謝軍， 范翀， 劉靖， 張馳， 李俠， 胡東

(1.淮南東方腫瘤醫(yī)院肺癌中心，安徽省淮南市 232001；2.安徽理工大學(xué)肺癌中心，安徽省淮南市 232002)

肺癌為常見惡性腫瘤，中國每年新增肺癌病例近80萬[1]。在肺癌病理分型中，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)最為常見[2]。手術(shù)、靶向治療、放化療、免疫治療均是當(dāng)前臨床治療NSCLC的方法，在滿足手術(shù)指征的前提下，手術(shù)是臨床治療NSCLC的首選方法，然而部分患者經(jīng)手術(shù)治療預(yù)后仍較差，故而可考慮從抗腫瘤機(jī)理方面入手，探尋有效的生物標(biāo)志物，以提高NSCLC的預(yù)后預(yù)測(cè)效能。人體參與抗腫瘤的免疫細(xì)胞較多，其中CD8+T細(xì)胞在清除腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用[3]?；罨腃D8+T細(xì)胞可通過分泌干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)，因而對(duì)CD8+T細(xì)胞活化和耗竭情況予以調(diào)控，有利于控制腫瘤病理進(jìn)展[4]。常見的T細(xì)胞耗竭或凋亡的指標(biāo)包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)、程序性死亡分子-1(PD-1)、T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)，而關(guān)于CD39對(duì)NSCLC患者CD8+T細(xì)胞免疫耗竭的相關(guān)性研究較少。本文探討NSCLC患者外周血CD8+CD39+T細(xì)胞的水平，并分析其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2018年8月—2020年7月本院收治的60例NSCLC患者，男36例，女24例；年齡38～75歲，平均(55.28±7.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理檢查確診為NSCLC；②TNM分期為Ⅰ期～Ⅲ期，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2017年國際肺癌研究協(xié)會(huì)發(fā)布的第8版肺癌TNM分期[5]，可進(jìn)行手術(shù)治療；③卡氏功能狀態(tài)評(píng)分≥70分；④臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①小細(xì)胞肺癌；②血液系統(tǒng)功能障礙；③其他部位惡性腫瘤；④入組前1個(gè)月接受過放化療；⑤妊娠或哺乳期女性；⑥伴有代謝性疾?。虎叻眠^影響免疫功能的藥物；⑧自身免疫性疾病。選取同期本院體檢的60例健康人群作為對(duì)照組，其中男32例，女28例；年齡34～73歲，平均(53.71±8.20)歲。

1.2 臨床資料收集及治療方法

收集患者臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期等。術(shù)前均采用雙腔氣管插管，取健側(cè)臥位，予以全麻，術(shù)中單肺通氣，手術(shù)方法包括全胸腔鏡手術(shù)、胸腔鏡輔助小切口手術(shù)、傳統(tǒng)開胸手術(shù)。

1.3 外周血CD8+CD39+T細(xì)胞檢測(cè)

術(shù)前1天抽取兩組清晨空腹靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝管中，與RPMI 1640培養(yǎng)基1∶1混勻，密度梯度離心法分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整至1×104個(gè)/μL。取離心管，加入100 μL PBMC懸液，分別加入熒光素標(biāo)記的單克隆抗體Anti-Human CD8PE-CF594、Anti-HumanCD39PE-Cy7各5 μL，4 ℃避光孵育30 min，洗細(xì)胞2次，加入1%多聚甲醛溶液500 μL重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測(cè)。

1.4 隨訪

NSCLC患者術(shù)后均進(jìn)行隨訪，每3～4周電話隨訪1次，每6個(gè)月門診隨訪1次，進(jìn)行影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查，并記錄其腫瘤無進(jìn)展生存期(從開始治療到腫瘤進(jìn)展的時(shí)間)。隨訪時(shí)間1年。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平比較

外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平NSCLC組(18.30%)顯著高于對(duì)照組(6.99%)(t=20.508，P<0.05；圖1)。

圖1 兩組外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平比較

2.2 NSCLC患者外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平與臨床特征的關(guān)系

外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平與NSCLC患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤位置、手術(shù)方式無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤直徑、分化程度、TNM分期有關(guān)(P<0.05)；腫瘤直徑>3 cm、低分化、TNM為Ⅲ期的NSCLC患者外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平高于腫瘤直徑≤3 cm、中高分化、TNM為Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05；表1)。

