劉在哲，亓玉昆，呂 娟，張玉嬌，張 偉，劉 云，付翠翠，劉 慇，劉保友，王清海＊

（1.濟南市林場，山東 濟南 250014；2.山東省林業(yè)科學研究院，山東 濟南 250014；3.濟南市園林和林業(yè)科學研究院，山東 濟南 250103；4.山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東 煙臺 265500）

側(cè)柏（Platycladus orientalis （L.） Franco），屬柏科（Cupressaceae）側(cè)柏屬（Platycladus）常綠喬木，耐干旱貧瘠，適應范圍廣，是我國荒山造林的先鋒樹種，也是重要的園林綠化樹種，除新疆、青海外，全國均有分布。側(cè)柏種植在防風固沙、調(diào)節(jié)生態(tài)氣候等方面具有重要意義。側(cè)柏是高齡樹種，一些歷史風景名勝地現(xiàn)存的古柏更是中華民族五千年歷史文明的見證及珍貴歷史文化遺存，具有極其重要的自然景觀價值和歷史價值。

側(cè)柏葉枯病是一種重要的側(cè)柏葉部病害，在我國江蘇、安徽、陜西等地大面積發(fā)生，在江蘇盱眙縣側(cè)柏被害率達100%，病情指數(shù)高達50.0以上，危害嚴重時，側(cè)柏干枯死亡，已成為我國側(cè)柏最重要的病害之一[1]。目前的研究表明，Alternaria pruni McAlpine[2]、A.alternata （Fr.） Keissler、Pestalotiopsis gracilis （Kleb.） Steyaert、Chloroscypha platycladus Y.S.Dai[3]、Monochaetia sp.[4]和Keithia thujina Durand[5]均可以引起側(cè)柏葉枯病。由于生長地理位置及生境差異，病原有所不同。2020年作者發(fā)現(xiàn)在濟南市林場、千佛山風景區(qū)等側(cè)柏林中，側(cè)柏鱗葉出現(xiàn)枯黃脫落現(xiàn)象，病株率達90%以上，危害嚴重的側(cè)柏整株枯死。濟南市側(cè)柏面積8.25萬hm2，側(cè)柏枝枯病主要發(fā)生于枝葉部，造成側(cè)柏樹勢衰弱，可能誘發(fā)雙條杉天牛、小蠹蟲等次期性害蟲的危害，造成側(cè)柏林成片干枯，影響綠化效果，造成嚴重的生態(tài)和經(jīng)濟損失。為有效控制危害，明確病原種類是十分必要的。因此，本研究通過形態(tài)特征、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析以及致病性測定，明確在濟南市引起側(cè)柏枝枯的致病因子，以期為該病害的發(fā)生、流行規(guī)律及其防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感病的側(cè)柏枝條及鱗葉，從山東省濟南市佛慧山（36°37′37″ N,117°2′44″ E）、仰山（36°36′26″ N,117°1′43″ E）、螞蚱鞍子山（36°37′21″ N,117°44′46″ E）、廻龍山（36°37′25″ N,117°4′26″ E）側(cè)柏林采集。

1.2 方法

1.2.1 側(cè)柏病組織疑似病原菌分離及分離菌單孢培養(yǎng) 采用組織分離法。先用70%乙醇將樣品表面消毒，然后在側(cè)柏細枝、鱗葉病健交界處利用無菌解剖刀取5 mm2的組織塊，依次用3%次氯酸鈉浸泡1 min，無菌水沖洗3次。將處理好的組織塊置于PDA平板上，每個平皿放置5塊，25 ℃培養(yǎng)3 d。將生長的菌落純化轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，25 ℃下培養(yǎng)，采取孢子稀釋分離法獲取單菌落。分離獲得的菌株均保存于山東省林業(yè)科學研究院森林保護研究所。

