柳利利，張成仁，郝相勇，田宏偉，鄧淵，李雄，蔣智良，郭天康

（1.甘肅中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，甘肅蘭州 730030；2.甘肅省人民醫(yī)院普通外科，甘肅蘭州 730030；3.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，寧夏銀川 750000）

2020年全球癌癥統(tǒng)計報告[1]顯示肝癌為全球六大常見癌癥之一，在世界癌癥相關(guān)病死率中居第3 位，每年約有90.6 萬新發(fā)病例和83 萬死亡病例。原發(fā)性肝癌主要為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）（占75%～85%），其主要危險因素包括病毒感染、吸煙、肥胖、大量飲酒、2 型糖尿病以及食用黃曲霉毒素污染的食物等[2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進步，早期HCC 患者的生存率雖有所提高，但晚期腫瘤患者的5年生存率仍不足16%[3]。因此，眾多的研究者致力于提高晚期HCC 患者生存率的研究，經(jīng)過多年的臨床實踐發(fā)現(xiàn)晚期HCC 患者的生存率僅依靠單一的放化療在當前階段很難取得突破性的進展。隨著腫瘤生物學和腫瘤免疫學基礎(chǔ)理論的發(fā)展，腫瘤免疫治療和化療的聯(lián)合使用在多種腫瘤中取得了較單一療法更優(yōu)的臨床療效。免疫治療與化療的聯(lián)合不僅能逆轉(zhuǎn)腫瘤晚期導致的免疫抑制，提高腫瘤抗原的交叉提呈作用，增強殺傷性T 細胞的抗腫瘤效應，還能一定程度上減少化療帶來的毒副作用以及降低腫瘤細胞耐藥性[4-6]。

近年來，腫瘤免疫治療研究較為深入的當屬程序性細胞死亡受體1（programmed death 1，PD-1）及其配體（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）。PD-1 是表達于免疫細胞上的表面蛋白，可為免疫反應提供抑制信號，當與腫瘤細胞上的配體PD-L1結(jié)合時可發(fā)生免疫抑制，從而使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。抗PD-1/PD-L1 治療的基本機制是依靠免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）阻斷PD-1 與PD-L1 的結(jié)合，恢復機體的抗腫瘤免疫，從而達到抗腫瘤效應[7-11]。然而，大量的臨床試驗發(fā)現(xiàn)大約只有10%～30%的HCC 患者才能在抗PD-1/PD-L1 的治療中獲益[12-13]。因此，精確篩選出抗PD-1/PD-L1 治療的獲益人群成為當前一大難題。生物標志物則是免疫治療的重大突破，不僅可以篩選出免疫治療的獲益人群，還能夠避免無效治療及其毒副反應。因此，本文通過大量閱讀近期文獻，對HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療下新近出現(xiàn)的生物標志物的研究現(xiàn)狀做一綜述，以期為臨床診療提供幫助。

1 組織生物標志物

1.1 PD-1/PD-L1

PD-L1 也稱為表面抗原分化簇274 或B7 同源體，是由CD274 基因編碼的人類體內(nèi)的一種蛋白質(zhì)。一般來說，PD-L1 在腫瘤細胞中的表達水平越高，患者的生存預后越好，此觀點已在多種腫瘤中得到證實[14]。Zhu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)帕博利珠單抗（PD-1 單抗）治療HCC 患者后，PD-L1 在多種類型細胞中的組合表達評分（combined proportion score，CPS） 陽性率≥1% 組的客觀緩解率（objective response rate， ORR） 為25%， 無進展生存期（progression-free survival，PFS） 延長的病例比例高達83%，而單純腫瘤表達評分（tumor proportion score，TPS）和治療反應沒有相關(guān)性。另有研究[16]對納武利尤單抗（PD-1 單抗）治療的HCC 患者進行免疫組化檢測后發(fā)現(xiàn)，PD-L1 陽性率≥1%/TPS 組和PD-L1 陽性率<1%/TPS 組的中位總生存期（overall survival，OS）分別為28.1 個月和16.6 個月。此外，一項全球多中心試驗[17]結(jié)果顯示，替雷利珠單抗（PD-1 單抗） 治療HCC 患者后PD-L1 陽性率≥1% 組ORR 達到23.1%，疾病控制率（disease control rate，DCR）達到57.7%。

