閭 星，竇桂銘，汪慧華，李如華，江澤平，李志朋，嚴(yán)東輝＊

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所 國家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 100085；3.北京市懷柔區(qū)園林綠化局，北京 101400）

植物根際微生物組與宿主互作機(jī)制和調(diào)控免疫抗病功能不斷被發(fā)現(xiàn)，在病害防控技術(shù)利用方面取得了突破性進(jìn)展，顯示植物微生物組為病害綠色防控提供了新型途徑[1]。植物種實(shí)也存在著豐富的微生物多樣性，這些微生物組在寄主幼齡階段的適應(yīng)性和病害防御中起著重要作用，并且對此后植物的種實(shí)健康發(fā)育、采后果實(shí)生理、品質(zhì)和安全都有不可忽視的影響[2]。但果實(shí)或種子微生物組結(jié)構(gòu)與功能作用還有待探索和了解，目前有報(bào)道的多是水果類果實(shí)，如蘋果[3-4]、芒果[5]、草莓[6]、西瓜[7]、桑葚[8]等，而堅(jiān)果類微生物組多樣性及其功能鮮有報(bào)道。內(nèi)生真菌作為植物微生物組核心類群，遍布植物各個組織器官，參與調(diào)控植物組織生長發(fā)育、脅迫適應(yīng)、進(jìn)化和生態(tài)功能演化的作用[9]。探索果實(shí)內(nèi)生真菌組多樣性和結(jié)構(gòu)，是揭示微生物組調(diào)控果實(shí)健康功能和機(jī)制的基礎(chǔ)。

中國板栗（Castanea mollissima BL.）屬于殼斗科Fagaceae栗屬Castanea植物，是最古老的馴化樹種之一（>3 500年）[10]，是我國重要的經(jīng)濟(jì)林樹種[11]，在世界板栗產(chǎn)業(yè)和經(jīng)濟(jì)中占有重要位置[12]，果實(shí)為堅(jiān)果。雖然，利用可培養(yǎng)技術(shù)，有限地分析過板栗營養(yǎng)器官根、莖和葉中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性和作用[13-14]，但研究材料主要來自于歐洲栗C.sativa[11]。而在微生物組群落水平上對內(nèi)生真菌組的結(jié)構(gòu)和多樣性的報(bào)道不多，尤其在板栗果實(shí)器官上的報(bào)道未見。鑒于健康板栗果實(shí)內(nèi)生真菌組對于建立綠色防控板栗果腐病技術(shù)的重要意義，我們采用ITS擴(kuò)增子高通量測序的微生物非培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合組織分離微生物可培養(yǎng)技術(shù)[15]，以中國板栗（燕山早豐、丹東板栗、大紅袍、毛板紅、泰山板栗和天師板栗）6個品種果實(shí)為研究材料，探究了不同品種果實(shí)間及其果殼、果肉間的內(nèi)生真菌群落組成和多樣性特征，為尋求和闡明內(nèi)生真菌組調(diào)控板栗果實(shí)健康機(jī)制，了解和掌握堅(jiān)果類果實(shí)微生物組的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 板栗果實(shí)材料

2020年9—10月在板栗主產(chǎn)區(qū)采收6個板栗品種果實(shí)材料，分別是燕山早豐、毛板紅、丹東板栗、大紅袍、天師板栗及泰山板栗（表1）。樣品裝于干凈透氣紙袋，不同地8～48小時(shí)低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃放置，并在兩周內(nèi)完成樣品預(yù)處理（核酸提取及分離培養(yǎng)）。

表1 板栗果實(shí)樣品采集信息Table 1 Collection information of chestnut fruit samples

1.2 果實(shí)樣品預(yù)處理

預(yù)處理分為樣品分組、表面消毒、組織分組和研磨分裝。

樣品分組：將果皮表面無蟲眼和病害癥狀的板栗浸泡在自來水中，去掉漂浮果粒（病果）。每品種隨機(jī)取18～30粒健康板栗，均分為3個組，即每組6～10粒，同品種3組互為生物學(xué)重復(fù)。

