郭晨旭，李發(fā)展，劉斌，溫慧娟，米陽，鄭鵬遠(yuǎn)

(1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院 a.馬歇爾醫(yī)學(xué)研究中心；b.消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河南 鄭州 450052)

最新研究顯示，胃癌是全球第五大常見癌癥，是引起死亡的第四大癌癥，在中國胃癌是第三大常見癌癥，是引起死亡的第三大癌癥[1]。遺傳、幽門螺桿菌感染、不健康的生活方式(包括吸煙、飲酒、亞硝酸鹽攝入過多、攝食纖維性食物過少)均是胃癌的風(fēng)險因素[2]。其發(fā)病機(jī)制仍不完全明確，上述致癌因素引起的原癌基因激活是其重要的分子機(jī)制。因此，發(fā)現(xiàn)新的胃癌診斷治療靶點(diǎn)對于胃癌的診治具有較大的意義。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合生物信息學(xué)分析，越來越多的致病基因被發(fā)現(xiàn)，極大推動了胃癌的發(fā)病機(jī)制及精準(zhǔn)治療研究，由于低免疫原性，胃癌免疫治療的效果不佳[3]。因此，篩選與免疫浸潤相關(guān)的基因可能有助于增強(qiáng)胃癌免疫治療的效果，對胃癌的診療有重要的意義。CSRP1是一種蛋白質(zhì)編碼基因，編碼半胱氨酸和甘氨酸富含蛋白質(zhì)家族成員[4]，是一種有效的生長因子，可參與發(fā)育及細(xì)胞分化過程[5]。已有研究表明，CSRP1在肝癌、直腸癌等腫瘤中發(fā)揮了一定的作用[6-7]。但其在胃癌中的應(yīng)用還缺乏相應(yīng)的報道。因此，本研究應(yīng)用大數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析來探討CSRP1在胃癌中的發(fā)生機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)的獲取和處理從美國腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載407例樣本基因表達(dá)數(shù)據(jù)(包含胃癌組織375例，正常胃黏膜32例)以及匹配的臨床數(shù)據(jù)，如年齡、性別、腫瘤階段、TNM分期、生存狀態(tài)等數(shù)據(jù)(項目ID：TCGA-STAD)。

1.2CSRP1與胃癌臨床病理分期的關(guān)系分析CSRP1與胃癌患者T、N分期的關(guān)系，使用單因素和多因素Cox回歸分析對胃癌患者的CSRP1、性別、年齡及T、N分期進(jìn)行風(fēng)險評估。

1.3CSRP1高表達(dá)和低表達(dá)組間差異分析和生存曲線繪制根據(jù)CSRP1基因表達(dá)中位數(shù)，將胃癌樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。首先使用“l(fā)imma”在R軟件中計算兩組樣本間的差異基因，并使用“ggplot”包和“heatmap”包繪制差異基因的熱圖和火山圖(|logFC|>0.5，P<0.05)，最后使用R軟件“survival”包繪制生存曲線，得出CSRP1表達(dá)水平和生存的關(guān)系。

1.4 差異基因的富集分析使用DAVID(v6.8)(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步將加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(基于基因的共表達(dá)關(guān)系，將基因聚類成多個不同模塊的算法)得到的與胃癌患者生命狀態(tài)相關(guān)的模塊進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析，以明確該模塊中的基因所涉及的生物學(xué)過程、分子功能及細(xì)胞定位，同時進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，以便于明確這些基因參與的代謝途徑及信號通路。

1.5 差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析將得到的差異基因?qū)隨TRING(v11.5)(https://string-db.org/cgi/)在線網(wǎng)站，構(gòu)建其編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。然后將得到的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape(v3.7.2)進(jìn)行處理。在Cytoscape中，運(yùn)行cytoHubba插件篩選出相關(guān)性最好的前15個基因。使用單因素Cox回歸分析評估15個基因的風(fēng)險率，篩選出與患者生存相關(guān)的核心基因。在Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)在線網(wǎng)站中繪制核心基因在胃癌患者中的生存曲線，并在TIMER(v2.0)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)在線網(wǎng)站中探索與CSRP1的相關(guān)性。