然而，Liu 等[18]的研究卻發(fā)現(xiàn)PD-L1 的表達與患者的OS 以及無病生存時間（disease free survival，DFS）呈負相關(guān)。一項I/II 期臨床試驗[19]中發(fā)現(xiàn)PDL1 陽性率<10%/TPS 組ORR 達到19%，DCR 達到63%，而在PD-L1 陽性率≥10%/TPS 組ORR 和DCR均為0。此外，有研究者[20]發(fā)現(xiàn)細胞缺氧可以刺激CXCL12 的基因表達，同時PD-L1 的表達也有所上升，該研究認為CXCL12 陰性以及PD-L1 高表達的HCC 患者腫瘤的預后可能不佳。表1 總結(jié)了近年來HCC 患者免疫治療下以PD-1/PD-L1 作為生物標記物的研究。由于不同研究中PD-L1 的檢測存在免疫組化評分的主觀性、瘤內(nèi)異質(zhì)性、抗體多樣性以及缺乏統(tǒng)一的臨界值標準等問題，因而得出的結(jié)論也各不一致[21]。因此，在HCC 患者抗PD-1/PD-L1治療中如何統(tǒng)計PD-1/PD-L1 的表達水平以及選擇哪種檢測方法、PD-1/PD-L1 陽性率的最佳截斷值以及PD-L1 表達的異質(zhì)性對其預測能力的影響等問題都是未來深入研究的重點[22]。

表1 PD-1/PD-L1預測HCC患者免疫治療療效的研究Table 1 Studies on the efficacy of immunotherapy for HCC patients predicted by PD-1/PD-L1

1.2 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）與錯配修復功能缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）

MSI 是指DNA 復制時插入或缺失突變引起的微衛(wèi)星序列長度改變的現(xiàn)象，常由dMMR 引起[33]。MSI 現(xiàn)象于1993年在結(jié)直腸癌中首次發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)MSI 現(xiàn)象不止存在于結(jié)直腸癌，在包括肝癌在內(nèi)的其他實體瘤中均有發(fā)生[34-35]。一般來說，腫瘤細胞的MSI 表達水平越高，患者的總體生存越好，并且高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability-high，MSI-H） 的腫瘤患者應用PD-1 抑制劑的應答率要優(yōu)于低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability-low，MSI-L）的腫瘤患者，這個觀點已在多種腫瘤中被證實[36]。帕博利珠單抗目前已獲批用于MSI-H/dMMR 的實體瘤，這也是美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）首次基于分子標志物而非腫瘤組織來源批準的藥物。因此，腫瘤患者的MSIH/dMMR 狀態(tài)及其相關(guān)分子的變化對腫瘤的評估具有重要的意義。然而，有研究[37]卻發(fā)現(xiàn)在HCC 中MSI-H 患者的比例僅占3.03%。因此，目前缺乏足夠證據(jù)證明MSI-H/dMMR 在預測HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療療效中的地位。