表面消毒：每組經(jīng)75%酒精浸泡3 min，2%NaClO溶液浸泡5 min，75 %酒精浸泡3 min，無菌水清洗3遍后，用無菌吸水紙吸除板栗表面水分。取最后一次清洗完后的無菌水100 μL涂布PDA平板，以檢測消毒是否徹底。

組織分組：無菌超臺中，在樣品分組的基礎(chǔ)上，按果實(shí)組織分成果殼（包括種皮）和果肉兩亞組。在此過程中，果實(shí)的子葉、種皮部位均未發(fā)現(xiàn)任何病害癥狀，表明所取樣品均為健康板栗。

研磨分裝：來自同一個生物學(xué)重復(fù)的果殼亞組和果肉亞組的材料分別用表面消毒后的研磨機(jī)（泰斯特，天津泰斯特儀器有限公司），高速粗打幾秒成碎粒（約5 mm），磨樣均分裝為兩份，一份用于可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的組織分離，另一份打成粉末凍存于?80 ℃用于擴(kuò)增子高通量測序。磨樣過程中，為防樣品殘留結(jié)轉(zhuǎn)，不同組不同亞組樣品變換時(shí)，研磨機(jī)均做充分消毒（超純水清洗3次+70%乙醇清洗1次+無菌水清洗2次）。

最后形成6個品種、2個組織、每個組織3個重復(fù)，共36個樣品，樣品記號請見正文。

1.3 DNA提取和ITS片段擴(kuò)增

用于非培養(yǎng)內(nèi)生真菌組測序的36個樣品基因組DNA的提取參照修改后的Aboul-Maaty等人的CTAB法[16]。將凍于?80 ℃的樣品材料取50 mg放入無菌研缽中，用液氮充分研磨裝于2 mL離心管中，后快速加入800 μL于65 ℃預(yù)熱的2% CTAB（0.1%β-巰基乙醇）提取液（酷來博）。6 mol.L?1NaCl溶液替換成5 mol.L?1NaCl溶液。其他步驟不變。50 μL 1×TE緩沖液溶解DNA，DNA濃度用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì) （Thermo Fisher Scientifific,Waltham,MA,USA）測定，濃度合格后交由北京奧維森公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Illumina MiSeq平臺測序，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镮TS1，引物為ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（G CTGCGTTCTTCATCGATGC）[17]。

分離培養(yǎng)獲得的真菌材料的基因組DNA采用修改后的CTAB法進(jìn)行提取[18]，ITS擴(kuò)增引物為ITS1和ITS4或者ITS5和ITS4[19]，擴(kuò)增序列交由上海生物工程有限公司測序。

1.4 Miseq測序及生信分析

下機(jī)讀段raw data經(jīng)過QIIME1（v1.8.0）[20]軟件根據(jù)Barcode序列拆分樣本，使用Pear（v0.9.6）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾、拼接，去除打分值低于20，含有模糊堿基，引物錯配序列。拼接時(shí)最小overlap設(shè)置為10 bp，錯配率為0.1。拼接后使用Vsearch（v2.7.1）軟件去除長度小于230 bp的序列，并根據(jù)Gold Database數(shù)據(jù)庫用uchime方法比對去除嵌合體序列，形成clean data。基于Unite數(shù)據(jù)庫[21]比對注釋后，使用Vsearch（v2.7.1）軟件uparse算法對優(yōu)質(zhì)序列以97%序列相似度劃分分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs）。利用 QIIME1（v1.8.0）軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)分析（包括Shannon、Chao指數(shù)），同時(shí)計(jì)算beta多樣性距離矩陣，綜合ANOSIM組間差異檢驗(yàn)結(jié)果，對樣本進(jìn)行NMDS非度量多維尺度分析。用Phython（v2.7）軟件進(jìn)行LEfSe分析，找出在不同分類水平對樣本結(jié)構(gòu)差異產(chǎn)生顯著性影響的類群。Miseq測序數(shù)據(jù)已上傳 NCBI（SUB9969166）。

