苗鈞魁，張雅婷，金永霈，劉小芳，于 源，冷凱良,2,*，楊增光，蔣永毅

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市極地漁業(yè)資源開發(fā)工程研究中心，山東青島 266071；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266200；3.青島菲優(yōu)特檢測(cè)有限公司，山東青島 266111）

隨著全球漁業(yè)資源的衰退，南極磷蝦資源作為可持續(xù)的漁業(yè)替代資源，受到越來越多的關(guān)注[1]。南極磷蝦生物量可達(dá)6.5～10 億噸[2]，南極海洋生物資源養(yǎng)護(hù)委員會(huì)（CCAMLR）制定的謹(jǐn)慎性捕撈限額為561 萬噸，而目前實(shí)際捕撈量約為20～30 萬噸，因此，南極磷蝦資源具有巨大的開發(fā)潛力[3]。南極磷蝦富含優(yōu)質(zhì)的蛋白、脂肪、蝦青素、礦物質(zhì)等成分，是優(yōu)質(zhì)的食品和保健品原料。以南極磷蝦為原料開發(fā)的磷蝦油產(chǎn)品，因其具有良好的營(yíng)養(yǎng)功效而備受關(guān)注[4-5]。

南極磷蝦油富含磷脂、EPA、DHA 等多ω-3 多不飽和脂肪酸、蝦青素等多種功效成分[6]，相較于魚油，其中ω-3 多不飽和脂肪酸與磷脂形成的磷脂復(fù)合物具有更好的生物利用度和生物活性[7]，并且可以更好的促進(jìn)蝦青素等脂溶性活性物質(zhì)的吸收[8]。在營(yíng)養(yǎng)健康方面，南極磷蝦油具有心血管預(yù)防[9-10]、抗炎[11-12]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)/糖代謝[13-14]、保護(hù)神經(jīng)功能[15-16]等多種功效。2008 年磷蝦油獲得美國(guó)食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）公認(rèn)安全（Generally Recognized as Safe，GRAS）認(rèn)證，2009 年歐盟也批準(zhǔn)其作為新資源食品[6]，2013 年被中國(guó)衛(wèi)計(jì)委（現(xiàn)為國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)）批準(zhǔn)為新食品原料，2019 年4 種磷蝦油產(chǎn)品已獲得保健食品批號(hào)。磷蝦油未來極有可能獲得與魚油同等的認(rèn)可程度，具有廣闊的市場(chǎng)前景[17]。

隨著市場(chǎng)熱度的不斷提升，各類磷蝦油產(chǎn)品層出不窮，品質(zhì)差異很大，對(duì)于磷蝦油產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)的檢測(cè)需求也相應(yīng)提升。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3506-2020《磷蝦油》中對(duì)于蝦油產(chǎn)品品質(zhì)鑒定的主要指標(biāo)包括：EPA、DHA、磷脂、蝦青素、酸價(jià)等，以上檢測(cè)方法均需要專業(yè)檢測(cè)人員和設(shè)備投入，檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)成本高，極大的增加了生產(chǎn)企業(yè)的成本，因此亟需一種低成本的快速檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)南極磷蝦油多指標(biāo)檢測(cè)，以滿足產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需求。