1.3 腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）

TMB 是指蛋白編碼區(qū)非同義突變分布的密度。眾所周知，腫瘤的發(fā)生是由于基因突變引起的，一般情況下人體的免疫系統(tǒng)可通過識別突變細胞表達的抗原從而對其進行清除，但部分腫瘤細胞由于腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)以及抗原的異常表達，導致機體無法識別這些抗原從而發(fā)生免疫逃逸，發(fā)生免疫逃逸的腫瘤細胞繼續(xù)分裂生長則形成腫瘤[38]。目前TMB 專指蛋白編碼區(qū)的非同義突變，因為只有突變的TMB 才有可能使腫瘤細胞產(chǎn)生新抗原。腫瘤患者的TMB 越高，新抗原的種類及數(shù)量越多，被免疫系統(tǒng)識別的概率越高，從而ICIs 激活機體自身的抗腫瘤免疫應答后，殺傷這些腫瘤細胞的概率就越大[39-40]。HCC 的TMB 相對于其他腫瘤基因組呈現(xiàn)出較高的水平，且有研究證實中國HCC 患者的TMB 強度在所有腫瘤中居第5 位，大約為30～150 mut/MB[41]。 此外， 歐洲腫瘤醫(yī)學會（European Society for Medical Oncology， ESMO） 在2019年發(fā)布的一項共識[42]中推薦對實體瘤患者進行TMB 檢測，但TMB 檢測對腫瘤樣本要求極高，檢測周期漫長，價格頗為昂貴，且無統(tǒng)一的檢測方法及其截斷值。因此，TMB 用于預測HCC 患者的免疫治療療效仍有很長的路走。

1.4 拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）

CNV 是由基因組發(fā)生重排而導致的，一般指長度1 kb 以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復[43]。Pinyol 等[44]的研究發(fā)現(xiàn)抗PD-1/PD-L1 治療過程中低負荷CNV 的HCC 患者腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤水平以及炎性細胞反應水平相對更高，而高負荷CNV 的患者存在免疫排斥現(xiàn)象。因此，CNV 有潛力成為HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療的預測性生物標志物。

1.5 懶氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶2D（KMT2D）

KMT2D 屬于哺乳動物H3K4 甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員，在成人組織中廣泛表達，對于早期胚胎的發(fā)育有著重要的作用，KMT2D 在調(diào)節(jié)細胞發(fā)育、分化、新陳代謝和腫瘤抑制方面具有重要作用，是癌癥患者最常發(fā)生突變的基因之一，KMT2D 丟失導致DNA 損傷和突變增加、染色質(zhì)重塑、內(nèi)含子保留和轉(zhuǎn)座因子激活[45]。有研究[46]發(fā)現(xiàn)KMT2D 突變的HCC 患者免疫浸潤增加，KMT2D 突變可能通過增強腫瘤免疫原性使腫瘤細胞對ICIs 敏感性增加。

1.6 DNA 聚合酶ε（polymerase epsilon，POLE）和DNA聚合酶δ1（POLD1）

POLE 和POLD1 在維持DNA 復制保真度和防止突變方面至關(guān)重要。POLE/POLD1 突變是非常有潛力的免疫治療的獨立生物標志物，且不限癌種，與ICIs 的臨床療效密切相關(guān)[47]。Wang 等[10]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在接受抗PD-1/PD-L1 治療的實體瘤患者中，攜帶POLE/POLD1 突變的患者中位OS 顯著優(yōu)于未攜帶者（34 個月vs.18 個月）。該研究還發(fā)現(xiàn)那些通常認為無法獲益于免疫治療的微衛(wèi)星穩(wěn)定的患者如果伴隨POLE/POLD1 基因突變也能獲益于免疫治療。因此，POLE/POLD1 突變可作為預測免疫治療獲益的全新獨立指標。

2 循環(huán)生物標志物

2.1 循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctD‐NA）

液體活檢不僅克服了組織活檢的局限性，還為尋找HCC 患者免疫治療療效的預測性生物標志物提供了方向[48]。ctDNA 是一種特征性的腫瘤生物標志物，腫瘤細胞在進行分裂增殖過程中會凋亡或壞死破裂從而掉落DNA 片段，這些片段釋放入血后使用一定的檢測手段可以檢測出來，這意味著可以通過檢測ctDNA 來發(fā)現(xiàn)腫瘤的存在，對于腫瘤的早期診斷、用藥方案的制定和預后觀察都很有意義[49]。Jin 等[50]研究顯示血液中存在和不存在ctDNA 的HCC 患者其中位PFS 分別為4.9 個月和7.4 個月。而在另一項隨機對照試驗[51]中，研究者發(fā)現(xiàn)ctDNA（+）的HCC 患者使用阿替利珠單抗（PD-L1 單抗）治療后的DFS 和OS 優(yōu)于ctDNA（-）的患者。雖然目前還沒有任何一種以檢測ctDNA 來診斷早期癌癥的方法得到美國FDA 批準，但其未來的潛力值得期待。

