江錫兵，章平生，張東北，吳仁超，吳 劍，吳聰連，賴俊聲，龔榜初＊

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省慶元縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 慶元 323800）

殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea Mill.）植物共有7個(gè)種，自然分布于歐亞及北美大陸的溫帶廣闊地域。其中，板栗（C.mollissima Blume）、錐栗（C.henryi （Skan） Rehd.et Wils.）和茅栗（C.seguinii Dode）為我國(guó)特有種。栗屬中國(guó)特有種在栗屬植物研究和利用中占有重要地位，其品質(zhì)優(yōu)良，適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)，尤其對(duì)栗疫病和墨水病具有較強(qiáng)的抵抗力，是進(jìn)行食用栗品種改良的重要基因來(lái)源，對(duì)世界栗屬資源保護(hù)和可持續(xù)利用具有重要作用[1]。我國(guó)栗屬育種研究起始于上世紀(jì)50—60年代，通過(guò)常規(guī)育種方法選育了一大批應(yīng)用于生產(chǎn)的優(yōu)良品種等[2-3]，目前傳統(tǒng)的選擇育種和雜交育種仍是栗屬品種選育和性狀遺傳改良的主要方法。

栗屬為多年生木本植物，其童期長(zhǎng)，選育一個(gè)新品種或?qū)δ骋恍誀钸M(jìn)行遺傳改良周期漫長(zhǎng)，至少需要10～15 a，且花費(fèi)巨大。同時(shí)，栗屬農(nóng)藝性狀大多是受微效多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，且易受環(huán)境影響，導(dǎo)致傳統(tǒng)的育種方法效率不高。確定控制農(nóng)藝性狀的自然等位變異，不僅有助于解析其遺傳基礎(chǔ)，且可以為分子標(biāo)記輔助育種乃至定向育種提供有效的基因資源和分子標(biāo)記，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值[4]。近年來(lái)，關(guān)聯(lián)分析（Association analysis）成為解析復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的一個(gè)重要手段。關(guān)聯(lián)分析又稱連鎖不平衡作圖（Linkage disequilibrium mapping）或關(guān)聯(lián)作圖（Association mapping），是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，檢測(cè)群體內(nèi)處于連鎖不平衡狀態(tài)的標(biāo)記或候選基因的遺傳變異與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)頻率的方法，目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林作物。截至目前，關(guān)聯(lián)分析在林木中應(yīng)用主要以自然群體為主，而以雜交群體為材料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析鮮有報(bào)道。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）廣泛分布于各類真核生物基因組中，為共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、便于檢測(cè)等特點(diǎn)[5]。SSR標(biāo)記現(xiàn)已成為生物遺傳特性研究的一種重要分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于栗屬植物遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等研究[5-11]。本課題組以錐栗種內(nèi)、板栗和錐栗種間共9個(gè)雜交組合F1代群體（235個(gè)單株）為材料，前期采用32對(duì)高多態(tài)性栗屬SSR標(biāo)記對(duì)其遺傳多樣性、遺傳效應(yīng)等進(jìn)行了分析[12]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)和連鎖不平衡分析，并將SSR標(biāo)記與F1代生長(zhǎng)、枝條、葉片表型及其光合生理等農(nóng)藝性狀表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得與農(nóng)藝性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，為栗屬植物分子標(biāo)記輔助選擇和高效育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為錐栗種內(nèi)、錐栗和板栗種間共9個(gè)雜交組合235份雜交F1代單株及其親本（表1）。其中，4個(gè)親本YLZ 1、YLZ 2、YLZ 24和YLZ 26為浙江省審（認(rèn)）定錐栗良種，YLZ 24早熟、大果高產(chǎn)，YLZ 26特別高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，YLZ 1和YLZ 2耐貯藏、優(yōu)質(zhì)且適宜加工；YLZ 14和YLZ 15為錐栗優(yōu)株無(wú)性系，均是晚熟、優(yōu)質(zhì)品系；‘魁栗’為浙江省板栗良種，果型特大，平均單果質(zhì)量20～25 g。2011年通過(guò)人工控制授粉獲得雜交種實(shí)，2012年播種育苗，2013年春季建立雜交子代測(cè)定林，同時(shí)栽植所有親本1年生嫁接苗若干株，株行距4 m×4 m，每年進(jìn)行精細(xì)撫育管理，235份子代單株及其親本生長(zhǎng)發(fā)育狀況良好。