近紅外光譜檢測(cè)方法通過化學(xué)計(jì)量學(xué)建立近紅外吸收光譜與待測(cè)成分含量間的關(guān)系模型，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)于目標(biāo)成分的快速準(zhǔn)確測(cè)定[18]，現(xiàn)已發(fā)展成為多指標(biāo)快速檢測(cè)的主要方法，在食品[19]、醫(yī)藥[20]、農(nóng)業(yè)[21]等眾多行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。在油脂產(chǎn)品定性和定量檢測(cè)方面，近紅外檢測(cè)方法也具有很好的應(yīng)用前景[22]。張瑜等[23]利用可見-近紅外檢測(cè)方法對(duì)魚油摻假進(jìn)行定量分析，通過建立偏最小二乘回歸（Partial least squares regression，PLSR）模型實(shí)現(xiàn)對(duì)對(duì)魚油摻假物含量的檢測(cè)；王楠等[24]建立了魚油中EPA 和DHA 含量的近紅外快速檢測(cè)方法，其中兩種成分的預(yù)測(cè)模型RC均達(dá)到0.94 以上。但近紅外檢測(cè)技術(shù)在磷蝦油檢測(cè)方面的應(yīng)用研究尚未見報(bào)道。本文收集了10 種不同規(guī)格的南極磷蝦油樣品，依據(jù)SC/T 3506-2020《磷蝦油》測(cè)定魚油中磷脂、EPA、DHA、蝦青素的含量及酸價(jià)，采用偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）建立近紅外檢測(cè)模型，通過多種處理方法的比較，擇優(yōu)確定最優(yōu)模型條件，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)南極磷蝦油樣品中磷脂、EPA、DHA、蝦青素含量和酸價(jià)等多指標(biāo)的快速準(zhǔn)確測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南極磷蝦油 青島南極維康生物科技有限公司提供，采樣于2018 年10 月～2019 年11 月，分別為：脫磷脂蝦油樣品1 份，標(biāo)為1 號(hào)。未經(jīng)精制處理的毛油樣品2 份，標(biāo)為2、3 號(hào)。搜集到的代表性南極磷蝦油成品樣品7 份，分別標(biāo)為4～10 號(hào)。

Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀，配備液體透射檢測(cè)模塊、RESULT M 樣品光譜采集的集成軟件以及TQ analyst 數(shù)據(jù)處理軟件 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 為提升近紅外檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度，需擴(kuò)大待測(cè)樣品的數(shù)量。不同南極磷蝦油樣品經(jīng)充分混合后可形成相同均一性的新樣品，因此將原始樣品按照等比例兩兩混勻，得到總計(jì)50 個(gè)磷蝦油樣品，使各指標(biāo)含量梯度分布更加均勻?；旌虾髽悠酚?20 ℃冰箱中密封儲(chǔ)存以待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

將于-20 ℃中取出的凝固態(tài)南極磷蝦油樣品置于40 ℃水浴中加熱至其成為可流動(dòng)的液體，將融化后樣品分為兩部分，分別進(jìn)行NIR 光譜采集和5 種成分含量的化學(xué)值測(cè)定。

1.2.2 近紅外光譜采集 液體樣品采用專用的液體透射檢測(cè)模塊采集光譜圖像。參照王楠等利用近紅外光譜技術(shù)快速測(cè)定魚油中EPA 和DHA 含量的方法對(duì)南極磷蝦油進(jìn)行檢測(cè)[24]。研究?jī)x器開始掃描工作前，開機(jī)預(yù)熱30 min。隨后將南極磷蝦油樣品倒入比色皿中，高度約為比色皿高度的四分之三，要求樣品均勻，且無明顯氣泡存在干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比色皿用擦鏡紙擦拭干凈確保無樣品殘留干擾。光譜掃描波數(shù)為10000～4000 cm-1，樣品掃描次數(shù)為4次得平均光譜。共50 個(gè)樣品，掃描完成后得到的各樣品平均光譜數(shù)據(jù)50 個(gè)，用于近紅外檢測(cè)模型的建立及驗(yàn)證。

1.2.3 化學(xué)真實(shí)值測(cè)定 樣品光譜采集完成后，依據(jù)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3506-2020《磷蝦油》對(duì)10 個(gè)初始南極磷蝦油樣品的磷脂、DHA、EPA、蝦青素和酸價(jià)進(jìn)行測(cè)定，其中磷脂采用GB/T 5537-2008 第一法鉬藍(lán)比色法測(cè)定；EPA 和DHA 采用GB 5009.168-2016 第二法中水解-提取法測(cè)定；蝦青素采用SC/T 3053-2019 高效液相色譜法測(cè)定；酸價(jià)采用GB 5009.229-2016 第二法測(cè)定。每個(gè)樣品平行測(cè)試3次，測(cè)量結(jié)果取算數(shù)平均值。

1.2.4 模型建立和驗(yàn)證 建模前，先借助軟件TQ Analyst，完成所有樣品的原始NIR 圖譜數(shù)據(jù)處理工作。采用PLS 作為建模的化學(xué)計(jì)量法，分別借助導(dǎo)數(shù)與平滑結(jié)合的6 種光譜處理技術(shù)處理所采集的光譜，確定出最佳處理手段，其中最佳光譜范圍由軟件TQ analyst 自動(dòng)推薦。

檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑u(píng)價(jià)參數(shù)包括建模相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient in calibration，RC）、校正殘差均方根（Root mean square error of calibration，RMSEC）、誤差交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient in cross validation，RCV）、交互驗(yàn)證殘差均方根（Root mean square error of cross validation，RMSECV）、交叉驗(yàn)證用樣品真實(shí)值標(biāo)準(zhǔn)差（SD）與RMSECV 的比值（The ratio of the RMSECV to standard deviation of reference data in the validation，RPDCV）、外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient in external validation，REV）、外部驗(yàn)證殘差均方根（Root mean square error of external prediction，RMSEP）以及外部驗(yàn)證用樣品真實(shí)值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）與RMSEP 的比值（The ratio of the RMSEP to standard deviation of reference data in the prediction, RPDEV）[25]。

內(nèi)部驗(yàn)證采取交叉驗(yàn)證模型來進(jìn)行，校正樣品中的每個(gè)樣品依次作為臨時(shí)驗(yàn)證樣品，除被選中的臨時(shí)驗(yàn)證樣品外的其余樣品作為建模樣品，構(gòu)成模型來對(duì)臨時(shí)驗(yàn)證樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，依次循環(huán)完所有樣品以得到交叉預(yù)測(cè)值。在50 個(gè)樣品中隨機(jī)抽取10 個(gè)樣品作為建模的外部驗(yàn)證集，40 個(gè)樣品作為建模集，并建模過程中會(huì)對(duì)造成預(yù)測(cè)模型明顯偏差的點(diǎn)位進(jìn)行剔除。本實(shí)驗(yàn)中50 個(gè)樣品的建模集合驗(yàn)證集的樣本數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦油5 種成分含量指標(biāo)描述性統(tǒng)計(jì)

表1為5 種不同成分建模集和驗(yàn)證集的樣本數(shù)、平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差以及范圍。表中數(shù)據(jù)顯示各種成分含量差值較大，建模集中磷脂、EPA、DHA、酸價(jià)和蝦青素的最大值與最小值的比值分別為3.70、2.77、3.00、20.30 和8.80，驗(yàn)證集中磷脂、EPA、DHA、酸價(jià)和蝦青素的最大值與最小值的比值分別為3.37、1.64、2.42、4.95 和3.61，符合近紅外光譜建模條件中樣品含量分布范圍廣的要求。

表1 磷蝦油樣品建模集和驗(yàn)證集樣品成分含量Table 1 Component content of krill oil samples in calibration set and validation set

2.2 光譜數(shù)據(jù)

南極磷蝦油樣品的NIR 原始光譜如圖1所示。圖譜顯示了10000～4000 cm-1范圍內(nèi)所有樣品的掃描全光譜。如圖所示，所有樣品的光譜具有基本相同的特征，表明磷蝦油近紅外吸收特性在掃描的光譜范圍內(nèi)基本相同。

圖1 南極磷蝦油樣品近紅外全光譜Fig.1 NIR spectrum of Antarctic krill oil samples

南極磷蝦油作為脂肪類物質(zhì)在8621 cm-1脂肪烴羰基C-O 伸縮振動(dòng)的四級(jí)倍頻、8258 cm-1脂肪烴亞甲基的C-H 伸縮振動(dòng)的二級(jí)倍頻、5735 cm-1甲基的C-H 的伸縮振動(dòng)和5853cm-1脂肪烴端甲基的C-H 振動(dòng)處具有顯著吸收峰；4500 cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)，體現(xiàn)為水的特征峰。

2.3 模型的建立與優(yōu)化

近紅外光譜測(cè)量過程中，經(jīng)常出現(xiàn)光譜偏移或飄移，導(dǎo)數(shù)處理可有效地消除基線和其他背景的干擾，分辨重疊峰，提高分辨率和靈敏度，常用的處理方式有光譜的一階導(dǎo)數(shù)處理（first derivation，F(xiàn)D）和二階導(dǎo)數(shù)處理（second derivation，SD）。經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)處理后的近紅外光譜見圖2 和圖3。磷蝦油的近紅外光譜經(jīng)導(dǎo)數(shù)處理后8000 cm-1范圍內(nèi)的特征吸收峰被消除，特征吸收峰集中在4000～7000 cm-1范圍內(nèi)，縮小了有效光譜范圍，提高了模型的計(jì)算速度和準(zhǔn)確性。

