李艾元, 施心雨, 劉夢斐, 李 誠, 岳萬福, 游衛(wèi)云

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院,杭州 311300)

大量的流行病學(xué)調(diào)查和研究表明,高脂血癥是目前動脈粥樣硬化、冠心病和腦血管病發(fā)病的最重要因素[1-3]。高脂血癥也是高血壓、糖耐量異常、糖尿病的一個重要危險因素[4]。高脂血癥還可導(dǎo)致脂肪肝、肝硬化、膽石癥、胰腺炎、眼底出血、失明、周圍血管疾病、跋行、高尿酸血癥[5]。降脂藥可降低這些疾病的發(fā)生率和死亡率,對心腦血管疾病的防治產(chǎn)生積極、深遠(yuǎn)的影響[6]。目前臨床應(yīng)用和處在研發(fā)階段的降脂藥物按其降脂機(jī)理和化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為他汀類、煙酸類、貝特類、膽酸鰲合劑類、多烯類、中藥類等[7];他汀類藥物,例如辛伐他汀(SIM)和阿托伐他汀(ATV)的藥理功能是抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR),這是肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶。但現(xiàn)有的降脂藥物存在療效不佳、毒副作用較大或費(fèi)用高等問題,因此開發(fā)新的降脂藥物顯得非常必要[8]。

大量研究表明,從自然資源中提取的大量生物化合物可以改善脂質(zhì)代謝紊亂,因?yàn)樗鼈儗Ω咧Y的療效很高,并且很少或沒有不良副作用。其作用機(jī)理主要有三個方面:1) 降低血漿中的脂質(zhì)水平,具有抗動脈粥樣硬化活性;2) 降低血清中的總膽固(TC)和低密度脂蛋白(LDL)膽固醇水平;3) 通過調(diào)節(jié)腸道微生物群組成來發(fā)揮降血脂作用。蠶絲生物材料因其生物相容性和廣泛的理想物理化學(xué)性質(zhì),在生物醫(yī)學(xué)和組織工程方面的應(yīng)用而聞名[9]。脫膠絲素蛋白已經(jīng)在小鼠、綿羊、兔子、人類等哺乳動物細(xì)胞證明了絲素蛋白對宿主無免疫排斥和綠色可降解[10-11]。絲素蛋白可促進(jìn)多種因子表達(dá),降解的氨基酸可以被宿主動物吸收降解而沒有副作用[12]?？梢試L試作為降血脂藥物的輔料來減少藥物的毒副作用,或者單獨(dú)作為藥物替代產(chǎn)物來減緩高血脂的病癥[13]。

斑馬魚與普通的模型動物相比,具有以下特性:1) 飼養(yǎng)成本低,性成熟周期短[14];2) 生長發(fā)育速度較快,在受精后24 h基本器官就可以發(fā)育完成;3) 胚胎及幼魚透明便于觀察藥物在體內(nèi)的擴(kuò)散及吸收情況[15];4) 給藥方式簡單,培養(yǎng)基內(nèi)直接給藥,溶于水的小分子物質(zhì)可直接通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入幼魚體內(nèi)[16];5) 與人類基因具有85%相似性[6]。因此,使用斑馬魚可以評價絲素蛋白能否在降血脂方面的效用[17-19]。總的來說,斑馬魚具有體積小、產(chǎn)卵量高、發(fā)育迅速、胚胎及幼體透明等特點(diǎn),并且與人類基因組具有高度同源性。

1 步驟與方法

1.1 材料與試劑

斑馬魚及斑馬魚培養(yǎng)基(南京一樹梨花生物科技有限公司),絲素蛋白(杭州林然生物科技有限公司),熒光倒置顯微鏡(尼康映像儀器銷售(中國)有限公司北京分公司),PBST緩沖液、油紅O、二甲基亞砜(DMSO)、尼羅紅(北京索萊寶科技有限公司),其余未列出試劑(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 斑馬魚高血脂模型的建立與檢測