表1 栗雜交組合概況Table 1 Cross combination of chestnut

1.2 樣品采集與DNA提取

于2019年4月份采集235個(gè)子代單株及其親本幼嫩、無(wú)病蟲害的新鮮葉片，每個(gè)單株采集嫩葉3～5片，裝于事先做好標(biāo)記的自封袋中，并將自封袋置于裝有干冰的泡沫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室。

采用北京艾德萊生物科技公司生產(chǎn)的DNA試劑盒提取235份子代及其親本基因組DNA，所提取的DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量和紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，?20 ℃低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR標(biāo)記引物篩選與毛細(xì)管電泳分析

從120對(duì)引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的32對(duì)SSR引物，采用毛細(xì)管電泳儀對(duì)所有樣本的SSR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析（圖1）。32對(duì)SSR引物具體信息、SSR擴(kuò)增程序、毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)獲得等內(nèi)容詳見本課題組前期研究[12]。

圖1 SSR 標(biāo)記毛細(xì)管電泳Fig.1 Capillary electrophoresis of SSR markers

1.4 表型性狀測(cè)定

分別于2018—2019年（連續(xù)2 a）1、7、11月份對(duì)235份子代單株的枝條性狀、葉片表型及其光合生理指標(biāo)、生長(zhǎng)性狀進(jìn)行調(diào)查測(cè)定，具體方法參照本課題組章平生等[13-14]前期研究。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用TASSEL 5.0軟件和R語(yǔ)言完成標(biāo)記間的連鎖不平衡（LD）分析及關(guān)聯(lián)分析，STRUCTURE 2.3.4 軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。

根據(jù)R2確定標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)程度，即假設(shè)有兩個(gè)連鎖的座位A和B，其等位基因分別為A、a和B、b，用πA、πa、πB、πb分別表示相應(yīng)的等位基因頻率，用πAB、πaB、πAb和πab分別表示4種單倍型AB、aB、Ab和ab的頻率，則實(shí)際觀測(cè)到的單倍型頻率與期望單倍型頻率間的差異D及R2的計(jì)算公式為：

Dab=πAB?πAπB

R2=（Dab）2/πAπaπBπb

應(yīng)用STRUCTURE 2.3.4軟件估測(cè)栗雜交子代的群體遺傳結(jié)構(gòu)。依據(jù)Evanno等[15]的統(tǒng)計(jì)模型，以最大似然法和Delta K值對(duì)235份雜交子代進(jìn)行亞群劃分。數(shù)據(jù)錄入后，初始階段MCMC的不作數(shù)迭代默認(rèn)設(shè)置為10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC調(diào)為100 000次，群體的數(shù)目（K）設(shè)為2～13，以此估計(jì)可能的群體數(shù)目。計(jì)算Q參數(shù)，作為關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量。

采用TASSEL 5.0軟件中的一般線性模型（General linear model，GLM）和混合線性模型（Mixed linear model，MLM）對(duì)SSR標(biāo)記和農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。GLM以Q作為協(xié)變量進(jìn)行回歸分析；MLM 采用Q+K方法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交F1代群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

群體遺傳結(jié)構(gòu)是影響連鎖不平衡（LD）水平的一個(gè)重要因素，亞群數(shù)量的增加會(huì)使連鎖不平衡的程度增強(qiáng)，可能導(dǎo)致多態(tài)性基因位點(diǎn)與目標(biāo)性狀間產(chǎn)生偽關(guān)聯(lián)，造成假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，因此，在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)對(duì)群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析是不可或缺的步驟。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)K=4時(shí)，圖像出現(xiàn)明顯的拐點(diǎn)（圖2），Delta K值也接近最大。據(jù)此，235個(gè)雜交F1代最終被劃分為4個(gè)亞群（圖3），平均混合度為0.120。

