劉明穎， 金鑫， 王惠華， 孫強(qiáng)

(大連市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)科，遼寧省大連市 116033)

卵巢低反應(yīng)(poor ovary response，POR)是指在藥物刺激的超排卵過(guò)程中，卵巢對(duì)促性腺激素的刺激反應(yīng)不佳，臨床研究顯示重組人生長(zhǎng)激素(recombinant human growth hormone，r-hGH)可以提高POR患者卵巢反應(yīng)性[1]。脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)是機(jī)體內(nèi)類固醇激素合成必需的底物，在r-hGH基礎(chǔ)上聯(lián)合使用DHEA可輔助治療POR，但是關(guān)于其機(jī)制不清楚[2]。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)及晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)參與POR的發(fā)生[3-4]。生長(zhǎng)分化因子-9(growth differentiation factor-9，GDF-9)主要存在于卵泡中，在促進(jìn)卵泡及顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)分化中起著重要作用[5]。本文分析r-hGH聯(lián)合DHEA對(duì)卵巢低反應(yīng)小鼠模型干預(yù)及GDF-9、AGE、RAGE的影響，并分析其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)ICR小鼠購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性100只。r-hGH購(gòu)自安科生物工程。DHEA購(gòu)自美國(guó)GNC公司。重組人絨毛膜促性腺激素(HCG)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。AGE、RAGE和GDF-9抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。ELISA試劑盒和HE染色試劑盒購(gòu)自武漢華美公司。RNAspin Mini購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。iScriptTM cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。Bestar qRT-PCR和BestarTMqPCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)DBI Bioscience公司。Fast Start Universal SYBR Green Master試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。引物和反向引物由Genewiz公司設(shè)計(jì)和合成，GAPDH作為內(nèi)參。

1.2 分組、建模及干預(yù)方法

100只雌性小鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、r-hGH組、DHEA組和r-hGH+DHEA組。使用慢性制動(dòng)應(yīng)激的方法建立卵巢早衰及卵巢低反應(yīng)模型[6]。對(duì)照組和模型組小鼠使用等量的溶劑干預(yù)，在制動(dòng)的第15天r-hGH組小鼠腹腔注射r-hGH，每天0.5 U/次，連續(xù)5天；DHEA組使用DHEA灌胃，每次1.25 mg/kg，每日1次，連續(xù)5天，若未發(fā)現(xiàn)陰栓重復(fù)上述步驟；r-hGH+DHEA組小鼠同時(shí)接受r-hGH腹腔注射和DHEA灌胃，方法同上。

1.3 血清AMH水平檢測(cè)

將小鼠麻醉后脫頸處死，取外周血，使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清抗苗勒管激素(anti-miillerrian hormone，AMH)水平，按照說(shuō)明書(shū)方法操作。

1.4 小鼠卵泡的檢測(cè)

HE染色用于檢測(cè)小鼠卵巢中卵泡情況。將卵巢組織在室溫下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脫水后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5 μm的切片，并將這些切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10 min。用自來(lái)水洗滌1～2 min后，將玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍(lán)。隨后用自來(lái)水清洗1～2 min后，將玻片放入蘇木精-伊紅中10 s。在乙醇中脫水后，將玻片置于二甲苯中2 min；重復(fù)此步驟一次。最后，用中性膠密封玻片。光學(xué)顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)卵泡數(shù)量。

1.5 卵巢組織中AGE、RAGE和卵泡中GDF-9 mRNA的檢測(cè)

使用qRT-PCR法檢測(cè)卵巢組織中AGE、RAGE mRNA和卵泡中GDF-9 mRNA的表達(dá)水平。使用RNeasy Mini試劑盒取卵巢組織總RNA，然后使用IscriptTMcDNA合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37 ℃15 min，98 ℃5 min。然后進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95 ℃2 min，94 ℃20 s，58 ℃20 s，72 ℃20 s，40個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR分析。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 AGE、RAGE和GDF-9蛋白的水平檢測(cè)

Western blotting檢測(cè)AGE、RAGE和GDF-9蛋白水平。將細(xì)胞使用裂解緩沖液在冰上裂解并收集總蛋白。通過(guò)8%的SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量(50 μg)蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過(guò)在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h來(lái)封閉非特異性抗原。隨后，將膜與分別與一抗(1∶800)4 ℃孵育過(guò)夜，然后將膜與山羊抗免IgG二抗在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度值，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19軟件處理。計(jì)量資料采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠AMH水平比較

模型組小鼠血清AMH(2.05±0.15)μg/L，較對(duì)照組(6.21±0.51)μg/L降低(P<0.05)，r-hGH組(3.76±0.38)μg/L和DHEA組(3.16±0.24)μg/L高于模型組，r-hGH+DHEA組(5.35±0.42)μg/L高于r-hGH組和DHEA組(P<0.05)。

2.2 各組小鼠卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果比較

建模后小鼠卵泡數(shù)目均降低，r-hGH組和DHEA組高于模型組，r-hGH+DHEA組高于r-hGH組和DHEA組(P<0.05；表1和圖1)。

表1 各組小鼠卵泡計(jì)數(shù)結(jié)果比較(n=20) 單位：個(gè)