斑馬魚模型建立方法:采用文獻(xiàn)[20-21]的方法,利用幼魚循環(huán)系統(tǒng)可以與培養(yǎng)基進(jìn)行物質(zhì)交換的特性,在顯微鏡下挑選孵化后發(fā)育正常的斑馬魚卵放入96孔板,每孔各一個魚卵,加入0.50%、0.10%、0.05%、0.01%的蛋黃培養(yǎng)液及空白組(養(yǎng)殖用水)。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,觀察魚卵的情況,及時挑出死掉的幼魚。

模型的檢測方法:移除蛋黃培養(yǎng)液之后,PBS洗脫3次,用4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,丙二醇梯度100%、75%、50%、25%脫水,油紅O(1 μg/mL)和尼羅紅(2 ng/mL)染色,PBST洗脫3次,熒光倒置顯微鏡觀察拍照。用圖像處理軟件ImageJ和SPSS 22.0進(jìn)行圖像分析比較,計算處理組斑馬魚尾部血脂染色強(qiáng)度與空白組尾脂染色強(qiáng)度,可以檢驗(yàn)斑馬魚高血脂模型是否建立成功。同時,挑選出4組濃度中模型建立最好的一組,作為高血脂模型進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 斑馬魚實(shí)驗(yàn)分組

設(shè)置6個實(shí)驗(yàn)組:3個化合物處理組、1個陽性對照組、1個溶劑對照組、1個空白對照組。移除96孔板中的培養(yǎng)基,PBS洗3次,化合物處理組分別加入0.1、0.5 μg/mL和1.0 μg/mL的辛伐他汀和同等質(zhì)量濃度絲素蛋白;陽性對照組中加入0.05 μg/mL的辛伐他汀;溶劑對照組中加入0.10% DMSO;空白對照組中加入養(yǎng)殖用水,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 斑馬魚高血脂熒光染色

移除培養(yǎng)液之后,PBS洗脫3次,用4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,丙二醇梯度100%、75%、50%、25%脫水,油紅O(1 μg/mL)和尼羅紅(2 ng/mL)染色,PBST洗脫3次,熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

1.5 斑馬魚染色與結(jié)果分析

將斑馬魚轉(zhuǎn)入96孔板中,每孔一尾,移除蛋黃培養(yǎng)基后用4%多聚甲醛4 ℃固定過夜,丙二醇梯度脫水,油紅O(1 μg/mL)和尼羅紅(2 ng/mL)染色,放入倒置熒光顯微鏡中觀察熒光強(qiáng)度。將所得數(shù)據(jù)按照下式進(jìn)行SPSS 22.0統(tǒng)計分析。

(1)

式中:A表示處理組染色強(qiáng)度;B表示對照組染色強(qiáng)度;C表示血脂降低率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用圖像處理軟件ImageJ和SPSS 22.0進(jìn)行圖像分析比較,計算模型組斑馬魚尾部血脂染色強(qiáng)度與空白組尾脂染色強(qiáng)度。統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果以±SE表示,多組間比較采用方差分析,兩組間比較采用Dnnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,P<0.05為差異性顯著。最后,根據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果評價絲素蛋白的降血脂能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚模型建立與結(jié)果分析