表1 NSCLC患者外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平與臨床特征的關(guān)系

2.3 不同外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平的NSCLC患者生存情況比較

采用二分法將NSCLC患者分為CD8+CD39+T細(xì)胞高水平組(CD8+CD39+T細(xì)胞水平>17.63%)和低水平組(CD8+CD39+T細(xì)胞水平≤17.63%)。CD8+CD39+T細(xì)胞高水平組術(shù)后1年腫瘤無進(jìn)展生存率及無進(jìn)展生存期低于低水平組(P<0.05；表2、圖2)。

表2 不同外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平的NSCLC患者術(shù)后1年生存情況

圖2 不同外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平的NSCLC患者生存情況

2.4 NSCLC患者預(yù)后的Cox多因素回歸分析

以NSCLC患者術(shù)后1年腫瘤無進(jìn)展生存狀態(tài)(無進(jìn)展=0；有進(jìn)展=1)為因變量，腫瘤直徑(≤3 cm=0；>3 cm=1)、分化程度(低分化=0；中高分化=1)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=0；Ⅲ期=1)、CD8+CD39+T細(xì)胞水平(原值輸入)為自變量，納入Cox多因素回歸模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，TNM分期、CD8+CD39+T細(xì)胞水平為NSCLC患者預(yù)后的影響因素(P<0.05；表3)。

表3 NSCLC患者預(yù)后的Cox多因素回歸分析

3 討 論

NSCLC的發(fā)生和發(fā)展與多種因素有關(guān)，而免疫功能異常是其重要因素之一[6]。研究表明，腫瘤生長和轉(zhuǎn)移受到抑制通常與NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞免疫介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)增加有關(guān)[7-8]。在腫瘤發(fā)展過程中，CD8+T細(xì)胞表面CTLA-4、PD-1、Tim-3等標(biāo)志物的表達(dá)水平升高，細(xì)胞殺傷功能減弱[9-10]，但有無更多的抑制性分子參與到誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞功能抑制的過程中，還需進(jìn)一步證實(shí)。

既往研究指出，CD39高表達(dá)是NSCLC患者不良預(yù)后和疾病進(jìn)展的標(biāo)志[11]。CD39陽性細(xì)胞數(shù)量的增多往往伴隨著共抑制受體PD-1、Tim-3等表達(dá)水平的增高，免疫因子IFN-γ表達(dá)水平的降低，與免疫抑制和腫瘤進(jìn)展緊密相關(guān)[12-13]。本文結(jié)果顯示，NSCLC組外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，提示外周血CD8+CD39+T細(xì)胞可能與NSCLC的發(fā)生有關(guān)。研究顯示，CD39可能參與調(diào)節(jié)腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，起到免疫抑制作用，發(fā)揮免疫抑制效能；且分離的CD39+CD8+T細(xì)胞可以在體外抑制T細(xì)胞增殖[14]。上述研究表明，腫瘤組織浸潤的CD8+CD39+T細(xì)胞和表達(dá)CD39的腫瘤細(xì)胞可以通過CD39而發(fā)揮免疫抑制作用。

在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，CD39的表達(dá)水平與疾病的分期和嚴(yán)重程度相關(guān)[15]。本文結(jié)果顯示，腫瘤直徑>3 cm、低分化、TNM為Ⅲ期的NSCLC患者外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平高于腫瘤直徑≤3 cm、中高分化、TNM為Ⅰ～Ⅱ期的患者(P<0.05)，且CD8+CD39+T細(xì)胞高水平組術(shù)后1年腫瘤無進(jìn)展生存率及無進(jìn)展生存期均低于低水平組(P<0.05)，提示外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平與腫瘤大小、分化程度和臨床分期等病理特征及預(yù)后有關(guān)。進(jìn)一步分析影響NSCLC患者預(yù)后的因素，發(fā)現(xiàn)TNM分期、外周血CD8+CD39+T細(xì)胞水平為NSCLC患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。

綜上所述，NSCLC患者外周血CD8+CD39+T細(xì)胞呈高表達(dá)，且其水平與臨床病理特征及預(yù)后存在相關(guān)性，對(duì)患者病情和預(yù)后具有評(píng)估價(jià)值。