圖2 不同K值下Delta K值的變化Fig.2 Change of Delta K value under different K values

圖3 雜交F1代群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.3 Genetic structure of F1 hybrid population

由圖3可知，235份雜交子代群體被劃分為4個(gè)亞群，而并未按照其雜交組合分為9個(gè)亞群，但每個(gè)亞群中子代分布呈現(xiàn)出一定的遺傳分化。其中，第1亞群主要包括組合C8（‘魁栗’×YLZ 15號(hào)）和C9（‘魁栗’בYLZ 1號(hào)’），且有少部分組合C2、C6和C7的子代混入其中；第2亞群主要為組合C2（‘YLZ 26號(hào)’×YLZ 15號(hào)）、C4（‘YLZ 24 號(hào)’×YLZ 15 號(hào)）和C1（‘YLZ 26 號(hào)’×YLZ 14號(hào)），同樣有少部分組合C3、C5和C7的子代混入其中；第3亞群主要包括組合C3（‘YLZ 24號(hào)’בYLZ 1號(hào)’）和C5（‘YLZ 1號(hào)’בYLZ 24號(hào)’），少部分組合C6和C7的子代混入其中；而第4亞群則主要為組合C6（‘YLZ 1號(hào)’בYLZ 2號(hào)’）和C7（YLZ 14號(hào)בYLZ 1號(hào)’），組合C9的個(gè)別子代混入其中。此結(jié)果與前期研究中UPGMA和PCA分類結(jié)果基本一致[12]。

2.2 SSR標(biāo)記間連鎖不平衡分析

利用TASSEL 5.0軟件對(duì)32對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行連鎖不平衡（LD）分析，根據(jù)標(biāo)記間R2來(lái)確定兩兩標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)程度，利用R語(yǔ)言ggplot和pheatmap軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析（圖4）。可以看出，統(tǒng)計(jì)概率P<0.05時(shí)，32對(duì)SSR標(biāo)記組成496個(gè)位點(diǎn)中存在一定的連鎖不平衡（圖4中對(duì)角線上面淡紅及紅色位點(diǎn)），其中，74個(gè)位點(diǎn)的連鎖不平衡水平較高，占總標(biāo)記對(duì)的比例為14.92%，其余位點(diǎn)的連鎖不平衡水平相對(duì)較低；而P<0.01時(shí)，大多數(shù)位點(diǎn)間連鎖不平衡水平較低，且有37個(gè)標(biāo)記對(duì)的R2值為0，表現(xiàn)出完全的連鎖平衡現(xiàn)象。LD分析結(jié)果表明32個(gè)SSR位點(diǎn)間連鎖不平衡總體水平較低。

圖4 32個(gè) SSR 標(biāo)記間 LD 的分布情況Fig.4 The distribution of LD among 32 SSR markers

2.3 農(nóng)藝性狀與SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

利用TASSEL 5.0軟件一般線性模型（GLM）和混合線性模型（MLM）對(duì)雜交子代涵蓋生長(zhǎng)、枝條、葉片表型及其光合生理的25個(gè)農(nóng)藝性狀（連續(xù)2 a數(shù)據(jù)平均值）與32個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并結(jié)合比較包法隆尼（Bonferroni threshold，P<1/1 048=9.5×10?4）閾值，對(duì)標(biāo)記進(jìn)行篩選，結(jié)果見表2。

表2 GML和MLM模型關(guān)聯(lián)標(biāo)記及其對(duì)農(nóng)藝性狀的解釋率Table 2 Explanation ratio of associated markers with agronomic traits in GML and MLM models %