1.5 內(nèi)生真菌的組織分離培養(yǎng)及分子鑒定

組織分離可培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基為MEA（90 mm皿），每皿7～8塊組織、每個樣品約350塊。25 ℃培養(yǎng)黑暗下生長5～7 d，挑取菌絲在相同培養(yǎng)基和條件下擴(kuò)培純化2周。以品種下的組織部位為最小劃分單元，單元總數(shù)為6（6個品種）×2（2個組織部位）=12個。依據(jù)菌落形態(tài)特征對同一單元內(nèi)部的分離菌株進(jìn)行初期歸類和數(shù)量統(tǒng)計(jì)，每單元中挑選出每類代表性菌落1株進(jìn)行分子鑒定菌種并相互印證形態(tài)歸類的一致性。

分子鑒定依據(jù)ITS序列在NCBI的BLASTn結(jié)果，參數(shù)為相似性（Identity>97%）、覆蓋率（Coverage>75%），并參考培養(yǎng)菌落性狀與模式菌種菌落形態(tài)、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建（ML法），限于篇幅，本研究鑒定過程數(shù)據(jù)未列出，直接應(yīng)用鑒定結(jié)果。菌種鑒定序列見NCBI序列號：OM574649-OM574769。

1.6 作圖與統(tǒng)計(jì)分析

非培養(yǎng)測序分析結(jié)果基于OTU物種注釋及相對豐度結(jié)果和Weighted Unifrace距離等，使用R（v3.6.0）軟件對物種組成柱狀圖，NMDS圖，韋恩圖進(jìn)行繪制。分離培養(yǎng)的內(nèi)生真菌種群多樣性組成和結(jié)構(gòu)分析用圖，依據(jù)數(shù)據(jù)在Excel（Office 2016）統(tǒng)計(jì)分析形成。所有數(shù)據(jù)在相同總數(shù)下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算形成可比較性，組內(nèi)組間數(shù)據(jù)依據(jù)分析處理需要或以重復(fù)平均值或以組合加減，柱狀圖形均采用相對豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗果實(shí)及其組織的內(nèi)生真菌組多樣性

經(jīng)過序列去噪和質(zhì)量過濾后，6個品種的果實(shí)及其2個組織共36個樣本總共產(chǎn)生3 229 205條符合質(zhì)量的序列，樣本序列數(shù)最少27 025條、最多 268 176 條，平均 89 700±52 015 （mean±SD）條序列，注釋出真菌OTUs 1 557個。

板栗果實(shí)內(nèi)生真菌群落存在豐富的多樣性（表2）。36個樣本中，Chao指數(shù)范圍為185.74±31.24（丹東板栗果殼部位）～343.67±34.96（天師板栗果肉部位）；Shannon指數(shù)范圍為1.86±1.12（毛板紅果殼部位）～4.97±0.48（燕山早豐果肉部位）。果殼和果肉組織間，果肉具有明顯高于果殼的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)。

表2 基于 Turkey 檢驗(yàn)的板栗果實(shí)內(nèi)生真菌群落Alpha多樣性指數(shù)分析Table 2 Alpha diversity index analysis of endophytic fungal community in chestnut fruit based on Turkey test

基于ANOSIM組間差異檢驗(yàn)的NMDS方法分析的Beta多樣性結(jié)果表明（圖1A-B），品種和組織樣品的內(nèi)生真菌群落構(gòu)成自身聚類，品種間（R=0.686 4，P=0.001）和組織間（R=0.190 7，P=0.002）內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)均存在顯著性差異。

圖1 板栗果實(shí)內(nèi)生真菌菌群品種間（A）和組織間（B）Beta多樣性Fig.1 Beta diversity analysis of endophytic fungal community between cultivars （A） and tissues （B） in chestnut fruits

