馬志珺,王克華，任風(fēng)芝 ,王 月，張 麗,李曉露*,張雪霞*

(1.微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心 華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 052165；2.華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司，河北 石家莊 052165)

伊維菌素作為一種新型抗寄生蟲藥物，具有廣譜、高效、低毒等特點(diǎn)，對(duì)線蟲、節(jié)肢動(dòng)物及其它體內(nèi)外寄生蟲的驅(qū)殺作用均良好，應(yīng)用于豬、羊、馬、牛的胃腸道線蟲、肺線蟲的治療以及心絲蟲、疥螨等的防治[1-4]。

伊維菌素(H2B1a，圖1)為十六元環(huán)結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過在阿維菌素B1a的C22、C23位上的雙鍵加氫還原而成，比阿維菌素結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、安全性更高、持效期更長(zhǎng)[5-6]，在國內(nèi)外市場(chǎng)上具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

圖1 伊維菌素的結(jié)構(gòu)式

藥物雜質(zhì)是反映藥物質(zhì)量的重要指標(biāo)，藥物雜質(zhì)能否被合理、有效地控制，將直接影響藥物質(zhì)量可控性及使用安全性。強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)屬于藥物穩(wěn)定性研究?jī)?nèi)容之一，有助于揭示藥物的穩(wěn)定性和可能降解途徑，對(duì)藥物的質(zhì)量控制有重要意義。為了更好地控制伊維菌素質(zhì)量，滿足高端客戶需求，作者將伊維菌素原粉在含有H2O2的甲醇溶液中進(jìn)行加速降解，得到伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品，利用色譜純化技術(shù)對(duì)伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品進(jìn)行分離純化，并運(yùn)用MS、NMR分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為伊維菌素的質(zhì)量控制和安全性評(píng)價(jià)提供保障。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

伊維菌素(純度99.1%)，自制；乙腈、甲醇，色譜級(jí)，美國Merck公司；乙腈、甲醇，工業(yè)級(jí)，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；純化水，自制；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

分析型液相色譜儀，日本島津公司；制備型液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司；T-1000型電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；Acquity UPLC系統(tǒng)、Xevo TQ MS/MS檢測(cè)器，Waters公司；AVANCEⅢ-500型核磁共振波譜儀，Bruker公司；Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Heidolph公司。

1.2 伊維菌素的加速降解

取伊維菌素原粉10 g，用500 mL 80%甲醇溶液溶解，加入10 mL H2O2，搖勻后，于25 ℃下進(jìn)行氧化降解反應(yīng)，定期檢測(cè)反應(yīng)液，當(dāng)反應(yīng)液中目標(biāo)雜質(zhì)達(dá)到一定比例時(shí)，將反應(yīng)液減壓濃縮、干燥，得到伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品。

1.3 伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的分離純化

將伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品用甲醇溶解，經(jīng)中壓柱(UniSil C18,20 μm,200 mL)進(jìn)行層析分離，洗脫劑為甲醇-水(70∶30，體積比，下同)，流速為10 mL·min-1，根據(jù)洗脫峰分段收集洗脫液，HPLC在線檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，收集目標(biāo)雜質(zhì)純度大于70%的洗脫液，減壓濃縮至干，得到高比例的氧化降解雜質(zhì)粗品。

將高比例的氧化降解雜質(zhì)粗品用制備型液相色譜儀經(jīng)中高壓色譜純化技術(shù)進(jìn)一步純化，按色譜峰收集目標(biāo)餾分，將純度大于95%的餾分合并，50 ℃下減壓濃縮去除溶劑，得到2.1 g伊維菌素氧化降解雜質(zhì)純品。

1.4 檢測(cè)條件

制備色譜條件：UniSil C18柱(30 mm × 250 mm，10 μm)，洗脫劑為乙腈-甲醇-水(50∶15∶35)，流速16 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正、負(fù)離子檢測(cè)，離子源溫度為150 ℃，電離電壓為3.0 kV，電噴霧接口干燥氣(N2)流速為600 L·h-1，錐孔電壓為30 V，脫溶劑氣溫度為350 ℃。

核磁共振條件：樣品用CD3OD溶解。

2 結(jié)果與討論

2.1 加速降解條件選擇

在伊維菌素加速降解過程中發(fā)現(xiàn)，伊維菌素的氧化降解程度與H2O2加量、反應(yīng)時(shí)間呈正相關(guān)，但過量的H2O2會(huì)使反應(yīng)劇烈，生成多個(gè)降解產(chǎn)物，致使目標(biāo)雜質(zhì)分離純化難度加大。綜合考慮，選擇H2O2加量為2%，HPLC檢測(cè)目標(biāo)雜質(zhì)比例達(dá)到10%為反應(yīng)終點(diǎn)。伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品和純品的HPLC圖譜見圖2。

圖2 伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品(a)和純品(b)的HPLC圖譜

2.2 伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 質(zhì)譜分析(圖3)

圖3 伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的質(zhì)譜圖

2.2.2 核磁共振波譜分析

伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的13CNMR、1HNMR數(shù)據(jù)見表1。

表1 伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的13CNMR、1HNMR數(shù)據(jù)

2.2.3 結(jié)構(gòu)解析

由ESI+準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z906[M+NH4]+；由ESI-準(zhǔn)分子離子峰圖譜得到m/z887[M-H]-。推測(cè)伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為888，比伊維菌素的相對(duì)分子質(zhì)量多14。參照文獻(xiàn)[7-8]對(duì)NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該雜質(zhì)C8a位由亞甲基變成了羰基，推測(cè)其分子式為C48H72O15。

綜上，確定該氧化降解雜質(zhì)為8a-oxo-H2B1a，其結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖4 伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

伊維菌素原粉在含有H2O2的甲醇溶液中進(jìn)行加速降解，得到伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品，利用色譜純化技術(shù)對(duì)伊維菌素氧化降解雜質(zhì)粗品進(jìn)行分離純化，并運(yùn)用MS、NMR分析鑒定其結(jié)構(gòu)，確定該氧化降解雜質(zhì)為8a-oxo-H2B1a。該研究開發(fā)了一種制備伊維菌素氧化降解雜質(zhì)的有效方法，揭示了雜質(zhì)的來源、結(jié)構(gòu)及控制方法，為伊維菌素的質(zhì)量控制和安全性評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。