張楊勇， 馮媛， 王二愿， 周鋒， 董濟(jì)民

(1.延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院腫瘤放療科，陜西省咸陽(yáng)市 712000；2.延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西省咸陽(yáng)市 712000；3.西安市中心醫(yī)院腫瘤科，陜西省西安市 710004)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)為常見(jiàn)的惡性腫瘤，其預(yù)后與關(guān)鍵基因調(diào)控的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。因此，探索新的NSCLC生物學(xué)調(diào)控基因?qū)SCLC靶向治療具有重要意義。轉(zhuǎn)移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)在蛋白質(zhì)翻譯中具有重要作用，tRNA修飾蛋白異常表達(dá)與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)[2]。人類(lèi)tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶9樣蛋白(又稱(chēng)KIAA1456)是一種催化tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶[3]，其異常表達(dá)干擾正常蛋白翻譯和DNA修復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變[4]。KIAA1456在乳腺、結(jié)腸、膀胱等多腫瘤組織中表達(dá)降低[5]，過(guò)表達(dá)KIAA1456后腫瘤細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)速率均明顯下降[6]，但目前尚不清楚KIAA1456在肺癌中的生物學(xué)功能。因此，本研究推測(cè)KIAA1456可能是一個(gè)潛在的抑癌基因，檢測(cè)了KIAA1456在肺癌組織的表達(dá)，以及KIAA1456表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討其潛在分子機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 主要試劑和儀器

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；miRNA陰性對(duì)照(miRNA negative control，miR-NC)、KIAA1456 RNAi和pCDNA3.0-HA-KIAA1456質(zhì)粒(上海吉?jiǎng)P生物公司)；四甲基偶氮唑鹽(Methyl tihiazolyl tetrazolium，MTT)(美國(guó)Amresco公司)；細(xì)胞蛋白抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；KIAA1456、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(runt-associated transcription factor 1，Runx1)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(metallic matrix proteinase-9，MMP-9)、β-actin和HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(武漢博士德生物工程公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Ther-mo Revco公司)；24孔Transwell小室(美國(guó)CORNING科技有限公司)。

1.2 一般資料

收集本院2013年1月—2015年10月行手術(shù)切除經(jīng)病理確診的肺癌患者91例，年齡(69.27±14.13)歲，收集患者臨床病理特征、肺癌組織和癌旁組織標(biāo)本，并隨訪5年進(jìn)行生存分析。本研究獲得本院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患者及家屬知情同意。

1.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)定組織中KIAA1456表達(dá)

肺癌組織和癌旁組織經(jīng)脫水、包埋、切片，烤片后常規(guī)脫蠟，用胃蛋白酶進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2處理20 min，室溫下10%綿羊血清封閉20 min，然后添加KIAA1456抗體(1∶1 000 )，4 ℃孵育過(guò)夜，加入通用二步法檢測(cè)試劑(30 min)，加入二氨基聯(lián)苯胺底物進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察，棕褐色染色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。使用ImageJ軟件分析染色強(qiáng)度得分0分(陰性)、1分(弱陽(yáng)性)、2分(中等陽(yáng)性)和3分(強(qiáng)陽(yáng)性)；染色陽(yáng)性細(xì)胞占比得分1分(1%～24%)、2分(25%～49%)、3分(50%～74%)和4分(75%～100%)。將以上兩個(gè)分?jǐn)?shù)相乘后，得分<6分為KIAA1456低表達(dá)，≥6分為KIAA1456高表達(dá)[7]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

37 ℃、5%CO2下用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合至70%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將A549細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、NC對(duì)照組、KIAA1456 RNAi組和KIAA1456質(zhì)粒組。陰性對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行處理，NC對(duì)照組、KIAA1456 RNAi組和KIAA1456質(zhì)粒組細(xì)胞用Lipofectamine法分別將miR-NC、miR-NCKIAA1456 RNAi和pCDNA3.0-HA-KIAA1456質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率

處理細(xì)胞后，將細(xì)胞接種于96孔板中(5×103個(gè)/孔，200 μL/孔)，48 h后每孔加入20 mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入200 mL二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

處理細(xì)胞后，將細(xì)胞接種于Transwell小室中，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，48 h后取出小室，甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色30 min，沖洗干凈后計(jì)數(shù)紫色染色的細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞KIAA1456、Cyclin D1、Runx1和MMP-9的表達(dá)

處理細(xì)胞后，將細(xì)胞接種于6孔板中(1×106個(gè)/孔，3 mL/孔)，48 h后收獲細(xì)胞，加入細(xì)胞蛋白抽提液(100 μL)，電泳(20 μg/孔)，切膠后轉(zhuǎn)膜，將膜與KIAA1456(1∶400)、Cyclin D1(1∶200)、Runx1(1∶200)和MMP-9(1∶400)進(jìn)行孵育，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后用HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(1∶10 000)室溫下孵育(30 min)，顯色、采集圖像進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織和癌旁組織KIAA1456表達(dá)的比較

KIAA1456蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。91例肺癌組織中有44例(48.35%)低表達(dá)，47例(51.65%)高表達(dá)；91例癌旁組織中有22例(24.18%)低表達(dá)，69例(75.82%)高表達(dá)；KIAA1456在肺癌組織中的高表達(dá)率明顯低于癌旁組織(P<0.05；圖1)。