1.6CSRP1與免疫浸潤的關(guān)系基于TIMER(v2.0)和Cibersort(https://cibersort.stanford.edu/)2種免疫細(xì)胞浸潤分析工具評估CSRP1與多個免疫細(xì)胞的相關(guān)性，進(jìn)一步探索CSRP1與免疫細(xì)胞的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1CSRP1表達(dá)與臨床分期的關(guān)系基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息，對CSRP1的表達(dá)水平及患者臨床特征進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，隨著腫瘤浸潤程度的增加，CSRP1的表達(dá)水平升高(見圖1A)，并且CSRP1水平的升高和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系(見圖1B)。單因素和多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)CSRP1、年齡及T、N分期均可以作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)(見圖1C和圖1D)。

A、B為CSRP1表達(dá)水平與腫瘤T、N分期的關(guān)系；C、D為單因素、多因素Cox回歸分析評估CSRP1與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。

2.2CSRP1的差異基因表達(dá)情況及CSRP1和生存的關(guān)系根據(jù)CSRP1的差異基因繪制熱圖和火山圖，共發(fā)現(xiàn)765個上調(diào)基因和246個下調(diào)基因(見圖2A和圖2B)。在TCGA-STAD腫瘤樣本中，根據(jù)CSRP1的中位表達(dá)水平將胃癌樣本分成高表達(dá)組和低表達(dá)組。生存分析顯示，高表達(dá)CSRP1的患者預(yù)后不良，生存期短于低表達(dá)組(P<0.05)，見圖2C。

A、B為CSRP1高表達(dá)組和低表達(dá)組胃癌樣本間差異基因的熱圖和火山圖；C為使用Kaplan-Meier法分析基于CSRP1表達(dá)水平的胃癌患者的生存曲線。

2.3 富集分析對上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析(見圖3A～D)。結(jié)果顯示，在GO富集分析中，下調(diào)的差異基因主要富集在核溶解、細(xì)胞分裂和染色體斷裂中；上調(diào)的差異基因主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外骨架結(jié)構(gòu)中。在KEGG通路富集中，下調(diào)的差異基因主要富集在細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老中；上調(diào)的差異基因主要富集在細(xì)胞黏附及PI3K-Akt信號通路上。

A為上調(diào)的差異基因GO富集；B為上調(diào)的差異基因KEGG富集；C為下調(diào)的差異基因GO富集；D為下調(diào)的差異基因KEGG富集。

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)基于STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Cytoscape進(jìn)行可視化處理(見圖4A)，確定了14個和CSRP1高度相關(guān)的蛋白質(zhì)。使用單因素Cox回歸分析評估14個蛋白的編碼基因在樣本中的風(fēng)險率，P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)(見圖4B)。其中ACTA2基因與胃癌患者預(yù)后存在相關(guān)性(P=0.014)，基于TIMER在線網(wǎng)站對CSRP1和ACTA2的相關(guān)性進(jìn)行驗證(見圖4C)，發(fā)現(xiàn)ACTA2與CSRP1高度相關(guān)(r=0.805)。對ACTA2進(jìn)行生存分析(見圖4D)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ACTA2的胃癌患者預(yù)后較差，與CSRP1結(jié)果一致。

A為CSRP1相關(guān)性最高的14個基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；B為14個基因在胃癌中的單因素Cox回歸分析；C為ACTA2與CSRP1的相關(guān)性散點(diǎn)圖；D為ACTA2的表達(dá)水平與胃癌患者的生存曲線的關(guān)系。

2.5CSRP1與免疫細(xì)胞的關(guān)系基于TIMER在線網(wǎng)站分析CSRP1與6種主要免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CSRP1的表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞相關(guān)(見圖5A)。為了一步探索CSRP1與免疫細(xì)胞的關(guān)系，根據(jù)不同免疫細(xì)胞的標(biāo)志基因的表達(dá)量對胃癌樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的免疫細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行量化，并繪制胃癌組織樣本中每種免疫細(xì)胞的浸潤水平相關(guān)圖(見圖5B)。根據(jù)CSRP1表達(dá)水平中位數(shù)將樣本分成高、低兩組，比較兩組免疫細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果顯示，CSRP1表達(dá)水平和活化的CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見圖5C。

A為CSRP1與6種免疫細(xì)胞的相關(guān)性散點(diǎn)圖；B為胃癌中免疫細(xì)胞的相關(guān)性圖；C為不同免疫細(xì)胞在CSRP1高表達(dá)組和低表達(dá)組中的浸潤差異。