1.2.2 分離菌致病性測定 分離菌株致病性測定采用室內(nèi)離體接種法及室外活體接種法。室內(nèi)離體接種法，選擇健康的側(cè)柏細枝條，自來水沖洗干凈，晾干后，用70%酒精表面消毒，備用。將分離獲得的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣用打孔器制作菌餅（?=5 mm），轉(zhuǎn)移至低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（SNA）平板上，菌餅菌絲貼在平板上，在菌餅周圍放置2根無菌松針，紫外燈照射條件下培養(yǎng)10 d誘導產(chǎn)孢。將孢子配置成106孢子·mL?1孢子懸浮液，備用。先用無菌的挑針（?=0.5 mm）輕微刺傷鱗葉，在傷口處滴200 μL孢子懸浮液，以無菌水為對照。將處理后的枝條置于含有少量無菌水的無菌燒杯中，用保鮮膜封閉，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察。每組試驗各做5次平行處理，重復2次。

室外活體接種，選用健康無病生長一致的播種2年生盆栽側(cè)柏苗進行活體接種。鱗葉用挑針刺傷，干基部用無菌手術刀做“T”傷口，在傷口處滴200 μL 孢子懸浮液，并放上無菌水浸濕的脫脂棉，用剪好的封口膜包扎，以接種無菌水為對照。為了防止水分蒸發(fā)過快，每一株側(cè)柏用黑色塑料袋包裹，2 d后除去黑色塑料袋，每天進行觀察；每組試驗各做5次平行處理，重復2次。

1.2.3 病原鑒定

1.2.3.1 形態(tài)特征觀察 將分離獲得的單孢菌株在PDA培養(yǎng)基平板活化培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣利用打孔器制作菌餅（?=5 mm），將菌餅置于PDA、MEA平板中央，每個平板置1塊菌餅，25 ℃、12 h照射/12 h黑暗交替培養(yǎng)，觀察記錄菌落特征。

1.2.3.2 分子生物學鑒定 DNA的提取采用改進的CTAB法。擴增的目的基因分別為核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）、翻譯延伸因子?1α（TEF1-α）、β-微管蛋白（TUB2）。引物序列及擴增反應條件參數(shù)見表1。擴增反應體系為25 μL，其中2 μL DNA 模板、8.5 μL ddH2O、12.5 μL Taq 酶 mix、各1 μL上下游引物。PCR擴增產(chǎn)物由上海派森諾生物科技有限公司進行雙向測序。

表1 PCR 擴增所用引物及反應程序Table 1 Primers used in this study,with sequence and PCR conditions

將獲得的ITS、TEF1-α和TUB2序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，并利用Blast進行比對。選取38株Neofusicoccum sp.菌株作為參考菌株，以Botryosphaeria dothidea （CBS 115 476）、Dothiorella iberica （CBS 115 041） 和D.sarmentorum （IMI63581b） 作為外圍菌株（表2）。利用 Fasta alignment joiner 軟件（https://usersbirc.au.dk/～palle/php/fabox/alignment_joiner.php#）通過首尾相連的方法，將 ITS、TEF1-α和TUB2基因串聯(lián)。利用MEGA 7.0 軟件，采用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，循環(huán)1 000次，并以自展支持率（Bootstrap）校對檢測。

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的參考菌株序列Table 2 Strains and sequences of the genus Neofusicoccum used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 側(cè)柏枝枯病癥狀

危害葉片，多由葉片前端或中部枯黃、變褐枯死。危害細枝，呈段斑狀變褐（圖1a,b）。在枯死的鱗葉和細枝上產(chǎn)生黑色的顆粒物（圖1d）。樹冠內(nèi)部和下部發(fā)生嚴重。嚴重時，葉片大量脫落，枝條枯死，在主干或枝干上萌發(fā)出一叢叢的小枝葉，形成所謂“樹胡子”。連續(xù)數(shù)年受害，最終全株枯死（圖1c）。

圖1 側(cè)柏枝枯病癥狀（a）～（c）林間癥狀；（d）在側(cè)柏鱗葉和枝條上產(chǎn)生的子實體；（e）分生孢子器縱切面Fig.1 Shoot blight disease symptom on Platycladus orientalis; （a）～（c） symptom in the field; （d） fruiting bodies produced on leaves and shoots （e） longitudinal section of pycnidium Bars=20 μm

