陶香林，吳歡，孫恩濤，葉長(zhǎng)江，文育鋒

（1.皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院）

結(jié)核分枝桿菌耐藥已成為結(jié)核病防控的重大挑戰(zhàn)［1］。因結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁的多肽多糖層周?chē)写罅康姆种幔粌H阻止抗菌藥物等進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌內(nèi)，還能幫助結(jié)核分枝桿菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別［2-3］。因此，參與合成分枝菌酸的酶已成為治療耐藥性結(jié)核病的有效藥物靶點(diǎn)。在這些酶中，S-腺苷蛋氨酸依賴甲基轉(zhuǎn)移酶（SAM-MTs）被證明對(duì)分枝菌酸的合成和化學(xué)修飾起重要作用［4-5］。SAM-MTs是甲基轉(zhuǎn)移酶家族的一種［6］，參與細(xì)胞壁內(nèi)氨基酸、脂肪等物質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)化。有研究表明，SAM-MTs能在分枝菌酸的特定位置引入關(guān)鍵的化學(xué)修飾，這對(duì)結(jié)核分枝桿菌的毒力和細(xì)胞壁通透性至關(guān)重要。編碼SAM-MTs中間體的基因失活會(huì)抑制分枝菌酸的合成［7-8］。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv株中至少有12個(gè)基因編碼SAM-MTs，Rv1729c基因是其中之一。此外，已有研究表明Rv1729c基因可能與異煙肼耐藥相關(guān)［9］，但其具體機(jī)制和功能仍未明確。本研究對(duì)Rv1729c基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究，以探索結(jié)核分枝桿菌耐藥的潛在靶點(diǎn)。擴(kuò)增、克隆并表達(dá)Rv1729c基因，并利用生物信息學(xué)工具對(duì)Rv1729c基因的生物學(xué)特性進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株由江蘇省疾病控制中心慢性傳染病防治所惠贈(zèng)。感受態(tài)的大腸桿菌DH5α和BL21購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司，pET28a和pMD-19T質(zhì)粒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑 2×Taq Master Mix、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司。

1.3 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提取 用接種環(huán)刮取少量H37Rv菌株培養(yǎng)菌苔，在磨菌管中將其磨碎，加入500 μl STE（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）溶液重懸菌液。100℃煮沸30 min滅活菌體。12 000 r/min離心20 min，沉淀重懸于 500 μl TE緩沖液（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中。加入蛋白酶K至終濃度0.5 mg/ml，10%SDS溶液至終濃度0.5%，56℃孵育1 h。加入等體積的Tris-Cl飽和酚，輕輕上下顛倒混勻約5 min，以使蛋白充分變性，12 000 r/min離心5 min，取上清。小心吸取上清至另一干凈1.5 ml離心管，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），12 000 r/min離心5 min，取上清。重復(fù)本步驟，直至分界面幾乎看不到白色的蛋白層為止。小心吸取上清至另一干凈1.5 ml離心管，加入2倍體積的無(wú)水乙醇、1/10倍體積的3mmol/LNaAC（pH5.2）溶液，充分混勻，于-20℃放置約1～2 h沉淀DNA，12 000 r/min離心20 min。小心倒棄上清，沉淀用500 μl 70%乙醇離心洗滌2次，置于超凈臺(tái)上室溫吹干，最后將其溶解于200 μl含有RNA酶的TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆茫?0］。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank中H37Rv的Rv1729c基因編碼序列，長(zhǎng)度為939 bp。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-ATTCTCGAGCGGTGAAATGGAAGAGTG-3′，下 游 引 物 ：5′-ATAGAATTCGACGACGACAACTGGGAT-3′，分別插入Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 目的基因PCR擴(kuò)增 以H37Rv基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系（50 μl）：無(wú)菌雙蒸水 22 μl，2×Taq Master Mix 25 μl，上、下游引物各1 μl，DNA模板1 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 克隆載體的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物純化回收與克隆載體pMD-19T經(jīng)Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。按照1∶3的比例用T4連接酶16℃過(guò)夜連接，并設(shè)立對(duì)照組。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，采用質(zhì)粒的快速抽提方法及酶切篩選鑒定重組子。挑取單克隆送寶生物工程（大連）有限公司公司測(cè)序，通過(guò)NCBI上的Blast進(jìn)行比對(duì)分析。

1.7 Rv1729c基因的表達(dá)和純化 重組質(zhì)粒pET-28a-Rv1729c轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。重組體在含50 μg/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上篩選。采用不同濃度的IPTG（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L）、不同誘導(dǎo)時(shí)間 （1、2、3、4、5、6、7、8 h）和不同溫度（20、24、28、32、36、40、44℃）誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。提取蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察蛋白條帶。