圖2 南極磷蝦油樣品一階導(dǎo)數(shù)處理近紅外光譜Fig.2 FD processing NIR of Antarctic krill oil sample

圖3 南極磷蝦油二階導(dǎo)數(shù)處理近紅外光譜Fig.3 SD processing NIR of Antarctic krill oil sample

平滑是最常用的降噪方法，其實(shí)質(zhì)是一種加權(quán)平均法，強(qiáng)調(diào)中心點(diǎn)的中心作用。通常的平滑方式為兩種，Savitzky-Golay 卷積平滑（SG）和Norris 平滑（N）。Savitzky-Golay 卷積平滑可以降低譜圖的數(shù)據(jù)分辨率，并平滑掉小的譜峰。Norris 平滑常用于增加被寬譜帶覆蓋的尖峰。

對(duì)南極磷蝦油的磷脂、EPA、DHA、蝦青素和酸價(jià)5 種指標(biāo)分別進(jìn)行FD、FD+SG、FD+N、SD、SD+SG 和SD+N 等6 種單一或復(fù)合方式處理，結(jié)果如表2～表6所示。

表2 南極磷蝦油磷脂近紅外光譜不同方式處理預(yù)測(cè)模型效果比較Table 2 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for phospholipid in Antarctic krill oil

表6 南極磷蝦油蝦青素近紅外光譜不同處理方式模型結(jié)果比較Table 6 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for astaxanthin in Antarctic krill oil

近紅外建模相關(guān)系數(shù)（RC）、交互驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（RCV）和外部驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（REV）值與1 越相近證明模型的精準(zhǔn)度越高；定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)分析誤差（RMSECV）、驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)分析誤差（RMSEP）越小，證明模型的擬合度越高，RMSECV 和RMSEP 越接近，證明模型的穩(wěn)定性越高。

磷蝦油中磷脂、EPA、DHA 和酸價(jià)四個(gè)指標(biāo)的原始光譜近紅外預(yù)測(cè)模型圖見圖4，其主要參數(shù)RC、REV 和RCV 均大于0.92，其中EPA 和DHA更達(dá)到0.97 以上，經(jīng)處理后四個(gè)指標(biāo)的的模型三類相關(guān)系數(shù)得到提升，都達(dá)到0.95 以上，說明近紅外檢測(cè)方法適用于這四個(gè)指標(biāo)的快速檢測(cè)，可以得到較好的預(yù)測(cè)結(jié)果。在不同的處理?xiàng)l件下，RMSECV 和RMSEP 也較為接近，說明近紅外預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)穩(wěn)定性較好。

圖4 南極磷蝦油樣品磷脂建模集以及外部驗(yàn)證Fig.4 Antarctic krill oil sample phospholipid modeling set and external verification

蝦青素的各種處理方式得到的模型預(yù)測(cè)結(jié)果均不理想，可能的主要原因，一是南極磷蝦油產(chǎn)品中蝦青素含量較低，普遍低于250 mg/kg，不適合采用近紅外檢測(cè)方法進(jìn)行定量；二是蝦青素在磷蝦油中并非單一組分，其主要以蝦青素酯形式存在，各類蝦青素酯之間存在差異，且含量較低[26-27]，在近紅外檢測(cè)條件下無法進(jìn)行統(tǒng)一定量。

表3 南極磷蝦油EPA 近紅外光譜不同方式處理預(yù)測(cè)模型效果比較Table 3 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for EPA in Antarctic krill oil

表4 南極磷蝦油DHA 近紅外光譜不同方式處理預(yù)測(cè)模型效果比較Table 4 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for DHA in Antarctic krill oil

表5 南極磷蝦油酸價(jià)近紅外光譜不同方式處理預(yù)測(cè)模型效果比較Table 5 Comparison of the effects of different optimized NIR prediction models for acid value in Antarctic krill oil

經(jīng)綜合比較，磷脂、EPA、DHA 和酸價(jià)的最優(yōu)預(yù)測(cè)模型的最佳處理方式、主成分因子數(shù)及光譜范圍如表7所示。

表7 南極磷蝦油磷脂、EPA、DHA 和酸價(jià)指標(biāo)最優(yōu)近紅外預(yù)測(cè)模型參數(shù)Table 7 Parameters of optimal NIR prediction model for phospholipid, EPA, DHA and acid value in Antarctic krill oil