·續(xù)表2·

GLM模型中，高達(dá)28個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)與樹高等24個(gè)農(nóng)藝性狀呈極顯著關(guān)聯(lián)，每個(gè)性狀可檢測(cè)到關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)數(shù)1～22個(gè)不等，解釋率范圍為4.65%～24.02%。不同性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)數(shù)不同，3個(gè)生長(zhǎng)性狀中，與樹高相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)數(shù)最多，達(dá)16個(gè)，其中位點(diǎn)ICMA017s、PRD21關(guān)聯(lián)解釋率相對(duì)較高，分別能解釋12.06%、11.60%的樹高變異，而其它位點(diǎn)的解釋率均不足10.00%。3個(gè)枝條性狀中，關(guān)聯(lián)位點(diǎn)數(shù)最多的性狀為節(jié)間距，但其位點(diǎn)解釋率偏低，均在8.00%以下。在葉片表型及其光合生理性狀中，葉片寬度、葉面積及葉片干質(zhì)量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)數(shù)最多，均達(dá)22個(gè)。其中，葉片寬度、葉面積均與位點(diǎn)CsCAT7表現(xiàn)出較高的關(guān)聯(lián)解釋率，分別為16.70%、18.73%；與葉片干質(zhì)量關(guān)聯(lián)解釋率最高的位點(diǎn)是ICMA017s，能解釋15.50%的葉片干質(zhì)量變異；部分葉片性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)較少，如類胡蘿卜素僅與位點(diǎn)CsCAT18相關(guān)聯(lián)，葉緣齒數(shù)僅與ICMA003相關(guān)聯(lián)，葉綠素a僅與CmTCR22和CsCAT18相關(guān)聯(lián)，葉脈分枝角僅與CsCAT26和ICMA010相關(guān)聯(lián)。此外，不同位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的性狀數(shù)也不相同，其中位點(diǎn)CsCAT41僅能解釋4.67%的葉尖角變異，位點(diǎn)ICMA022僅能解釋6.57%的樹高變異，而位點(diǎn)CmTCR22與樹高、地徑等17個(gè)農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)的性狀最多，但解釋率均在10.00%以下。

MLM模型中，得出26個(gè)SSR位點(diǎn)與樹高等23個(gè)農(nóng)藝性狀呈極顯著關(guān)聯(lián)，解釋率范圍為5.04%～24.02%。與GLM模型關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果相比，部分性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)數(shù)以及部分位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的性狀數(shù)均有所減少，但解釋率差異不明顯，其中位點(diǎn)CsCAT18不再與類胡蘿卜素和葉綠素a關(guān)聯(lián)，位點(diǎn)CsCAT26不再與葉脈分枝角關(guān)聯(lián)。

綜合兩種模型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)15個(gè)SSR標(biāo)記與樹高、地徑、冠徑3個(gè)生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)，14個(gè)SSR標(biāo)記與1年生枝條長(zhǎng)度、1年生枝條粗度、節(jié)間距3個(gè)枝條性狀關(guān)聯(lián)，26個(gè)SSR標(biāo)記與葉片長(zhǎng)度等18個(gè)葉片表型及其光合生理性狀關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步對(duì)各性狀高度關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選分析，最終得出ICMA017s等15個(gè)標(biāo)記分別與樹高等13個(gè)農(nóng)藝性狀高度關(guān)聯(lián)，標(biāo)記對(duì)性狀的解釋率均在10.00%以上（表3）。其中，ICMA017s與3個(gè)生長(zhǎng)性狀高度關(guān)聯(lián)，PRD21與樹高性狀高度關(guān)聯(lián)，表明這2個(gè)SSR標(biāo)記與栗樹體生長(zhǎng)高度相關(guān)；PRD26、CmTCR4分別與1年生枝條粗度、1年生枝條長(zhǎng)度高度關(guān)聯(lián)，表明這2個(gè)標(biāo)記與栗枝條生長(zhǎng)發(fā)育高度相關(guān)；PRA86等15個(gè)標(biāo)記分別與代表葉片大小、形狀、厚度以及質(zhì)量的8個(gè)表型性狀高度關(guān)聯(lián)，表明這些標(biāo)記與栗葉片生長(zhǎng)發(fā)育高度相關(guān)，同時(shí)，葉片各性狀高度關(guān)聯(lián)的標(biāo)記數(shù)量差異較大，其中葉片干質(zhì)量高度關(guān)聯(lián)的標(biāo)記數(shù)量達(dá)10個(gè)，其次為葉片寬度和葉面積，均為9個(gè)，而葉形指數(shù)關(guān)聯(lián)的標(biāo)記數(shù)量最少，僅2個(gè)。此外，還存在同一標(biāo)記同時(shí)與多個(gè)性狀高度關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象，如ICMA017s與樹高、地徑、冠徑、葉片寬度、葉面積、葉片鮮質(zhì)量及葉片干質(zhì)量均存在高度關(guān)聯(lián)，PRD21與樹高、葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉形指數(shù)均高度關(guān)聯(lián)，CmTCR4與1年生枝條長(zhǎng)度、葉片厚度、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量及比葉質(zhì)量均高度關(guān)聯(lián)，表明某些標(biāo)記位點(diǎn)可能同時(shí)控制多個(gè)性狀，且某一性狀同時(shí)受多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)控制。