圖1 各組小鼠卵泡HE染色結(jié)果(400×)A為對(duì)照組；B為模型組；C為r-hGH組；D為DHEA組；E為r-hGH+DHEA組。

2.3 各組小鼠AGE、RAGE、GDF-9 mRNA和蛋白水平的比較

小鼠卵巢組織AGE和RAGE mRNA和蛋白水平模型組高于對(duì)照組，r-hGH組和DHEA組低于模型組，r-hGH+DHEA組低于r-hGH組和DHEA組(P<0.05；表2和圖2)。

表2 各組小鼠AGE、RAGE、GDF-9 mRNA表達(dá)水平的比較(n=20)

小鼠GDF-9 mRNA和蛋白水平模型組低于對(duì)照組，r-hGH組和DHEA組高于模型組，r-hGH+DHEA組高于r-hGH組和DHEA組(P<0.05；表2和圖2)。

圖2 各組小鼠AGE、RAGE、GDF-9蛋白表達(dá)水平比較1為對(duì)照組；2為模型組；3為r-hGH組；4為DHEA組；5為r-hGH+DHEA組。a為P<0.05，與對(duì)照組比較；b為P<0.05，與模型組比較；c為P<0.05，與r-hGH組比較；d為P<0.05，與DHEA組比較。

3 討 論

POR是輔助生殖技術(shù)中面臨的主要難題，且尚無(wú)治療POR的特效藥物，通過(guò)藥物刺激卵巢提高其反應(yīng)性、排卵量和體外受精率是治療POR的重點(diǎn)，研究認(rèn)為高年齡(≥40歲)是POR的危險(xiǎn)因素[7]。本文通過(guò)慢性制動(dòng)應(yīng)激的方法建立卵巢早衰及卵巢低反應(yīng)模型，建模后小鼠動(dòng)情周期發(fā)生顯著變化，HE染色結(jié)果也顯示卵巢功能下降，各個(gè)期間的卵泡數(shù)目均顯著降低，血清AMH水平也顯著降低，提示建模成功[6]。AMH主要由發(fā)育中的竇前卵泡及其周圍的顆粒細(xì)胞分泌，是現(xiàn)階段臨床用于評(píng)估卵巢儲(chǔ)備和體外受精中卵巢反應(yīng)性的重要指標(biāo)。本次研究結(jié)果顯示建模后小鼠血清AMH水平和卵泡數(shù)目顯著降低。臨床研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)r-hGH的使用可以提高體外受精率[8]。DHEA是最近發(fā)現(xiàn)的可以輔助治療POR的藥物，DHEA是合成多種雌性激素的底物，研究發(fā)現(xiàn)大于40歲的婦女可通過(guò)口服DHEA提高機(jī)體中雄烯二酮和總睪酮水平。DHEA可以改善POR患者體外受精-胚胎移植周期[9]。DHEA對(duì)POR具有一定的治療效果[10-11]，提示r-hGH聯(lián)合DHEA對(duì)POR具有更好的效果，但是關(guān)于其機(jī)制尚不明確。

本研究結(jié)果顯示模型組小鼠卵巢組織AGE和RAGE mRNA水平高于對(duì)照組，使用r-hGH或DHEA干預(yù)后卵巢組織AGE和RAGE mRNA水平降低，并且聯(lián)合組的影響更為顯著。建模后小鼠卵泡中GDF-9 mRNA水平降低，使用r-hGH或DHEA干預(yù)后GDF-9 mRNA水平升高，聯(lián)合使用r-hGH或DHEA上調(diào)GDF-9的效果更為顯著。卵巢的衰老是引起POR的主要原因，AGE、RAGE基因可能與卵巢的衰老相關(guān)[12]。卵巢卵泡水平的AGE產(chǎn)物積累可能引發(fā)早期卵巢衰老[13]，并可能導(dǎo)致顆粒細(xì)胞葡萄糖攝取減少，從而可能改變卵泡生長(zhǎng)，可能是生殖衰老的潛在機(jī)制之一。GDF-9在卵泡發(fā)育中有著極為重要的作用，GDF-9不但可以促進(jìn)卵泡發(fā)育，還可以作用于顆粒細(xì)胞調(diào)節(jié)雌激素和孕激素的分泌[14]。DHEA可提高卵泡液中的GDF-9的水平[15]，說(shuō)明AGE、RAGE的過(guò)表達(dá)引起的卵巢衰老和GDF-9水平降低影響的卵泡發(fā)育不良與POR密切相關(guān)，而聯(lián)合使用r-hGH和DHEA可能通過(guò)調(diào)節(jié)AGE、RAGE、GDF-9的水平緩解卵巢衰老，促進(jìn)卵泡發(fā)育，從而對(duì)POR具有一定的治療效果。

綜上所述，r-hGH聯(lián)合DHEA對(duì)POR小鼠模型具有較好的干預(yù)效果，這可能與其可以下調(diào)卵巢中AGE、RAGE mRNA水平并促進(jìn)GDF-9的表達(dá)有關(guān)。關(guān)于POR的發(fā)病機(jī)制和r-hGH聯(lián)合DHEA對(duì)POR的治療機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。