2.2 板栗果實(shí)及其組織的內(nèi)生真菌群落組成與結(jié)構(gòu)

2.2.1 果實(shí)內(nèi)生真菌群落 來自于中國板栗6個品種的1 557個OTUs比對到10個門，38個綱，97個目，203個科，350個屬。門水平上，子囊菌門Ascomycota真菌為最優(yōu)勢類群，平均相對豐度為80.40%，其次為擔(dān)子菌門Basidiomycota真菌，平均相對豐度為7.7%（圖2門）。38個綱中（圖2綱），優(yōu)勢豐度類群主要?dú)w于糞殼菌綱Sordariomycetes（平均相對豐度43.00%）、酵母綱Saccharomycetes（平均相對豐度15.10%）；203個科單元中（圖2科），圓孔殼科Sporocadaceae平均相對豐度（11.59%）位于第一；350個屬中（圖2屬），有近13個屬平均相對豐度占比超過1%，包括擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、鐮孢屬Fusarium、青霉屬Penicillium、德巴利酵母屬Debaryomyces等，其中擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis平均相對豐度最高（8.95%）。6個板栗品種果實(shí)共享了103個OTUs（圖3左），全部來自座囊菌綱Dothideomycetes、古根菌綱Archaeorhizomycetes和一待定名綱的類群，其中座囊菌綱在共有綱類中占據(jù)了92%以上的豐度（表3），該綱共有6個目的類群在果實(shí)中發(fā)現(xiàn)，其中3個目格孢腔菌目Pleosporales、煤炱目Capnodiales和葡萄座腔菌目Botryosphaeriales的豐度占據(jù)近85%，格孢腔菌目的真菌豐度最高（55.34%）；3個目中，統(tǒng)計(jì)有19個科和29個屬的真菌豐度，其中豐度大于5%的科7個、豐度大于2%的屬有5個。屬水平上，枝孢屬Cladosporium的豐度最高（5.83%），其次為葡萄座腔菌屬Botryosphaeria（3.88%）。

表3 板栗果實(shí)品種間共享內(nèi)生真菌OTUs優(yōu)勢類群分析Table 3 Analysis of dominant groups of endophytic fungi OTUs shared among chestnut fruit varieties

圖2 板栗果實(shí)品種及組織內(nèi)生真菌菌群結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of endophytic fungal structure in different cultivars and tissues of chestnut fruit

圖3 板栗果實(shí)品種及組織內(nèi)生真菌操作分類單元（OTUs）分析Fig.3 Analysis of endophytic fungal OTUs in different cultivars and tissues of chestnut fruit