2.2 分離菌株致病性

從4個地點共采集樣品20份，分離獲得菌株87株。根據(jù)菌落形態(tài)特征分為3種類型，其中鏈格孢屬真菌27株（31.0%），細菌菌株4株（4.6%），其余為1種真菌共56株（64.4%），菌落形態(tài)特征一致，分生孢子形態(tài)與側(cè)柏鱗葉和枝條上子實體分生孢子形態(tài)相似（圖1e）。

選擇代表性菌株CBL-02、CBL-03和CBCB-02菌株室內(nèi)離體接種7 d后，在鱗葉、枝條接種部位，均可以引起相同癥狀，致使側(cè)柏鱗葉變色，形成黑褐色病斑（圖2a），枝條接種點黑褐色（圖2d）。顯微觀察，在鱗葉、枝條接種部位均有黑色子實體產(chǎn)生（圖2b～d）。而空白對照未出現(xiàn)相應癥狀（圖2f）。室外活體接種30 d后，在接種部位側(cè)柏鱗葉變黃、枯死（圖2e）。接種60 d，枝條、鱗葉干枯脫落，側(cè)柏整株死亡（圖2g），與田間觀察癥狀一致。從接種發(fā)病部位重新分離，獲得的菌株與接種菌株形態(tài)特征一致。表明，分離菌株為側(cè)柏枝枯病的病原菌。

圖2 致病性試驗（a）～（c）側(cè)柏葉片接種CBCB-02菌株7 d后癥狀及子實體; （d）側(cè)柏枝條接種CBCB-02菌株7d后癥狀及子實體；（e）2年生側(cè)柏苗接種CBCB-02菌株30 d癥狀；（f）對照；（g）2年生側(cè)柏苗接種CBCB-02菌株60 d癥狀；左邊為對照，右邊為處理。Fig.2 Pathogenicity test; （a）～（c） symptoms on Platycladus orientalis leaves inoculated with isolate CBCB-02 for 7 d; （d） symptoms on inoculation sites of P.orientalis shoot; （e） symptoms on seedlings （2-years） inoculated with isolate CBCB-02 for 30 d; （f） inoculated with sterile distilled water; （g） symptoms on seedlings （2-years）inoculated with isolate CBCB-02 for 60 d,L:control,R:treated

2.3 側(cè)柏枝枯病病原菌鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，初期白色，稀疏，向四周擴散，培養(yǎng)5 d后，菌落達到平板邊緣（?=70 mm），菌絲開始呈現(xiàn)白色絮狀，菌絲致密，中期顏色逐漸變成灰色（圖3a），后期呈現(xiàn)深灰綠色，背面黑褐色，邊緣完整（圖3b）。在MEA培養(yǎng)基上，初期白色，絮狀向四周擴散生長，后漸變?yōu)榛野咨?。培養(yǎng)3 d，菌落達到平板邊緣（?=70 mm），菌落邊緣完整（圖3d），后期灰色、灰褐色，背面深灰綠色（圖3e）。沒有觀察到有性特征。分生孢子器于7 d內(nèi)產(chǎn)生于松針上，單生或聚生，外面包被白色菌絲，暗褐色至黑色（圖3c）。分生孢子單孢透明、梭形、橢圓形、卵球形，頂端鈍圓，基部平截，有時兩端變窄。無隔膜，表面光滑，大小為 20.6±2.4 μm×7.6±1.2 μm（L/W=2.7，n=50）（圖3f）。

圖3 側(cè)柏枝枯病菌形態(tài)特征 （a）～（b）菌落形態(tài)（PDA培養(yǎng)7 d，14 d）;（c）誘導培養(yǎng)基中著生在松針上的分生孢子座；（d）～（e）菌落形態(tài)（MEA 培養(yǎng) 3 d，7 d）；（f）分生孢子Fig.3 Neofusicoccum occulatum （a）～（b） cultural character （cultured on PDA for 7 d,14 d）,（c） conidiomata formed on pine needles in culture,（d）～（e） cultural character （cultured on MEA for 3 d,7 d）,（f） conidia,Bars=50 μm