表3 性狀高度關(guān)聯(lián)SSR標(biāo)記統(tǒng)計(jì)Table 3 The traits with high associated SSR markers

3 討論

農(nóng)藝性狀大多是受多基因控制的數(shù)量性狀，且各性狀間存在一定的關(guān)聯(lián)，通過(guò)常規(guī)育種技術(shù)對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳改良往往效果不顯著，且周期長(zhǎng)、效率低。在DNA水平利用分子標(biāo)記對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行早期選擇和輔助育種前景廣闊。本研究以涵蓋9個(gè)雜交組合的235份栗雜交子代混合群體為材料，在進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)和連鎖不平衡（LD）分析的基礎(chǔ)上，利用32個(gè)高多態(tài)性SSR標(biāo)記與25個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以獲得與農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，從而為栗屬植物分子標(biāo)記輔助育種特別是雜交子代的選擇和高效育種奠定基礎(chǔ)。

連鎖不平衡也稱為配子相不平衡（Gametic phase disequilibrium）、配子不平衡（Gametic disequilibrium）或等位基因關(guān)聯(lián)（Allelic association），是指群體內(nèi)不同座位等位基因（可以是標(biāo)記，也可是基因/QTL間與標(biāo)記）間的非隨機(jī)關(guān)聯(lián)[16]。LD在染色體上的分布一般用LD衰減散點(diǎn)圖和LD配對(duì)檢測(cè)的矩陣圖來(lái)描述，前者可以觀測(cè)LD隨遺傳或物理距離的衰減速率，后者可以直接觀測(cè)同一染色體的基因座或基因的多態(tài)性位點(diǎn)間LD的線性排列[17]。本研究LD分析采用了后者，結(jié)果較為直觀，統(tǒng)計(jì)概率P<0.05時(shí)，32對(duì)SSR標(biāo)記組成496個(gè)位點(diǎn)中存在一定的連鎖不平衡，其中，74個(gè)位點(diǎn)的連鎖不平衡水平較高，占總標(biāo)記對(duì)的14.92%，其余位點(diǎn)的連鎖不平衡水平相對(duì)較低；而P<0.01時(shí)，32個(gè)SSR位點(diǎn)間連鎖不平衡總體水平較低。LD水平?jīng)Q定了關(guān)聯(lián)分析的解析精度，是開展關(guān)聯(lián)分析研究的理論基礎(chǔ)。LD的一個(gè)明顯特性是群體依賴性，選擇的群體不同，其LD水平顯著不同。當(dāng)所用群體來(lái)源有限時(shí)，其LD將維持在一個(gè)較高的水平。而選用多樣性較高的群體則包括更多不同來(lái)源的研究個(gè)體，其LD水平一般較低；同時(shí)，群體混合可通過(guò)引進(jìn)不同祖先來(lái)源和等位基因頻率的染色體而影響群體的LD水平[18]。本研究所使用的材料為涵蓋9個(gè)雜交組合235份雜交子代的混合群體，其親本涉及錐栗和板栗2個(gè)物種的7個(gè)優(yōu)良品種或優(yōu)株無(wú)性系，并通過(guò)雜交即基因的交換和重組產(chǎn)生了大量的遺傳變異類型，來(lái)源較為復(fù)雜多樣，且前期研究表明不同組合子代群體具有豐富的遺傳多樣性（Shannon’s多樣性指數(shù)范圍0.881 6～1.131 7）[12]，其LD水平較低。