板栗果實(shí)品種間的內(nèi)生真菌組成結(jié)構(gòu)不同。從門水平來看（圖2門），子囊菌門Ascomycota和擔(dān)子菌門Basidiomycota類群相對豐度在燕山早豐、丹東板栗、大紅袍、毛板紅、泰山板栗及天師板栗中都處于第一和第二位置，其相對豐度分別為76.74%和5.07%、85.33%和5.59%、90.15%和3.98%、57.96%和23.71%、87.51%和4.56%、84.73%和3.28%。此外被孢霉門Mortierellomycota、球囊菌門Glomeromycota、羅茲菌門Rozellomycota以及壺菌門Chytridiomycota在這6個品種中也都占據(jù)一定豐度。還有4個門類真菌只出現(xiàn)在部分品種中，例如丹東板栗、大紅袍、毛板紅和泰山板栗中有少量毛霉菌門Mucoromycota真菌，而燕山早豐和天師板栗中則沒有；在綱層面（圖2綱），糞殼菌綱和座囊菌綱真菌是燕山早豐和天師板栗中的優(yōu)勢綱類群，其中糞殼菌綱相對豐度最高，在兩品種中相對豐度分別為29.47%、52.91%。大紅袍品種中優(yōu)勢綱由酵母綱（39.21%）、糞殼菌綱（32.52%）和散囊菌綱Eurotiomycetes（16.36%）組成。毛板紅品種中優(yōu)勢綱以糞殼菌綱（36.62%）、酵母綱（13.68%）和銀耳綱Tremellomycetes（18.82%）為主。糞殼菌綱（46.93%）、座囊菌綱（22.09%）和散囊菌綱（12.19%）真菌是泰山板栗中的優(yōu)勢類群。而丹東板栗中，僅糞殼菌綱真菌（59.56%）的相對豐度就接近60%；從科水平來看（圖2科），燕山早豐，泰山板栗和天師板栗品種中圓孔殼科相對豐度最高，其相對豐度分別為11.71%、18.41%和36.90%。而赤殼科Nectriaceae、小叢殼科Glomerellaceae則分別是丹東板栗和大紅袍、毛板紅品種中相對豐度最高的類群，其相對豐度分別為9.43%和23.62%、27.14%；屬水平上（圖2屬），以相對豐度>10%為界，大紅袍中有梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia（20.98%）、鐮孢屬Fusarium（20.23%）及青霉屬Penicillium（12.22%），毛板紅中為炭疽菌屬Colletotrichum（27.14%）和Guehomyces（12.93%），泰山板栗中為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis（18.19%）和青霉屬Penicillium（11.30%），天師板栗中則為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis（29.76%）和葡萄座腔菌屬Botryosphaeria（14.27%）。而燕山早豐和丹東板栗中，所有屬的相對豐度均在10%以下。燕山早豐中相對豐度大于5%的屬有5個，最高為青霉屬Penicillium（6.64%），最低為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis（5.15%）。丹東板栗相對豐度大于5%的屬有3個，分別是鐮孢屬Fusarium（8.64%）、擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis（7.60%）和梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia（5.59%）。

2.2.2 果實(shí)組織的內(nèi)生真菌群落 果殼和果肉在門水平上內(nèi)生真菌群落組成結(jié)構(gòu)相似，但同一門內(nèi)，除子囊菌門的豐度是果肉（72.13%）小于果殼（88.61%）外，果肉中其他門的豐度都明顯高于果殼（圖2）；綱水平上（圖2），糞殼菌綱在不同組織中相對豐度均為最高，且果殼（58.69%）是果肉（27.24%）的2倍，而酵母菌綱在果肉中（21.99%）是果殼（8.27%）的近3倍；在科層面（圖2），16個科的相對豐度占比超過1%。德巴利酵母菌科在果肉中的豐度最高（9.95%），圓孔殼科在果殼中的豐度最高（18.73%）。屬水平上（圖2），17個屬相對豐度占比超過1%，包括擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、炭疽菌屬Colletotrichum、梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、鐮孢屬Fusarium等。

按照專性分布數(shù)目、分類單元、相對豐度>0.5%，列出了各分類階級水平的真菌群落分布情況（表4）。專性果肉分布的真菌群落多樣性均明顯高于果殼，并以高級分類階級門、綱和目最為突出，果肉分別有2、7和15個單元，而果殼中缺乏門和綱的單元，僅在目中出現(xiàn)1個冠囊菌目Cronophorales。果肉專性分布的最優(yōu)勢類群，門以下均為擔(dān)子菌，銀耳綱、紅菇目Russulales、紅菇科Russulaceae、馬拉色菌科Malasseziacea、以及Mycoacia屬；而果殼中專性分布的目和科最優(yōu)勢類群均為子囊菌，冠囊菌目、夾孢腔菌科Sporormiaceae，但屬中是擔(dān)子菌酵母Rhodosporidiobolus屬豐度最高。

表4 板栗果實(shí)組織間共享內(nèi)生真菌OTUs優(yōu)勢類群分析Table 4 Analysis of dominant groups of endophytic fungi OTUs shared among chestnut fruit tissues