2.4 側(cè)柏枝枯病病原菌多基因序列分析

CBL-02、CBL-03、CBCB-02菌株與38株Neofusicoccum spp.參考菌株進行比對，以Botryosphaeria dothidea CBS115476、Dothiorella iberica CBS115041、D.sarmentorum IMI63581B為外圍菌株，基于 ITS、TEF1-α、TUB2基因序列數(shù)據(jù)，運用最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建進化樹。CBL-02，CBL-03和CBCB-02菌株與Neofusicoccum occulatum聚在一個進化分枝上，自展支持率為 89%（圖4）。結(jié)合分離菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀以及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，本試驗獲得的菌株為N.occulatum Sakalidis,M.L.,Burgess,T.I.。

圖4 利用最大似然法基于側(cè)柏葉枯病菌ITS、TEF-1α和TUB2的基因數(shù)據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。自展支持率標于節(jié)點處，以Botryosphaeria dothidea CBS115476、Dothiorella sarmentorum、D.iberica為外圍菌株，標尺指示 0.005 步變化。Fig.4 Phylogenetic tree of all isolates tested with allied taxa calculated with sequence data of concatenated ITS,TEF-1α and TUB2 using maximum likelihood method （1,000 bootstrap replicates; bootstrap values indicated at nodes.Botryosphaeria dothidea,Dothiorella sarmentorum and D.iberica represent the out group.The scale bar indicates the number of expected changes per site.

3 討論

N.occulatum是Sakalidis 2011年[6]首次在澳大利亞的桉樹（Eucalyptus spp.），瓦勒邁杉（Wollemia nobilis W.G.Jones,K.D.Hill & J.M.Allen）上分離獲得。已有研究表明，N.occulatum已在非洲（烏干達）、大洋洲（澳大利亞、美國夏威夷）、南美洲（烏拉圭）、亞洲（泰國）等5個國家有分布，可以危害南洋杉（Araucaria cunninghamii Sweet），鄧恩桉（Eucalyptus dunnii Maiden），大桉（E.grandis W.Mill ex Maiden），巨桉雜交種（E.grandis hybrid），粗皮桉（E.pellita F.V.Muell.），桉樹（Eucalyptus sp.），尾葉桉和赤桉雜交種（Eucalyptus urophylla S.T.Blake x E.camaldulensis Dehnh.），瓦勒邁杉（W.nobilis），銀樺（Grevillea sp.），Blepharocalyx salicifolius （Kunth） O.Berg，藍莓（Vaccinium spp.），葡萄（Vitis vinifera L.），束花石斛（Dendrobium chrysanthum Wall.ex Lindl.）等寄主植物[7-9]。本研究結(jié)果表明N.occulatum已在我國有分布，這是國內(nèi)有關N.occulatum的首次報道。目前，對N.occulatum的研究僅局限分類研究，其生物學、生態(tài)學、流行學、種群遺傳結(jié)構(gòu)和有效的防治措施尚需進一步系統(tǒng)研究。

據(jù)已有的文獻報道，新殼梭孢屬真菌（Neofusicoccum sp.）可以危害美國扁柏（Chamaecyparis lawsoniana （A.Murray bis）Parlatore）、日本扁柏（Ch.Obtuse （Siebold et Zuccarini） Enelicher）、日本花柏（Ch.pisifera（Siebold et Zuccarini） Enelicher）、 柏 木（Cupressus funebris Endl.）、地中海柏木（Cu.sempervirens L.）、歐洲刺柏（Juniperus communis L.）、北美香柏（Thuja occidentalis L.）、北美喬柏（T.plicata Donn ex D.Don）、羅漢柏（Thujopsis dolabrata （Thunberg ex L.f.）Sieb.et Zucc.）、 巨 杉 （Sequoiadendron giganteum （Lindl.） J.Buchholz）[10]，尚未見危害側(cè)柏的報道，是側(cè)柏上發(fā)生的一種新病害。

4 結(jié)論

本研究通過組織分離、單孢純化，致病性測定，表明獲得的單孢菌株CBL-02，CBL-03和CBCB-02均可以引起側(cè)柏枝枯病。通過形態(tài)學以及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，證實分離獲得菌株為N.occulatum。