張繼川，何嚴萍，王月平**

(1.昆明理工大學 理學院 應用化學系，云南 昆明 650500；2.云南大學 教育部自然資源藥物化學重點實驗室，化學科學與工程學院，云南 昆明 650091)

新冠肺炎(COVID-19)是在2019 年底由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)所導致的在全球流行的傳染病[1]，對人類健康及公共安全造成極大危害.截止2021 年9 月，全球累計感染人數(shù)已超過2 億，死亡人數(shù)已達450 萬[2].雖然目前已有多種疫苗上市，但是病毒的變異使得疫苗有效性降低，且依然有相當一部分人口未能接種疫苗[3].因此，研發(fā)針對新冠病毒的藥物依然迫在眉睫.

SARS-CoV-2 病毒屬于套式病毒目冠狀病毒科的正鏈RNA 病毒[4].病毒基因組編碼的主要蛋白質(zhì)有復制酶多聚蛋白pp1a 和pp1b，類木瓜蛋白酶(PLpro)，3CL 蛋白酶和S、E、M、N 結(jié)構(gòu)蛋白[5].其中，多聚蛋白被類木瓜蛋白酶和3CL 蛋白酶水解，裁剪出16 個病毒所需的功能蛋白(如RNA 依賴的RNA 聚合酶，解旋酶等)，只有在這些功能蛋白的參與下，病毒才能進行轉(zhuǎn)錄與復制[6].因此，3CL 蛋白酶對多聚蛋白的成熟起主要作用，是病毒復制與繁殖的關(guān)鍵酶[7].同時，尚未發(fā)現(xiàn)3CL 蛋白酶的人類同源蛋白，這使得它成為抗SARS-CoV-2病毒藥物的重要靶點[8].

3CL 蛋白酶為半胱氨酸蛋白酶，其催化活性中心由半胱氨酸(Cys145)和組氨酸(His41) 二聯(lián)體構(gòu)成.其中，Cys145 為親核進攻基團，His41 則為酸-堿催化殘基[9].基于3CL 酶的催化作用機理，現(xiàn)已設(shè)計并發(fā)現(xiàn)多種肽類和擬肽類3CL 蛋白酶抑制劑[10]，此類抑制劑通常含有一個親電反應基團，如：醛基[11]，鹵甲基酮基[12]，α-酮酰胺[8]，Michael 受體[7]，氰基[13]等，它們能和Cys145 殘基中的S 原子共價結(jié)合而使3CL 酶失活.但是，肽類化合物固有的代謝不穩(wěn)定性和選擇性問題[14]，影響了其成藥性.因此，研發(fā)具有新作用機制的小分子3CL 酶抑制劑成為當前抗SARS-CoV-2 病毒藥物研究的熱點[15-22].

基于SARS-CoV-2 3CL 蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)，采用多種藥物開發(fā)策略，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種能與3CL 酶非共價結(jié)合的底物競爭型抑制劑[17,19,23-25].其中，Ghahremanpour 等[26]采用老藥新用策略，綜合利用分子對接及分子動力學模擬，從3CL 蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，對2 000 多個上市藥物進行虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)14 個藥物能抑制3CL 蛋白酶活性.隨后，他們以抗癲癇藥物吡侖帕奈(Perampanel)為先導化合物，采用自由能微擾方法(FEP)指導抑制劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計合成了系列三芳基吡啶酮類化合物，能在納摩爾濃度范圍抑制3CL 蛋白酶活性及SARS-CoV-2 病毒的復制[27]，具有深入研究的價值.

本文采用比較分子力場分析(CoMFA)[28]，對此類3CL 蛋白酶抑制劑的構(gòu)效關(guān)系進行了深入研究，建立了具有良好預測能力的定量構(gòu)效關(guān)系模型.并以此為指導，設(shè)計了一系列新型三芳基吡啶酮類化合物，經(jīng)模型預測，所設(shè)計化合物對3CL 蛋白酶均有很好的抑制活性.本研究為新型SARSCoV-2 病毒抑制劑的設(shè)計和優(yōu)化提供了參考.