2.2.3 果實(shí)組織間顯著差異性群落和種群 多級物種層級分析LEfSe顯示（圖4），板栗果實(shí)果殼和果肉在不同分類階級水平上存在顯著性差異群落組成或種群。依LDA score>4及點(diǎn)分支圖分析，門水平中的子囊菌門和擔(dān)子菌門，綱水平的糞殼菌綱、銀耳綱和酵母綱，屬水平中的鐮孢屬Fusarium、梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、邁耶氏酵母屬M(fèi)eyerozyma和德巴利酵母屬Debaryomyces以及種水平的梅奇酵母菌Metschnikowia sp.、漢斯德巴利酵母菌Debaryomyces hansenii、卡利比克邁耶氏酵母Meyerozyma caribbica和Fusarium guttiforme,這些群落或種群對果殼和果肉間差異具有顯著影響。

圖4 板栗果實(shí)組織間內(nèi)生真菌菌群差異分析Fig.4 Analysis of differences in endophytic fungal community among chestnut fruit tissues

2.3 可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌群落

傳統(tǒng)組織分離法共獲得有效菌株2 346株，代表性菌落共計(jì)120株，依ITS序列、菌落形態(tài)及系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定出76個種（表5），可歸于33屬、22科、13目、7綱、3門（圖5）。6個品種間的相同分類單元合并并相加分離頻次除以有效菌株數(shù)作為相對豐度值。依豐度由高到低，形成了板栗果實(shí)可培養(yǎng)的內(nèi)生真菌群落分布情況（圖5）。門和綱水平上，分離頻次豐度最高的是子囊菌門Ascomycota和糞殼菌綱Sordariomycetes，散囊菌綱Eurotiomycetes、座囊菌綱Dothideomycetes、毛霉菌綱Mucoromycetes也較高頻次分離到。目和科水平上，間座殼目Diaporthales和夾孢腔菌科Sporocadaceae的豐度分別最高；新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopis在屬階級中分離頻次豐度最高。果肉和果殼組織分離到的最高頻次的類群或種群基本一致（表6），門、綱、目水平中，分別為子囊菌門、糞殼菌綱、間座殼目，但果殼（40.13%～71.34%）中的豐度明顯高于果肉（10.82%～19.52%）；科和屬水平中，果殼是日規(guī)殼科Gnomoniaceae（21.34%）和梨孢日規(guī)殼屬Apiognomona（16.29%）、果肉是間座殼科Diaporthaceae（8.57%）和間座殼屬Diaporthe（8.57%）。各階級中的組成單元數(shù)上，門、綱、目水平，果肉多于果殼；科和屬水平，果殼多于果肉；同一分類單元，果殼的豐度往往高于果肉。

表5 板栗果實(shí)可培養(yǎng)內(nèi)生真菌分離結(jié)果Table 5 Isolation results of cultrable endophytic fungi from chestnut fruit

續(xù)表5

表6 板栗果實(shí)組織間可培養(yǎng)內(nèi)生真菌在各分類階級上的分布情況Table 6 Distribution of culturable endophytic fungi among chestnut fruit tissues in different taxonomic classes

圖5 板栗果實(shí)可培養(yǎng)內(nèi)生真菌在各分類階級上的分布情況Fig.5 Distribution of cultrable endophytic fungi from chestnut fruits in different taxonomic classes