磷脂、DHA 和EPA 酸價(jià)最佳處理方式略有不同，分別為：FD、FD、SD+N；酸價(jià)經(jīng)處理后，RCV 雖得到改善，但RMSECV 和RMSEP 顯著增加，故采用不經(jīng)處理的模型參數(shù)。由于蝦青素近紅外預(yù)測(cè)模型效果不好，因此未列在表中。

2.4 最優(yōu)近紅外預(yù)測(cè)模型指標(biāo)評(píng)價(jià)

本文采用偏最小二乘法建立并處理了南極磷蝦油中磷脂、EPA、DHA 和酸價(jià)的近紅外光譜預(yù)測(cè)模型，確定了最優(yōu)的模型參數(shù)，通過交互驗(yàn)證和外部驗(yàn)證，四種組分的RC、REV 和RCV 三類相關(guān)系數(shù)，除酸價(jià)的RCV 略低為0.917 外，其余均在0.95 以上，并且RMSECV 和RMSEP 值也均較小，并且較為接近，均證明預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較好。

除上述指標(biāo)外，另一個(gè)衡量預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確度的重要指標(biāo)是RPD，當(dāng)其大于2.5 時(shí)，方可表明模型具有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度。如表8 中所示，磷脂、EPA、DHA 和酸價(jià)四種指標(biāo)的RPDEV 和RPDCV 基本滿足這一指標(biāo)要求，僅有酸價(jià)的RPDCV 為2.365，略小于2.5，這可能是由于建模樣品數(shù)量仍然偏少，RESECV 偏大導(dǎo)致，可通過后續(xù)的樣品量增加來進(jìn)行改善。

表8 南極磷蝦油磷脂、EPA、DHA 和酸價(jià)最優(yōu)近紅外預(yù)測(cè)模型指標(biāo)描述Table 8 Indicators description of optimal NIR prediction model for phospholipid, EPA, DHA and acid value in Antarctic krill oil

3 結(jié)論

本研究為南極磷蝦油品質(zhì)關(guān)鍵指標(biāo)磷脂、DHA、EPA、酸價(jià)的含量近紅外模型的構(gòu)建以及快速檢測(cè)提供了理論上的依據(jù)和數(shù)據(jù)上的支持，充分驗(yàn)證了近紅外快速檢測(cè)方法在磷蝦油品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)中應(yīng)用的可行性。為進(jìn)一步提升模型的精確度，可通過擴(kuò)大對(duì)主要磷蝦油生產(chǎn)廠家的代表性樣品數(shù)量與樣品指標(biāo)范圍，構(gòu)建更精準(zhǔn)成分預(yù)測(cè)模型。此外，除本文中涉及到的5 種指標(biāo)之外，近紅外檢測(cè)方法可能還適用于脂肪酸組成和過氧化值等指標(biāo)的檢測(cè)[28-29]。

南極磷蝦油產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)包含9 項(xiàng)以上主要指標(biāo)，采用傳統(tǒng)化學(xué)檢測(cè)方法不但需要?dú)庀唷⒁合嗟却笮蛢x器設(shè)備的投入，還需要配備檢測(cè)人員并且消耗大量的檢測(cè)試劑。按照常規(guī)檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)全部指標(biāo)檢測(cè)的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)樣品檢測(cè)至少需要收費(fèi)千元以上。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，近紅外快速檢測(cè)方法無需配備專業(yè)的人員，不需消耗試劑，僅需通過簡(jiǎn)單處理即可完成對(duì)南極磷蝦油中的主要指標(biāo)的檢測(cè)分析，可極大的提高檢測(cè)效率，降低檢測(cè)成本，隨著近年來便攜式近紅外設(shè)備的不斷發(fā)展[30]，在磷蝦油產(chǎn)品生產(chǎn)與流通環(huán)節(jié)其均可作為有效的檢測(cè)手段。進(jìn)一步，通過對(duì)于檢測(cè)方法的持續(xù)優(yōu)化，有望實(shí)現(xiàn)磷蝦油加工過程中的在線品質(zhì)監(jiān)控，對(duì)于提高生產(chǎn)效率和提升磷蝦油產(chǎn)品品質(zhì)具有積極作用。