群體結(jié)構(gòu)的存在和亞群內(nèi)等位基因頻率的不均等分布將導(dǎo)致多態(tài)性位點(diǎn)和表型的假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)，分析群體遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)表型性狀的影響，對(duì)于防止假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)是非常必要的[19]。因此，群體結(jié)構(gòu)分析是關(guān)聯(lián)分析的前提。本研究所用的栗不同雜交組合群體并非自然群體，在一定程度上不同組合間存在一定的親緣關(guān)系，而對(duì)供試群體進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析可將群體分為適宜的幾個(gè)亞群，將群體結(jié)構(gòu)信息作為協(xié)變量來(lái)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，在一定程度上使得假陽(yáng)性得到控制。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，當(dāng)K=4時(shí)，Delta K值接近最大。據(jù)此，235個(gè)雜交F1代群體最終被劃分為4個(gè)亞群，且每個(gè)亞群中子代分布也呈現(xiàn)出一定的遺傳分化，平均混合度為0.120。此結(jié)果與前期研究中UPGMA和PCA分類結(jié)果基本一致。

關(guān)聯(lián)分析又稱連鎖不平衡作圖，是一種以基因間連鎖不平衡為基礎(chǔ)，鑒定某一群體內(nèi)目標(biāo)性狀與標(biāo)記間關(guān)系的分析方法。與連鎖作圖分析相比，關(guān)聯(lián)分析所用群體具有更為廣泛的遺傳基礎(chǔ)，可同時(shí)對(duì)同一基因座的多個(gè)等位基因進(jìn)行分析，而絕大部分常規(guī)QTL作圖所用群體通常為2親本雜交重組后代，其基因座一般只涉及2個(gè)等位基因；同時(shí)，關(guān)聯(lián)分析作圖定位更為準(zhǔn)確和具有更高的分辨率，可實(shí)現(xiàn)對(duì)QTL的精細(xì)定位，甚至直接定位到基因本身[20]。因此，關(guān)聯(lián)分析與QTL作圖分析既互為補(bǔ)充，又比連鎖作圖分析有著更為廣泛的應(yīng)用。曹珂等[21]以分布于桃（Prunus persica L.）8個(gè)連鎖群上的53個(gè)SSR標(biāo)記與104份桃地方品種單果質(zhì)量及物候期性狀表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到27個(gè)與桃單果質(zhì)量及6個(gè)物候期性狀關(guān)聯(lián)的QTLs。作者等[11]以來(lái)自山東等10個(gè)省份95個(gè)板栗地方品種為試材，將17對(duì)SSR標(biāo)記與板栗地方品種農(nóng)藝性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，經(jīng)假陽(yáng)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葉柄長(zhǎng)度和淀粉含量分別與標(biāo)記CsCAT 5和CsCAT 22呈顯著關(guān)聯(lián)。張琳等[22]以篩選出的16對(duì)高多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)36份產(chǎn)油量較好、觀賞性較佳的牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）材料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)SSR位點(diǎn)與單株種子產(chǎn)量、聚合蓇葖果數(shù)等9個(gè)性狀極顯著關(guān)聯(lián)（P<0.01）。關(guān)聯(lián)分析所使用材料既可以是自然群體，也可以是多親本雜交混合群體。如對(duì)測(cè)交群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以直接定位F1雜種當(dāng)代控制目標(biāo)性狀的遺傳位點(diǎn)或區(qū)域，進(jìn)而直接反映出F1雜種當(dāng)代的遺傳效應(yīng)，是對(duì)傳統(tǒng)連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析群體定位結(jié)果的有益補(bǔ)充[23]。姚俊修從16個(gè)鵝掌楸（Liriodendron chinense （Hemsl.） Sarg.）種間雜交組合中抽取430份子代個(gè)體，在測(cè)定其樹高和胸徑兩個(gè)表型性狀的基礎(chǔ)上，利用101個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)每個(gè)個(gè)體的基因型；然后利用Tassel 3.0軟件分析不同標(biāo)記間的連鎖不平衡（LD值），Structure 2.3軟件對(duì)子代群體進(jìn)行分群；在群體結(jié)構(gòu)矯正基礎(chǔ)上，將表型與分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)標(biāo)記與樹高性狀相關(guān)聯(lián)，7個(gè)標(biāo)記與胸徑性狀關(guān)聯(lián)[24]。本研究中，綜合兩種模型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)15個(gè)SSR標(biāo)記與樹高等3個(gè)生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)，14個(gè)SSR標(biāo)記與1年生枝條長(zhǎng)度等3個(gè)枝條性狀關(guān)聯(lián)，26個(gè)SSR標(biāo)記與葉片長(zhǎng)度等18個(gè)葉片表型及其光合生理性狀關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步對(duì)各性狀高度關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選分析，最終得出ICMA017s等15個(gè)SSR標(biāo)記分別與樹高等13個(gè)農(nóng)藝性狀高度關(guān)聯(lián)，標(biāo)記對(duì)性狀的解釋率均在10.00%以上。