3 討論

3.1 板栗果實(shí)內(nèi)生真菌組群落結(jié)構(gòu)及其組成

中國板栗果實(shí)具有豐富的內(nèi)生真菌群落多樣性（表1），且其內(nèi)生真菌群主要以子囊菌門和擔(dān)子菌門（門水平）、糞殼菌綱和酵母綱（綱水平）、圓孔殼科（科水平）以及包括擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis在內(nèi)的13個屬（屬水平）等為優(yōu)勢類群的群落構(gòu)成。該結(jié)果與其他果實(shí)的研究報(bào)道一致[3,8]，并被認(rèn)為是子囊菌真菌具有更快的進(jìn)化速率和適應(yīng)性從而形成更高多樣性的結(jié)果[22]。6個品種間果實(shí)共有（shared）種群則全部為子囊菌，其中優(yōu)勢綱類和優(yōu)勢目類分別是座囊菌綱（豐度>90%）和格孢腔菌目（豐度近50%）（表3）；優(yōu)勢種群（>2%）可能來自枝孢屬Cladosporium、葡萄座腔菌屬Botryosphaeria、彎孢屬Curvularia、球腔菌屬Phaeosphaeria 和亞球殼屬Sphaerulina（表3）。這些來自上述共有優(yōu)勢屬的種群可能是中國板栗果實(shí)內(nèi)生真菌的建群種群。

數(shù)據(jù)顯示板栗果實(shí)品種間的內(nèi)生真菌群落組成結(jié)構(gòu)具有明顯差異（圖2），不同品種板栗果實(shí)均以子囊菌門為最優(yōu)勢類群（圖2門），其次是擔(dān)子菌門，但包括毛霉菌門在內(nèi)的其他4個門的真菌只出現(xiàn)在丹東板栗、大紅袍、毛板紅和泰山板栗中。綱水平開始優(yōu)勢類群出現(xiàn)不同，毛板紅品種中相對豐度最高的是酵母菌綱真菌，而另外5個板栗品種中最豐富類群為糞殼菌綱真菌（圖2綱）。在科水平（圖2科），圓孔殼科是燕山早豐，泰山板栗和天師板栗中最豐富的類群，而赤殼科、小叢殼科則分別是丹東板栗和大紅袍、毛板紅品種中相對豐度最高的類群。在屬層面，品種間的群落組成結(jié)構(gòu)差異更大（圖2屬）。優(yōu)勢屬（相對豐度>10%）在大紅袍中為梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、鐮孢屬Fusarium及青霉屬Penicillium，毛板紅中為炭疽菌屬Colletotrichum和Guehomyces，泰山板栗中為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis和青霉屬Penicillium，天師板栗中則為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis和葡萄座腔菌屬Botryosphaeria。燕山早豐中優(yōu)勢屬（相對豐度>5%）由包括青霉屬Penicillium在內(nèi)的5個屬組成，而以鐮孢屬Fusarium為首的3個屬則是丹東板栗中的優(yōu)勢屬。這些材料來自從北到南的華北和華東板栗主產(chǎn)區(qū)或分布區(qū)，因此，我們認(rèn)為這些差異代表了地理區(qū)域性或品種的遺傳屬性[23-25]。

可培養(yǎng)方法得到的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述論證，在分離獲得的內(nèi)生真菌種類中，有80%的種類屬于子囊菌門，11%的屬于毛霉菌門，余下種類屬于擔(dān)子菌門；綱和科水平上，豐度最高的分別是糞殼菌綱（>60%）和圓孔殼科（>20%）；屬階級上豐度>5%的優(yōu)勢種群來自包括有擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis、青霉屬Penicillium、炭疽菌屬Colletotrichum、葡萄座腔菌屬Botryosphaeria、鐮孢屬Fusarium等（圖5）。另一方面，缺失高通量測序技術(shù)檢測的優(yōu)勢酵母菌種群，說明了可培養(yǎng)方法的局限性，需要增加酵母類選擇性培養(yǎng)基予以改進(jìn)[26]。

3.2 板栗果實(shí)組織內(nèi)生真菌群落組成特點(diǎn)