1 計算方法

1.1 化合物及活性數(shù)據(jù)本文構(gòu)效關(guān)系分析所用的38 個三芳基吡啶酮類化合物引自文獻[27]，活性指標用化合物抑制3CL 蛋白酶活性的半數(shù)有效濃度IC50(mol/L)的負對數(shù)pIC50(-logIC50)表示.抑制劑分子結(jié)構(gòu)如圖1 和表1 所示，其中化合物11和34的結(jié)構(gòu)在表1 末尾單獨列出，生物活性數(shù)據(jù)見表2.其中，隨機選取了30 個化合物作為訓練集建立模型，其余8 個化合物為測試集（表1 中用*號標注的分子）用于檢驗模型的預測能力.

表1 三芳基吡啶酮類化合物化學結(jié)構(gòu)Tab.1 Structures of triarylpyridinone derivatives

續(xù)表 1

表2 實驗活性值與CoMFA 預測值得比較Tab.2 The comparison of experimental and predicted activities of triarylpyridinone derivatives by CoMFA model

圖1 三芳基吡啶酮類化合物公共結(jié)構(gòu)Fig.1 The common substructure of the triarylpyridinone derivatives

1.2 分子模型的建立抑制劑分子結(jié)構(gòu)采用SYBYL7.2[29]分子模擬軟件的Base/Build 模塊構(gòu)建，計算過程中未明確說明的參數(shù)均采用默認值.從化合物32和3CL 酶復合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB 代碼：7L13)中剝離出小分子抑制劑，以其為模板構(gòu)建其余各分子的初始構(gòu)象.隨后在MMFF94 力場下，采用Powell 能量梯度法進行分子力學優(yōu)化，能量梯度收斂標準為0.004 kJ/mol，最大迭代次數(shù)為5 000，優(yōu)化后得到的各個分子的低能構(gòu)象用于后續(xù)構(gòu)效關(guān)系研究.

1.3 分子對接在CoMFA 模型構(gòu)建過程中，抑制劑分子的活性構(gòu)象及其疊合方式直接影響著模型的預測能力與等勢面圖的可靠性.本文采用分子對接軟件LeDock[30]獲得小分子的活性構(gòu)象.對接所用的大分子結(jié)構(gòu)來自復合物晶體(PDB 代碼：7L13)，采用LeDock 中的Lepro 模塊進行預處理：加氫，刪除配體和水分子后作為3CL 酶的三維結(jié)構(gòu)模型，隨后用其活性腔與目標分子對接.最后根據(jù)抑制劑與酶相互作用能量大小和幾何構(gòu)型匹配程度確定抑制劑的活性構(gòu)象.

1.4 CoMFA 模型的建立以活性最好的化合物32 為模板，以其公共骨架（圖2（a）加粗部分）為疊合位點，采用Align Database 模塊對其余37 個化合物的活性構(gòu)象進行疊合（圖2（b）），由圖2（b）可見各化合物和3CL 酶的結(jié)合模式很相似，各取代基空間伸展方向幾乎一致，表明此類化合物以相同的方式作用于3CL 酶.隨后，將疊合好的小分子置于一間距為0.2 nm 的三維網(wǎng)格之中，采用帶一個正電荷的sp3雜化C 原子為探針，分別計算出各格點上的靜電能及立體作用能，作為CoMFA 模型的自變量，然后采用偏最小二乘法（PLS）分析其和化合物生物活性pIC50的關(guān)系，用抽一法（LOO）進行交叉驗證，確立主成分數(shù)（NOC）并建立相應的CoMFA模型[21,26].

圖2 化合物32 為模板的分子構(gòu)象疊合Fig.2 The alignment of the conformations of the molecules taking compound 32 as template molecule

2 結(jié)果與討論

2.1 對接分析本文采用分子對接來確定各抑制劑的活性構(gòu)象.為驗證所用對接方法的可靠性，我們將化合物32 用LeDock 對接到與其結(jié)合的3CL酶的結(jié)合腔內(nèi).隨后，以32 在晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)合構(gòu)象為參考，計算其均方根偏差(RMSD)[31]為0.322，如圖3 所示，兩者結(jié)構(gòu)高度重疊，化合物32 的A、C、D 及E 環(huán)分別結(jié)合于3CL 酶的S1′、S1、S2 及S4 位點，表明LeDock 能準確預測抑制劑和3CL酶的結(jié)合模式.可用LeDock 預測各化合物的活性構(gòu)象.