2.2 腫瘤浸潤淋巴細胞

肝臟是人體最大的免疫器官，長時間與外源性抗原發(fā)生應答，形成了復雜的免疫微環(huán)境[4,50]。既往多項研究[16,51]發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞與HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療后OS 成正相關(guān)。腫瘤免疫微環(huán)境中CD8+T 細胞的含量越高，HCC 患者抗PD-1/PD-L1治療的效果越好[26,32,52]。Chen 等[53]研究發(fā)現(xiàn)HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療后CD8+/CD4+T 細胞比率升高，并且ORR 較高的患者治療前CD8+T 細胞的數(shù)量也更多。與此類似的一項研究[54]表明，使用PD-1 單抗治療HCC 達到病情穩(wěn)定的患者和治療無效的患者相比，CD4+和CD8+T 細胞的聚集更高，提示CD4+和CD8+T 細胞高浸潤的患者抗PD-1/PD-L1 治療的反應更好。此外，Zhang 等[55]的研究發(fā)現(xiàn)PD-L1單抗聯(lián)合紫杉醇治療HCC 患者呈現(xiàn)高反應時，患者腫瘤微環(huán)境中CD8-CXCL13 和CD4-CXCL13 呈現(xiàn)出高表達，而對免疫治療無反應的患者腫瘤微環(huán)境中幾乎檢測不到CXCL13+T 細胞，提示高基線水平的CD8-CXCL13 和CD4-CXCL13 對免疫治療更加敏感。但腫瘤浸潤淋巴細胞作為HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療療效的預測性生物標志物同樣存在檢測樣本要求高、分析方法復雜、缺乏標準化的檢測平臺等問題，仍需繼續(xù)研究。

2.3 嗜酸性粒細胞

目前嗜酸性粒細胞在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用日益得到重視，并有研究[6]提示其變化水平可能與免疫治療的療效存在一定相關(guān)性。有研究[56]回顧性分析了抗PD-1 治療的33 例晚期惡性實體腫瘤患者，結(jié)果顯示在抗PD-1 治療獲得明顯緩解的腫瘤患者中，治療2 周期后外周血嗜酸性粒細胞的比例顯著性升高，平均升高水平為基線的3.5 倍，嗜酸性粒細胞比例升高患者與非升高患者的中位PFS分別為12 個月和2 個月，中位OS 分別為15 個月和7 個月，提示嗜酸性粒細胞也有潛力成為HCC 患者抗PD-1 治療療效的預測性生物標志物。

2.4 外周血炎癥指標

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與炎癥密切相關(guān)，炎癥可促進癌細胞增殖、血管生成以及腫瘤侵襲，并且對一些抗癌藥物的療效也有一定程度的影響[57]。檢測炎癥因子有可能預測腫瘤的復發(fā)和預后，如中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、單核細胞與淋巴細胞比值（monocyte to lymphocyte ratio，MLR） 以及血小板與淋巴細胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）等外周血炎癥指標，很可能成為新一代重要的腫瘤生物標志物[58]。Qin 等[16]研究發(fā)現(xiàn)在接受PD-1 單抗治療的HCC 患者中，NLR<5 的患者OS 明顯改善。目前已有研究[59]證實MLR、NLR、PLR 在其他實體瘤（如胃癌，結(jié)直腸癌）中與患者的DCR 顯著相關(guān)，并且MLR 是PFS 和OS 的獨立影響因素。但目前關(guān)于上述炎癥指標預測HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療療效的研究極少，需要后續(xù)加以驗證。