3 討論

已有研究證明，CSRP1在不同腫瘤或者同一腫瘤的不同階段表達(dá)不同[8]。CSRP1在多種腫瘤中發(fā)揮作用，有研究指出，在結(jié)直腸癌中，CSRP1是潛在的抑癌基因[6]。在乳腺癌中，CSRP1扮演著十分重要的RNA結(jié)合蛋白的角色[9]。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)塞來昔布能夠通過抑制CSRP1的表達(dá)產(chǎn)生抗胃癌作用。本研究基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CSRP1高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后不良；同時，CSRP1、年齡及腫瘤的T、N分期均可以作為胃癌預(yù)后的獨(dú)立因子。對CSRP1相關(guān)的差異基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要集中在核溶解、細(xì)胞黏附、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞衰老等重要功能中；對關(guān)鍵差異基因進(jìn)行蛋白互作，確定了與CSRP1相關(guān)的14個基因，對這14個相關(guān)基因進(jìn)行篩選，進(jìn)一步確定了高度相關(guān)基因ACTA2，該基因編碼球狀肌動蛋白[11]。研究表明，高表達(dá)ACTA2的肺癌患者預(yù)后不佳，降低ACTA2的表達(dá)水平可使肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力下降[12]。ACTA2也參與HER2基因陽性的乳腺癌的轉(zhuǎn)移[13]。進(jìn)一步驗證ACTA2與CSRP1的相關(guān)性并進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示高表達(dá)ACTA2基因的胃癌患者預(yù)后不佳，與CSRP1對胃癌患者的預(yù)后一致。同時，腫瘤的免疫治療是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，而腫瘤微環(huán)境對腫瘤的免疫療法起著至關(guān)重要的作用[14]。腫瘤微環(huán)境包括細(xì)胞成分和非細(xì)胞成分，細(xì)胞成分如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞，非細(xì)胞成分包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因子等[15]。為了探討CSRP1在胃癌患者免疫治療中的潛在作用，通過分析CSRP1與免疫細(xì)胞的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)CSRP1的表達(dá)水平和活化的CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)。T細(xì)胞是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，亞型較多，如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及調(diào)節(jié)T細(xì)胞等[16]。有研究指出，CD4+T細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的間接方式或者直接通過細(xì)胞溶解機(jī)制消除腫瘤細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞也可以增強(qiáng)B細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)和強(qiáng)度，協(xié)助啟動CD8+T細(xì)胞的基因表達(dá)程序，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞毒性功能[17]。有研究顯示，具有高豐度CD4+記憶T細(xì)胞的胃癌患者預(yù)后較好[18]。本研究結(jié)果顯示，高表達(dá)CSRP1胃癌患者的CD4+T細(xì)胞浸潤水平較低，預(yù)后較差，與上述研究結(jié)果[18]一致。輔助T細(xì)胞是產(chǎn)生高親和力抗體所必需的細(xì)胞，同時輔助T細(xì)胞可以分泌白細(xì)胞介素-21和白細(xì)胞介素-4，輔助T細(xì)胞缺乏可能導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸，影響胃癌患者預(yù)后[19]。樹突狀細(xì)胞是專門的抗原提呈細(xì)胞，可以識別外來的病原體或者體內(nèi)異常的腫瘤抗原并將其提呈給T細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞的代謝控制著其發(fā)育和成熟過程，可通過代謝調(diào)節(jié)增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力，改善腫瘤免疫療法[20]。自然殺傷細(xì)胞在自身免疫系統(tǒng)對抗腫瘤中發(fā)揮著重要的作用，一旦被激活，可分泌細(xì)胞毒性因子靶向殺死癌細(xì)胞。Pernot等[21]研究表明，腫瘤微環(huán)境中自然殺傷細(xì)胞的比率影響胃癌患者的預(yù)后。Ishikawa等[22]研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增自然殺傷細(xì)胞與IgG1抗體結(jié)合治療晚期胃癌，可獲得較好效果。

綜上所述，CSRP1表達(dá)水平和多種免疫細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)，表明CSRP1可通過影響腫瘤的免疫浸潤減弱胃癌患者的免疫應(yīng)答，預(yù)后較差，考慮CSRP1可能成為胃癌免疫治療的新靶點(diǎn)。