完整。本研究結(jié)果與Gao 等[29]對(duì)羊骨膠原蛋白結(jié)構(gòu)，Maria等[30]對(duì)羅非魚(yú)皮，Ali 等[31]對(duì)金魚(yú)皮的研究結(jié)果一致，酶法和酸法提取均可以保留膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)。牛骨膠原蛋白的吸收峰由酰胺A、B 和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組成。

圖5 不同提取方法下膠原蛋白的紅外光譜Fig.5 Infrared Spectra of collagen under different extraction methods

2.6 掃描電鏡分析

不同提取方法下得到牛骨膠原蛋白掃描電鏡結(jié)果如圖6。由圖6可知，提取方法顯著影響膠原蛋白的結(jié)構(gòu)（P＜0.05）。酸溶性膠原蛋白較為松散，呈現(xiàn)出纖維狀纏繞狀態(tài)。ASC1、ASC2 分布均勻，具有多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。膠原蛋白在提取過(guò)程中，通過(guò)氫鍵和疏水作用等形成纖維狀[32]，不同的作用力導(dǎo)致膠原蛋白之間孔徑大小不同，外部特征等都存在一定的差異。酸法提取過(guò)程中膠原蛋白本身的空間結(jié)構(gòu)沒(méi)有被破壞，而PSC1、PSC2 的掃描電鏡結(jié)果表明酶對(duì)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)有一定的影響，但其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)仍然得到保留，纖維化相較明顯。王杉杉等[33]采用不同的提取方法提取牦牛皮膠原蛋白并進(jìn)行電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和形貌存在顯著差異，Li 等[34]對(duì)中華絨鱉甲殼組織膠原蛋白電鏡掃描后，結(jié)果表明酸法提取的膠原蛋白表現(xiàn)出更松散更多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，本研究結(jié)果與上述研究一致。通過(guò)對(duì)ASC1、ASC2 和PSC1、PSC2 的電鏡掃描結(jié)果進(jìn)行分析可知，膠原蛋白的提取方法不同，其形狀結(jié)構(gòu)也截然不同。綜合紫外可見(jiàn)光譜、紅外光譜、SDS-PAGE 和掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，酸法和酶法所提取的蛋白質(zhì)均保留了其特有的結(jié)構(gòu)。

圖6 不同提取方法下膠原蛋白的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope images of collagen under different extraction methods

3 結(jié)論

本研究以牛骨為研究對(duì)象，采用不同提取方法分別得到膠原蛋白ASC1、ASC1、PSC1 和PSC2，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明PSC1（乙酸和胃蛋白酶）得率可達(dá)3.23%，四種膠原蛋白均由β（約250 kDa）、α1（約135 kDa）、α2（約130 kDa）三種亞基構(gòu)成，為典型的Ⅰ型膠原蛋白，空間結(jié)構(gòu)也均保留完整；然而，酸法制備的膠原蛋白表現(xiàn)出更松散、更多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而酶法提取的膠原蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保留更完整，纖維化更明顯。本研究為牛骨膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，為牛骨膠原蛋白的高值化利用提供了理論依據(jù)。但大規(guī)模、短時(shí)間提取和生產(chǎn)牛骨膠原蛋白的最佳工藝和過(guò)程控制條件仍需繼續(xù)探討，牛骨膠原蛋白的工業(yè)化制備及應(yīng)用仍需深入探究。