3 其他的預測指標或方法

3.1 腸道微生物

腸道菌群是否會影響肝膽系統(tǒng)惡性腫瘤免疫治療的應答目前沒有統(tǒng)一的定論。Zheng 等[60]在研究中發(fā)現(xiàn)HCC 患者抗PD-1 治療前的腸道菌群與健康人的基本一致，但經(jīng)抗PD-1 治療后大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌的數(shù)量顯著增加，其他菌群也發(fā)生了明顯變化。腸道微生物群的動態(tài)變化不僅可以對HCC 患者的免疫治療進行早期預測，還對免疫治療有一定的增效作用[61]。此外，有研究者[62]對65 例接受抗PD-1 治療的晚期HCC 患者的腸道菌群進行研究，發(fā)現(xiàn)螺旋菌GAM79 以及擬桿菌富集的患者PFS 和OS 顯著增加，而韋榮氏菌科富集的患者PFS 和OS 則較短。

3.2 預測模型

隨著腫瘤免疫治療逐漸趨于個體化，建立可以多方位評估患者疾病的預測模型是必然趨勢，目前已有相關(guān)學者進行了此類的研究。Wang 等[63]通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫免疫相關(guān)基因，構(gòu)建了HCC免疫治療的預測模型。 Zhang 等[64]以PDSS1、CDCA8 和SLC7A11 等缺氧相關(guān)基因構(gòu)建出了HCC患者免疫治療的預后、復發(fā)和診斷模型，該研究認為缺氧相關(guān)基因可以正向調(diào)節(jié)免疫反應，是HCC 診斷、預后和復發(fā)的潛在預測性生物標志物，可為患者的個性化治療提供了免疫學視角。此外，有研究[65]以5 個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因構(gòu)建了預測HCC 患者免疫治療的預后模型，該模型在HCC 患者的風險分層和總生存預測方面具有很高的臨床應用潛力。

4 小結(jié)與展望

近年來，腫瘤免疫治療的蓬勃發(fā)展加之精準診療的理念逐漸深入人心，為晚期HCC 患者帶來了新的希望。本文綜合以往的研究以及最新發(fā)現(xiàn)，選取了當前或未來階段有潛力成為HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療療效的預測指標，以組織生物標志物 （PD-1/PD-L1、 MSI-H/dMMR、 TMB、 CNV、KMT2D、POLE/POLD1 突變）、循環(huán)生物標志物（ctDNA、腫瘤浸潤淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、外周血炎癥指標）和其他預測指標或方法（腸道微生物、預測模型）進行分類闡述。但當前HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療療效預測和評價的多數(shù)研究尚未完善，并且缺乏標準化的生物標志物檢測程序以及統(tǒng)一化的腫瘤療效評價方法，極大地限制了眾多有潛力的生物標志物的臨床應用。因此，就目前階段而言，盡管組織活檢過程有創(chuàng)且復雜，并且也難以動態(tài)地監(jiān)測，但其仍是不可缺少的一環(huán)。隨著組學技術(shù)的迅速發(fā)展，未來多時間段的液體活檢可能會成為主流。此外，單一生物標記物的敏感性和特異性不足，使其難以作為單獨的生物標記物，多種生物標記物的聯(lián)合可能更有利于預測HCC 患者免疫治療的療效。筆者認為，未來不僅需要大量的研究對上述生物標記物加以反復驗證，還需要制定標準化的療效評價策略，統(tǒng)一化的分子測量方法以及解決瘤內(nèi)異質(zhì)性和外部有效性等問題。此外，在人工智能迅速發(fā)展和醫(yī)學理論以及技術(shù)不斷成熟的背景下，開發(fā)更加精準的預測HCC 患者抗PD-1/PD-L1 治療療效的工具，對HCC 的個體化免疫治療具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。