圖1 KIAA1456在肺癌患者癌旁組織(A)和肺癌組織(B)中的表達(dá)(蘇木精染色，400×)

2.2 KIAA1456表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

KIAA1456在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期分層間表達(dá)有差異(P<0.05；表1)。

表1 KIAA1456表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 單位：例(%)

2.3 KIAA1456表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，KIAA1456高表達(dá)的肺癌患者5年總生存率明顯高于KIAA1456低表達(dá)的肺癌患者(P<0.05；圖2)。

圖2 KIAA1456表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 KIAA1456表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和侵襲的影響

與陰性對(duì)照組和NC對(duì)照組比較，A549細(xì)胞增殖率和侵襲細(xì)胞數(shù)KIAA1456 RNAi組增加，KIAA1456質(zhì)粒組降低，KIAA1456質(zhì)粒組低于KIAA1456 RNAi組(P<0.05；表2和圖3)。

表2 KIAA1456表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和侵襲的影響(n=3)

圖3 KIAA1456表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響(蘇木精染色，200×)

2.4 KIAA1456表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞Cyclin D1、Runx1和MMP-9的影響

與陰性對(duì)照組比較，KIAA1456 RNAi組A549細(xì)胞Runx1表達(dá)降低、Cyclin D1和MMP-9表達(dá)增加；KIAA1456質(zhì)粒組A549細(xì)胞Runx1表達(dá)增加，Cyclin D1和MMP-9表達(dá)降低(P<0.05；圖4)。

圖4 KIAA1456表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞Cyclin D1、Runx1和MMP-9的影響a為P<0.05，與陰性對(duì)照組比較。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，KIAA1456基因是一種潛在的抑癌基因，與腫瘤生長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)。在卵巢癌中，晚期腫瘤的KIAA1456表達(dá)比早期腫瘤低約30%[8]。同時(shí)，KIAA1456過(guò)度表達(dá)與5-氟尿嘧啶的治療益處相關(guān)，并且結(jié)腸癌患者糞便樣本中KIAA1456 mRNA的存在與更有利的預(yù)后相關(guān)[9]。KIAA1456也被稱(chēng)為藥物激活基因過(guò)表達(dá)，在順鉑和紫杉烷誘導(dǎo)的HCT116 Runx1+/+細(xì)胞中表達(dá)，但在HCT116 Runx1-/-細(xì)胞中不誘導(dǎo)表達(dá)[10]。然而，目前還沒(méi)有關(guān)于KIAA1456基因在肺癌中的研究。

本研究免疫組化結(jié)果顯示，KIAA1456在肺癌組織中表達(dá)水平低于癌旁組織，同時(shí)，KIAA1456在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期分層間表達(dá)有差異，KIAA1456高表達(dá)患者術(shù)后5年生存率高于低表達(dá)患者。因此，本研究推測(cè)KIAA1456也可能在NSCLC的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。利用培養(yǎng)的A549細(xì)胞研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，KIAA1456通過(guò)調(diào)節(jié)影響腫瘤細(xì)胞惡性行為功能蛋白的表達(dá)，減少了癌細(xì)胞增殖和侵襲。

肺癌是一種侵襲性高、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，是肺癌高死亡率的主要原因之一。KIAA基因是大分子蛋白質(zhì)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(HUGE)中的一員，KIAA0247基因位于人類(lèi)染色體16q22.1上，基因高度保守，在免疫炎癥反應(yīng)時(shí)KIAA0247表達(dá)明顯增多，參與脂多糖及補(bǔ)體控制蛋白；同時(shí)在該染色體還包含Runx1基因，該基因?qū)е路谓M織損傷、肺氣腫和肺癌中α1-抗胰蛋白酶缺乏。盡管KIAA1456在癌癥中未發(fā)生突變，但由于在其啟動(dòng)子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了Runx1反應(yīng)元件，因此已提示其在腫瘤發(fā)生中起作用，這表明KIAA1456是Runx1的潛在靶標(biāo)[11]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，Runx1在肺泡上皮中的低表達(dá)與原癌基因途徑協(xié)同促進(jìn)了NSCLC的發(fā)展。同時(shí)，Runx1通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9的穩(wěn)定性來(lái)抑制MMP-9介導(dǎo)的侵襲，這是肺腺癌生長(zhǎng)所必需的[12]。另一項(xiàng)研究表明，KIAA1456過(guò)表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞系的增殖和血管生成，并通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[13]。此外，細(xì)胞增殖依賴(lài)于細(xì)胞周期G1期的進(jìn)展，Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白家族的一員，其與人細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶4蛋白結(jié)合，加速細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果顯示，KIAA1456上調(diào)后促進(jìn)Runx1表達(dá)，通過(guò)抑制下調(diào)Cyclin D1和MMP9來(lái)抑制細(xì)胞增殖和侵襲。

綜上所述，KIAA1456在肺癌組織中呈低表達(dá)，并與肺癌的臨床病理特征及預(yù)后明顯相關(guān)，可作為抑癌基因，過(guò)表達(dá)KIAA1456通過(guò)靶向調(diào)控Runx1的表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖和侵襲。KIAA1456可作為一種新的肺癌檢測(cè)生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)肺癌的早期診斷和靶向治療具有重要意義。