圖3 預測結(jié)構(gòu)(元素顏色)與晶體結(jié)構(gòu)(青色)的比較Fig.3 Superimposition between the predicted pose (color by element) and the crystal pose (cyan)

2.2 CoMFA 模型分析CoMFA 模型統(tǒng)計分析結(jié)果列于表3，其對各化合物生物活性的預測值及殘差見表2，活性數(shù)據(jù)的實驗值和預測值的相關(guān)圖見圖4.其中，CoMFA 模型的抽一交叉驗證相關(guān)系數(shù)為0.810，非交叉驗證相關(guān)系數(shù)為0.981，其對測試集化合物的活性預測值偏差較小(表3)，預測值與實驗值的相關(guān)系數(shù)r2pred為0.855，表明所建立的CoMFA模型具有較高的置信度和較強的預測能力[32].

圖4 訓練集和測試集中三芳基吡啶酮類化合物的pIC50 實驗值與預測值對比Fig.4 The plots of the predicted versus experimental pIC50 values for the training and test sets of the triarylpyridinone derivatives

表3 最佳CoMFA 模型統(tǒng)計數(shù)據(jù)Tab.3 Statistical parameters of best CoMFA model

CoMFA 分析結(jié)果顯示立體場和靜電場相互作用對活性的貢獻分別為63.6%和36.4%，表明立體場對抑制劑分子與3CL 酶的相互作用的影響更為明顯.圖5（a)為表征CoMFA 立體場特征的等勢面圖.其中，綠色區(qū)域代表體積大的原子或基團對活性有利，黃色區(qū)域則相反.圖中參照分子為化合物17（球棍）和32（棍狀），20（線狀）.

從圖5（a）可以看出，R2取代基伸向3CL 酶S3/S4 結(jié)合位點.此處有三塊較大的綠色區(qū)域，表明在此引入大取代基有利于提高化合物的活性.如R2為氫、甲氧基、丙氧基和鄰氯芐氧基時，相應的化合物15、21、22和32的抗3CL 酶活性隨著R2體積的增大而逐步提高.化合物14、16和17的活性依次提高，也遵循同樣的規(guī)律.但是，綠色區(qū)域周圍的四塊代表立體位阻的黃色區(qū)域，表明R2取代基不僅要體積大小合適，而且其在S3/S4 結(jié)合腔的位置也要合適，不能和結(jié)合腔中氨基酸殘基發(fā)生立體碰撞，否則對活性不利.例如：苯基乙氧基取代的化合物20，因碳鏈的延長，其苯環(huán)伸向了結(jié)合腔的另一側(cè)，偏離了綠色區(qū)域而靠近了一小塊黃色區(qū)域，由于存在立體位阻，化合物20的活性低于化合物19（R2為芐氧基）.同樣，因為取代基過大而存在立體位阻，化合物23及24的活性均比22低，而37的活性比01高.同時，17、37及01的活性也由于空間位阻逐漸降低.

此外，從立體場等勢圖還可以看出，化合物32位于S4 結(jié)合位點的苯環(huán)，在其鄰位附近存在兩塊綠色區(qū)域，表明此處有取代基對活性有利，如此處分別被Cl、F 和CH3取代得到的化合物32、29和27的活性均高于未取代的化合物25.而在苯環(huán)的間位附近則有一塊黃色區(qū)域，表明此處不宜有較大的取代基.如鄰位苯取代物27和29活性要高于間位苯取代物28和30.

圖5（b）為表征CoMFA 靜電場特征的等勢圖.其中，紅色區(qū)域代表負電性基團對活性有利，而藍色區(qū)域則是正電性基團對活性有利.圖中參照分子為化合物17（球棍）和32（棍狀）和07（線狀）.

從圖5（b）可以看出，化合物17在S4 位點的末端甲基，靠近兩塊中等大小的紅色區(qū)域，表明此處若有負電性基團，對化合物抑制3CL 酶的活性有利.如R2末端基團為三氟甲基的化合物38及36的活性比相應甲基取代的17和22的高，驗證了這一結(jié)論.同樣，化合物07噁唑環(huán)上的三氟甲基CF3也在這兩塊紅色區(qū)域旁，所以其活性比甲基取代的04高.此外，R2為芐氧基取代的化合物32，其末端苯環(huán)的鄰位氯原子指向了這兩塊紅色區(qū)域，表明此處的負電性取代基對活性有利，如鄰位分別被Cl 和F 取代得到的化合物32和29的活性均高于未取代的化合物25.