斑馬魚高血脂的造模原理主要是:高膽固醇的飲食,通過斑馬魚的循環(huán)系統(tǒng)在體內(nèi)血管不斷積累,血液中的膽固醇逐漸升高,從而影響尾脂熒光染色的面積和強(qiáng)度。由圖1(a～f)可以看出,隨著培養(yǎng)基中蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,斑馬魚尾脂的染色強(qiáng)度與面積逐漸增加。圖1(i)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,培養(yǎng)基不添加蛋黃粉的斑馬魚幼苗尾脂沒有檢測出熒光強(qiáng)度,培養(yǎng)基添加蛋黃粉的斑馬魚幼苗檢測出熒光強(qiáng)度。各個質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蛋黃粉培養(yǎng)基的熒光染色結(jié)果相比可以得出,培養(yǎng)基中蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%時,與其他蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)組差異極顯著(P<0.001);培養(yǎng)基中蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.10%時,與0.05%質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著(P>0.05),與0.01%質(zhì)量分?jǐn)?shù)組差異顯著(P<0.05)。隨著培養(yǎng)基中的蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,斑馬魚高血脂的癥狀逐漸增加。0.50%的蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)造模效果最佳,但0.50%蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)時,已經(jīng)超過斑馬魚幼苗的耐受度,斑馬魚死亡率較高,達(dá)50%;而在0.01%～0.10%蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù),死亡率均在20%±5%。綜合分析比較得出,最佳的造模條件為0.10%的蛋黃粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。因此,選擇含0.10%蛋黃粉的培養(yǎng)基進(jìn)行造模。油紅O染色可進(jìn)一步驗(yàn)證造模是否成功,如圖1(g)為不含蛋黃粉斑馬魚幼苗染色結(jié)果,未見到尾脂被染色;圖1(h)為含0.01%的蛋黃粉斑馬魚幼苗染色,幼苗的尾脂被染色,整個尾脂都被油紅O成功染色。油紅O結(jié)果表明,造模成功的斑馬魚尾脂可以被染色,而未經(jīng)蛋黃溶液培養(yǎng)的斑馬魚尾脂沒有被染色。從組織化學(xué)和免疫熒光兩個方面證明了斑馬魚高血脂模型的科學(xué)性與可行性。

注:*表示P<0.05,** 表示P<0.01,*** 表示P<0.001;下同。

2.2 絲素蛋白與辛伐他汀處理組結(jié)果的分析與比較

由圖2的結(jié)果可以看出,高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)的絲素蛋白與高質(zhì)量濃度的辛伐他汀(1.0 μg/mL)相比,熒光強(qiáng)度沒有差異(P>0.05);絲素蛋白中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)與辛伐他汀中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)相比,熒光效果差異極顯著(P<0.001);絲素蛋白低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)和辛伐他汀低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)相比差異極顯著(P<0.001);兩者的溶劑對照組沒有差異(P>0.05)。比較分析可以得出,絲素蛋白在中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)和低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)具有更好的降血脂效果。整體趨勢來看,隨著絲素蛋白質(zhì)量濃度和辛伐他汀質(zhì)量濃度的提高,尾脂的熒光強(qiáng)度逐漸下降,斑馬魚血脂下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,絲素蛋白可以通過濃度差進(jìn)入到斑馬魚體內(nèi),通過血液循環(huán)發(fā)揮作用,絲素蛋白具有類似他汀類藥物的降血脂作用。此外,對于幼年斑馬魚來說,主要靠吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)來進(jìn)行生長發(fā)育,絲素蛋白利用濃度差進(jìn)入高血脂斑馬魚的血液循環(huán)中,降解為氨基酸,其中賴氨酸和蛋氨酸這類限制性氨基酸可以影響魚類生長基因和相關(guān)蛋白質(zhì)代謝,這類限制性氨基酸可以增強(qiáng)肝的代謝;絲素蛋白質(zhì)量濃度越高,濃度差越大,進(jìn)入血液循環(huán)的限制性氨基酸越多,肝的代謝得到增強(qiáng),血液中的脂質(zhì)水平下降,斑馬魚的尾脂熒光強(qiáng)度降低。而對于他汀類藥物來說,其藥理作用是抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)的作用,這是肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶,這種抑制作用只可以阻止新的膽固醇合成,一時間無法快速緩解高血脂斑馬魚血液中的脂質(zhì)水平,隨著他汀類藥物質(zhì)量濃度的提高,血液中沒有了膽固醇的來源,可以通過循環(huán)將血液的膽固醇逐漸新陳代謝出去,從而導(dǎo)致血液中的脂質(zhì)水平下降,這也可以解釋為什么他汀類藥物質(zhì)量濃度越高,抑制效果越明顯。綜上,各個質(zhì)量濃度的絲素蛋白均可以降低高血脂斑馬魚的高血脂水平。