細(xì)胞裂解液過(guò)HisPur?Ni-NTA柱，蛋白用15 ml洗脫液洗脫（50 mmol Tris，200 mmol NaCl，500 mmol咪唑），小心吸取上清液進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.8 Rv1729c基因編碼SAM-MTs的生物信息學(xué)分析 用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)Expasy中的在線工具Protparam對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、分子式、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析；用ProtScale對(duì)分析蛋白的親（疏）水性。用Signal P 4.1 Server信號(hào)肽分析服務(wù)器預(yù)測(cè)信號(hào)肽及位置；應(yīng)用TMHMM Server v.2.0分析蛋白跨膜區(qū)螺旋；用SSPro：Secondary Structure服務(wù)器預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Motif Scan分析蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)。將蛋白序列提交至蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)EXPASYP Proteomic三級(jí)結(jié)構(gòu)模型組裝軟件SWISS-MODEL模擬蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)［11-14］。利用ABCpred預(yù)測(cè)SAM-MTs蛋白的B細(xì)胞抗原表位；HLA-A*0201限制性CTL細(xì)胞表位采用IEDB和NetMHC 4.0 Server來(lái)預(yù)測(cè)［15-16］。

2 結(jié)果

2.1 Rv1729c基因的擴(kuò)增、克隆及序列分析Rv1729c基因經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小與預(yù)計(jì)相符，約923 bp（圖1A）。將PCR產(chǎn)物克隆于pMD-19T中（圖1B）和pET-28a質(zhì)粒中（圖1C），挑選經(jīng)酶切鑒定正確的克隆，經(jīng)正反向全自動(dòng)序列分析顯示，Rv1729c基因的GC含量為62.73%，起始密碼子和終止密碼子分別為GTG和UGA，所得序列結(jié)果通過(guò)NCBI的Blast進(jìn)行比對(duì)分析，與MTB標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸同源性為100.00%，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv株全基因組中位于1954631～1955569。

2.2 Rv1729c基因編碼的SAM-MTs蛋白的表達(dá) 重組質(zhì)粒pET-28a-Rv1729c轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。SDS-PAGE顯示SAMMTs蛋白成功表達(dá)，分子量約35 kDa。在不同的誘導(dǎo)時(shí)間、不同的IPTG濃度和不同的溫度下誘導(dǎo)蛋白，確定最佳誘導(dǎo)條件：IPTG的濃度為0.4 mmol/L，時(shí)間為7 h，溫度為20℃，見(jiàn)圖2、3、4。

圖3 不同的誘導(dǎo)時(shí)間下SAM-MTs（Rv1729c）蛋白表達(dá)情況

2.3 SAM-MTs（Rv1729c）蛋白用Ni-NTA樹(shù)脂親和層析成功純化 純化結(jié)果顯示目的蛋白為分子量約35 kDa的可溶性蛋白（圖5A）。在NC膜上檢測(cè)到一條35 kDa分子量的強(qiáng)條帶，對(duì)相同樣品進(jìn)行Western blot分析，證實(shí)所觀察到的蛋白條帶與特異性抗體發(fā)生了反應(yīng)（圖5B）。

2.4 Rv1729c基因編碼SAM-MTs的生物信息學(xué)分析

2.4.1 SAM-MTs的理化性質(zhì) Rv1729c基因編碼SAM-MTs由312個(gè)氨基酸組成，其中含量最多的氨基酸為Ala和Leu，分別占13.8%和9.6%。該蛋白理論相對(duì)分子量為33 654（33.654 ku），原子總數(shù)4 722，分子式為C1496H2352N408O457S9，理論等電點(diǎn)4.75，帶負(fù)電荷氨基酸殘基（Ala+Glu）總數(shù)為39，帶正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為28，脂溶性系數(shù)91.41，半衰期30 h。不穩(wěn)定指數(shù)31.41，低于閾值40，分類(lèi)為穩(wěn)定蛋白。利用ProtScale對(duì)蛋白的親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，疏水性平均得分-0.006（正值和負(fù)值分別代表疏水性和親水性）（圖6），為親水性蛋白。利用在線軟件SignaIP 4.1預(yù)測(cè)氨基酸的序列中無(wú)信號(hào)肽。運(yùn)用TMHMM server v.2.0軟件分析SAM-MTs位于細(xì)胞膜表面，不是跨膜蛋白。