板栗果實(shí)果肉組織多樣性高于果殼組織，這與蘋果果實(shí)的研究結(jié)果相反，蘋果果實(shí)的果皮（外果皮）組織中真菌多樣性要高于果肉（中果皮）組織[3]。果實(shí)不同組織部位具有不同的真菌群落[3,27]，如蘋果果實(shí)不同部位（莖末端、花萼末端、果皮和果肉）中真菌類群組成顯著不同[3]。板栗果實(shí)根據(jù)形態(tài)差異分為果殼（果皮）、種皮和子葉、胚軸等部分，本研究將果皮和種皮合并為果殼材料，將子葉（含胚軸）稱為果肉材料。這些組織部位不同的物理和化學(xué)性質(zhì)可能對棲息在該微環(huán)境中的真菌物種產(chǎn)生影響[24]。我們的研究發(fā)現(xiàn)板栗果肉比果殼具有更高的特有內(nèi)生真菌多樣性（圖3右），一是專性分布果肉組織的內(nèi)生真菌OTUs數(shù)多出果殼組織102個（圖3右），二是專性分布的真菌在各級分類水平中，果肉中內(nèi)生真菌組成單元數(shù)明顯均高于果殼（表4），三是特有優(yōu)勢類群在果肉和果殼中不同（表4），果肉為毛霉門、擔(dān)子菌的紅菇目、紅菇科和馬拉色菌科、Mycoacia；而果殼屬于子囊菌的冠囊菌目、夾孢腔菌科，屬卻屬于擔(dān)子菌的Rhodosporidiobolus。

LEfSe分析表明（圖4），在具有顯著差異群落中，鐮孢屬Fusarium、梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、邁耶氏酵母屬M(fèi)eyerozyma和德巴利酵母屬Debaryomyces真菌在果肉組織中占據(jù)顯著性優(yōu)勢。板栗果肉組織中具有顯著性優(yōu)勢的酵母真菌種群或其群落組成與結(jié)構(gòu)，可能在板栗果實(shí)健康中起著重要的作用。梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia[28-30]，德巴利酵母屬D.hansenii[31]和邁耶氏酵母屬M(fèi).caribbica[29]真菌，報(bào)道為具有益生和生防作用的功能菌。糞殼菌綱和酵母綱的真菌在板栗果肉果殼組織中，豐度高，而這兩類真菌中，多為促生[32-33]和拮抗種群[34-35]。板栗果實(shí)腐爛病發(fā)生在果肉（子葉）組織上，是由多種病原真菌在果實(shí)生長發(fā)育期潛伏侵染、成熟期和采后內(nèi)在或環(huán)境誘發(fā)因子作用下形成發(fā)病高峰期的復(fù)合侵染性病害，病原種類高達(dá)幾十種[36-38]。這些病原菌的同種或相似種類，在無癥狀板栗果實(shí)中，經(jīng)高通量測序技術(shù)的非培養(yǎng)技術(shù)和組織分離的可培養(yǎng)方法中，都檢測或分離到。

4 結(jié)論

本研究利用非培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合可培養(yǎng)方法，對板栗果實(shí)及其組織的內(nèi)生真菌群落多樣性進(jìn)行了研究報(bào)道。板栗果實(shí)具有豐富的內(nèi)生真菌群落多樣性，優(yōu)勢群落來自子囊菌的糞殼菌綱和酵母菌綱，但建群種類來自座囊菌綱。板栗果實(shí)品種間的內(nèi)生真菌群落組成結(jié)構(gòu)具有明顯差異。果肉組織中種類豐度和群落多樣性顯著高于果殼。同時(shí)板栗果肉和果殼組織內(nèi)生真菌群落組成具有明顯分化，果肉內(nèi)生真菌群落的特有類群由擔(dān)子菌的銀耳綱等構(gòu)成，鐮孢屬Fusarium、梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia、邁耶氏酵母屬M(fèi)eyerozyma和德巴利酵母屬Debaryomyces真菌在果肉組織中具有顯著優(yōu)勢。上述研究結(jié)果為利用微生物組技術(shù)改造和構(gòu)建板栗果實(shí)健康微生物組奠定了基礎(chǔ)，也為研究堅(jiān)果類微生物組與宿主互作機(jī)制提供了認(rèn)知，拓展了種子微生物組的知識。同時(shí)，各分類水平中存在的高豐度未鑒定OTUs，為挖掘新的內(nèi)生真菌生物資源奠定了基礎(chǔ)。