圖2 絲素蛋白和辛伐他汀處理組的結(jié)果比較

2.3 辛伐他汀處理組結(jié)果分析與比較

由圖3的結(jié)果可以看出,與溶劑對照組熒光強(qiáng)度相比,高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)辛伐他汀藥物處理的高血脂斑馬魚具有顯著性差異(P<0.001);中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)和低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)差異不顯著(P>0.05);其中低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)熒光強(qiáng)度有下降的趨勢,但差異不顯著。這種結(jié)果與他汀類藥物的作用原理有關(guān),在更換培養(yǎng)基之后,斑馬魚血液中的外源膽固醇不再增加,膽固醇主要來自體內(nèi),但是如果辛伐他汀的質(zhì)量濃度過低,無法完全抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶,膽固醇仍然被加工出來,因此斑馬魚中的尾脂熒光水平?jīng)]有得到有效降低。圖3(b)為圖3(a)數(shù)值代入式(1)的結(jié)果,也證實(shí)了辛伐他汀中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)和低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)有降低血脂水平的效果,但是只有高質(zhì)量濃度的辛伐他汀(1.0 μg/mL)可以高度抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)肝臟甲羥戊酸途徑中膽固醇合成的關(guān)鍵酶。高質(zhì)量濃度的辛伐他汀藥物雖然可以降低血脂,但是質(zhì)量濃度過高,可能會對肝功能造成不可逆的損傷,因此他汀類藥物本身具有一定的局限性。

圖3 辛伐他汀處理結(jié)果分析

2.4 絲素蛋白處理組結(jié)果分析與比較

由圖4(a)的結(jié)果表明,與陽性對照組(0.05 μg/mL)辛伐他汀相比,絲素蛋白在高質(zhì)量濃度組(1.0 μg/mL)和中質(zhì)量濃度組(0.5 μg/mL)均差異極顯著(P<0.001);低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)差異不顯著(P>0.05);而圖4(b)血脂降低率則表明,與絲素蛋白低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)相比,高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)和中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)差異極顯著(P<0.001),絲素蛋白質(zhì)量濃度對降血脂效果影響較大。絲素蛋白通過濃度差進(jìn)入到斑馬魚的血液循環(huán)中,之后在血液循環(huán)的作用下降低血液中的膽固醇含量,從而降低尾脂的熒光強(qiáng)度。質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)則表明,絲素蛋白也需要一定的質(zhì)量濃度才可以發(fā)揮它的作用,質(zhì)量濃度越高,降血脂效果越顯著,但是絲素蛋白中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)與高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)相比,降血脂的效果差異不顯著(P>0.05)。綜上,絲素蛋白對降血脂的提升效果最好是在0.5～1.0 μg/mL。

圖4 絲素蛋白處理結(jié)果

3 結(jié) 論

本文提供了一種可信度高的斑馬魚高血脂模型,操作簡便、過程簡單,可以用來篩選其他高血脂藥物;同時探究了絲素蛋白對高血脂斑馬魚降血脂的效果,主要有以下結(jié)論。

1) 利用含0.1%蛋黃粉的培養(yǎng)基培養(yǎng)斑馬魚幼苗48 h就可以得到斑馬魚高血脂模型,模型可用免疫熒光和油紅O方法檢測。

2) 采用市面上成熟的降血脂藥物辛伐他汀進(jìn)一步驗(yàn)證了高血脂斑馬魚可以通過尾脂的熒光染色顯示降血脂效果。

3) 各個質(zhì)量濃度的絲素蛋白均有降血脂的效果,其中高質(zhì)量濃度(1.0 μg/mL)降血脂效果最好。

4) 與辛伐他汀相比,絲素蛋白在低質(zhì)量濃度(0.1 μg/mL)和中質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)的降血脂效果更好。

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