此外，從圖5（b）可以看到，在3CL 酶S3/S4 位點處有一大塊藍色區(qū)域，其中，化合物32末端苯環(huán)的對位接近了藍色區(qū)域，表明此處若有負電性基團將對活性不利，如對位為F 取代的化合物33的活性低于未取代的32.另外，化合物03和06末端芳雜環(huán)上的O 和S，也靠近了藍色區(qū)域，所以負電性更高的化合物03的活性比06低.此外，苯環(huán)/芳雜環(huán)上方的藍色區(qū)域，表明缺電子的芳環(huán)對活性有利，而富電子的五元芳雜環(huán)對活性不利，如化合物32的活性高于所有五元芳雜環(huán)取代的化合物.

從圖5（b）還可以看到，R1取代基所處的S1′位點處，有紅色和藍色區(qū)域.當R1取代基為嘧啶酮基時，其2 位的酮羰基氧在紅色區(qū)域附近，對活性有利，所以R1為嘧啶酮基的化合物22、35、36和26的活性均比相應的R1為2-氰基苯基的化合物17、37、38和20的活性高.另外，紅色區(qū)域旁邊的藍色區(qū)域，代表此處有正電性原子或基團對活性有利，當R1為嘧啶酮基時，其N1 位的正電性氫原子剛好在藍色區(qū)域附近，對活性有利，所以R1為未取代的嘧啶酮基的化合物35、36、34、07和08其活性均比N1 位為甲基取代的嘧啶酮基的化合物09、10、11、12和13的活性高.

圖5 CoMFA 立體場和靜電場等勢面圖Fig.5 Steric field distribution and electrostatic field distribution of CoMFA

綜上所述，對于三芳基吡啶酮類3CL 蛋白酶抑制劑，應在其R1基團上引入適當?shù)娜〈哉{(diào)節(jié)基團的電荷分布，其R2取代基則應充分考慮取代基的大小及電性，從而能和3CL 酶的S3/S4 結(jié)合腔緊密結(jié)合以提高化合物的抗病毒活性.

2.3 小分子設(shè)計基于上述構(gòu)效關(guān)系分析，從圖1所示通用結(jié)構(gòu)出發(fā)，在R1取代基如嘧啶酮基的C-6 位引入吸電基CN 以提高N1位氫原子的正電性，或在2-氰基苯基上引入甲氧基和氰基以調(diào)節(jié)芳環(huán)的電荷分布，在R2末端芳環(huán)的鄰位引入適當大小的吸電基團如CN、CF3為提高化合物活性的有利因素.據(jù)此設(shè)計了如表4 所示的化合物，并通過以訓練集所建立的 CoMFA 模型對其進行預測，結(jié)果見表4.由表4 中的數(shù)據(jù)可以看出，基于CoMFA 模型所設(shè)計的化合物均具有較優(yōu)的預測活性，其pIC50在7.76～8.16 間，高于現(xiàn)有化合物的測試活性，支持了本研究在R1基團上引入適當?shù)娜〈鶃碚{(diào)節(jié)基團的電荷分布，在R2末端芳基上引入適當?shù)娜〈{(diào)節(jié)側(cè)鏈的體積和極性，能有效提高化合物抗病毒活性的理論假設(shè).

表4 新設(shè)計化合物分子結(jié)構(gòu)及預測值Tab.4 Structures and predicted values of newly designed compounds

3 結(jié)論

本文采用分子對接的方法獲得了38 個三芳基吡啶酮類化合物與3CL 蛋白酶之間相互作用的活性構(gòu)象，以此為基礎(chǔ)進行比較分子力場分析（CoMFA）.所建立的CoMFA 模型交叉驗證系數(shù)q2為0.810，非交叉驗證相關(guān)系數(shù)r2為0.981，對由8 個化合物構(gòu)成的測試集進行了預測，其預測相關(guān)系數(shù)r2pred為0.855，內(nèi)部交叉驗證與外部測試集驗證結(jié)果都表明該模型具有良好的擬合能力和較高的預測能力.同時，基于CoMFA 模型的立體場和靜電場等勢圖，設(shè)計了9 個具有較高預測活性的三芳基吡啶酮類3CL 蛋白酶抑制劑，為此類化合物的進一步結(jié)構(gòu)改造與優(yōu)化提供理論指導.