同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)存在同一標(biāo)記同時(shí)與多個(gè)性狀高度關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象，如ICMA017s與樹高、地徑、冠徑、葉片寬度、葉面積、葉片鮮質(zhì)量及葉片干質(zhì)量7個(gè)性狀均存在高度關(guān)聯(lián)，CmTCR4與1年生枝條長(zhǎng)度、葉片厚度、葉片鮮質(zhì)量、葉片干質(zhì)量及比葉質(zhì)量等5個(gè)性狀均高度關(guān)聯(lián)，PRD21與樹高、葉片長(zhǎng)度、葉片寬度、葉形指數(shù)4個(gè)性狀均高度關(guān)聯(lián)；還存在同一性狀與多個(gè)標(biāo)記高度關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象，如葉片干質(zhì)量高度關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記數(shù)量多達(dá)10個(gè)，其次為葉片寬度和葉面積，均為9個(gè)，葉片鮮質(zhì)量、葉片長(zhǎng)度、比葉質(zhì)量和樹高性狀高度關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分別為5、3、3和2個(gè)。表明某些標(biāo)記位點(diǎn)可能同時(shí)控制多個(gè)性狀，且某一性狀同時(shí)受多個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)控制。此現(xiàn)象在柳樹（Salix babylonica L.）[25]、日本落葉松（Larix kaempferi（Lamb.）Carr.）[26]、豇豆（Vigna unguiculata （L.）Walp.）[27]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。說(shuō)明植物中存在一個(gè)基因控制多個(gè)農(nóng)藝性狀或者影響這些農(nóng)藝性狀的部分基因存在緊密連鎖的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致標(biāo)記位點(diǎn)變異具有多效性[28]。據(jù)此推測(cè)生長(zhǎng)、枝條、葉片表型及其光合生理等農(nóng)藝性狀的這種相關(guān)性可能是由于基因的一因多效表達(dá)或者是連鎖不平衡產(chǎn)生的。

4 結(jié)論

供試雜交群體32個(gè)SSR位點(diǎn)間LD總體水平較低；根據(jù)Delta K值計(jì)算結(jié)果，235個(gè)栗雜交F1代混合群體被劃分為4個(gè)亞群，且每個(gè)亞群中子代分布呈現(xiàn)出一定的遺傳分化，平均混合度為0.120；綜合GLM和MLM兩種模型關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，得出15個(gè)SSR標(biāo)記與樹高等3個(gè)生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)，14個(gè)SSR標(biāo)記與1年生枝條長(zhǎng)度等3個(gè)枝條性狀關(guān)聯(lián)，26個(gè)SSR標(biāo)記與葉片長(zhǎng)度等18個(gè)葉片表型及其光合生理性狀關(guān)聯(lián)。其中，ICMA017s等15個(gè)SSR標(biāo)記分別與樹高等13個(gè)農(nóng)藝性狀高度關(guān)聯(lián)，標(biāo)記對(duì)性狀的解釋率均在10.00%以上，且存在同一標(biāo)記與多個(gè)性狀、同一性狀與多個(gè)標(biāo)記高度關(guān)聯(lián)的現(xiàn)象。研究結(jié)果為栗屬植物分子標(biāo)記輔助育種特別是雜交子代的選擇和高效育種奠定了基礎(chǔ)。