圖6 Rv1729c基因編碼的SAM-MTs蛋白的親（疏）水性

2.4.2 SAM-MTs的二級(jí)結(jié)構(gòu) 利用在線分析軟件，在線提交Rv1729c基因編碼SAM-MTs的氨基酸序列后，分析得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中無(wú)規(guī)則卷曲（C）148個(gè)（占47.4%），α螺旋（H）127個(gè)（占40.7%），β折疊（E）37個(gè)（占11.9%）（圖7），提示該蛋白和螺旋無(wú)規(guī)則卷曲含量高，結(jié)構(gòu)較松散。

圖7 Rv1729c基因編碼SAM-MT的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.4.3 SAM-MTs的翻譯后修飾位點(diǎn) 經(jīng)Motif Scan分析，Rv1729c基因編碼的SAM-MTs共有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（95～98、01～204），6個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（4～7、66～69、109～112、141～144、271～274、279～282），4個(gè)酰基化位點(diǎn)（16～21、146～151、209～214、269～274）。

2.4.4 SAM-MTs的三級(jí)結(jié)構(gòu) 利用SWISS-MODEL模擬Rv1729c基因編碼SAM-MTs的三級(jí)結(jié)構(gòu)，9～297為氨基酸序列與putative S-adenosyl-l-methionine-dependent methyltransferase ML2640能夠進(jìn)行同源建模。

2.4.5 B細(xì)胞抗原表位 通過(guò)ABCpred server預(yù)測(cè)SAM-MTs的B細(xì)胞抗原表位為18～33、24～39、34～49、 55～70、 116～131、 126～141、 149～164、228～243、 245～260、 268～283、 283～298 和 290～305等，其中最具優(yōu)勢(shì)的5個(gè)抗原表位（臨界值為0.85），見(jiàn)表1。

2.4.6 T細(xì)胞抗原表位 通過(guò)NetMHC和IEDB在線的HLA-A*0201對(duì)SAM-MTs蛋白預(yù)測(cè)分析，得到限制性CTL細(xì)胞8個(gè)優(yōu)勢(shì)表位（百分比排名＞90%） 為 32～40、 94～102、 122～130、 136～144、149～157、224～232、258～266和272～280，見(jiàn)表2。

3 討論

Rv1729c是編碼SAM-MTs的基因之一，參與了分枝菌酸修飾，但其具體功能和機(jī)制尚未被研究。有研究表明，敲除SAM-MTs編碼基因可抑制分枝菌酸的合成，從而降低細(xì)胞壁對(duì)藥物的通透性［4，17］。此外，Rv1729c基因被認(rèn)為與結(jié)核分枝桿菌耐異煙肼有關(guān)［7，9］。

本研究成功擴(kuò)增H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株Rv1729c基因并克隆表達(dá)。該蛋白誘導(dǎo)表達(dá)IPTG的最佳濃度為0.4 mmol/L，最佳表達(dá)時(shí)間為7 h，溫度為20℃。Western blot鑒定表達(dá)蛋白分子量為35 kDa。

本研究表明SAM-MTs是一種穩(wěn)定的、疏水的、非跨膜的、結(jié)構(gòu)松散的蛋白，其理論等電點(diǎn)為4.75。親水性分析表明，SAM-MTs的親水性位點(diǎn)與SAM-MTs的抗原位點(diǎn)高度相關(guān)。在結(jié)核分枝桿菌中識(shí)別SAM-MTs的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位可激發(fā)特異性免疫反應(yīng)，包括了解其發(fā)病機(jī)制、開(kāi)發(fā)診斷方法、設(shè)計(jì)基于肽基的疫苗以預(yù)防感染［18］。本研究通過(guò)在SAM-MTs中發(fā)現(xiàn)具有潛在優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，探討SAM-MTs在耐藥中的作用。此外，抗原表位賦予了抗原特異性，抗原表位可以通過(guò)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)［19］。結(jié)果表明，SAM-MTs是一個(gè)結(jié)構(gòu)松散的蛋白，具有47.4%的無(wú)規(guī)卷曲，11.9%的β-轉(zhuǎn)角二級(jí)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)表面的無(wú)序卷曲和β-轉(zhuǎn)角有利于抗原與抗體的結(jié)合，成為抗原表位的首選。三級(jí)結(jié)構(gòu)同源性建模顯示SAM-MTs與假定的S-腺苷甲硫氨酸依賴甲基轉(zhuǎn)移酶ML2640具有高度相似的序列。這一發(fā)現(xiàn)提供了更多SAM-MTs的立體構(gòu)象信息，對(duì)研究SAM-MTs的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系具有重要意義。在SAM-MTs中有2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、6個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)酰化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)SAM-MTs的加工、成熟和生物調(diào)控至關(guān)重要［20］。