吳移謀， 李思佳， 李威威， 楊鴻鈺， 唐園園， 余翔， 王建業(yè)

(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物研究所，湖南省衡陽市 421001)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，Tp)感染引起的慢性性傳播疾病，晚期感染者常出現(xiàn)嚴重的多器官功能衰竭，近年其發(fā)病率快速增長，居性傳播疾病首位[1]。由于無法長期體外培養(yǎng)，Tp致病機制的研究遠遠落后于其他常見細菌。溶血素(hemolysin，hly)或溶細胞毒素(cytolysin，tly)以一種膜成孔毒素、磷脂酶或表面活性毒素的形式對靶細胞造成損傷，從而在其發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，鉤端螺旋體及豬痢疾蛇形螺旋體不僅能分泌溶血素家族蛋白，而且溶血素家族蛋白在其發(fā)病機制中起重要作用[3-6]。有研究通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)Tp有5個潛在的溶血素基因，分別為tlyC(Tp0649)、hlyIII(Tp1037)、hlyA(Tp0026)、hlyB(Tp0027)和hlyC(Tp0936)[7]，并在其體外培養(yǎng)過程中觀察到了細胞毒效應(yīng)[8-10]，但目前還未見梅毒螺旋體溶血素家族的相關(guān)研究。因此，本文對梅毒螺旋體溶血素家族蛋白進行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)研究溶血素家族蛋白在Tp致病過程中的致病機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 資料核酸序列數(shù)據(jù)庫

資料核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank/NCBI(http://www.ncbi.Nlm.Nih.gov/，美國國家生物技術(shù)信息中心)，蛋白分析數(shù)據(jù)庫UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org，歐洲生物信息學(xué)研究所/美國蛋白信息資源/瑞士生物信息研究所)。

1.2 Tp溶血素家族蛋白基因特征分析

由GenBank獲取梅毒螺旋體Nichols株(Treponema pallidum subsp. pallidum str. Nichols. Accession number:NC_021490)溶血素家族蛋白基因序列及其編碼蛋白序列。將獲取的核苷酸序列及氨基酸序列分別經(jīng)BLAST/NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和CDD/NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.gov/Structure/cdd)分析，初步預(yù)測梅毒螺旋體溶血素家族蛋白基因及其編碼產(chǎn)物的功能。

1.3 Tp溶血素家族蛋白一般性質(zhì)分析

采用BioEdit(v7.6.2.1)和ExPASy tools(https://www.expasy.org/proteomics/post-translational_modification)分析溶血素家族蛋白基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì)，包括氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、等電點、親疏水性等。

1.4 Tp溶血素家族蛋白跨膜區(qū)、信號肽、糖基化、磷酸化位點及亞細胞位置分析

應(yīng)用TMHMM服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)在線分析溶血素家族蛋白基因編碼產(chǎn)物跨膜區(qū)域及其方向;利用SignalP 6.0(https://services.healthtech.dtu.dk/)預(yù)測該蛋白信號肽序列；NetPhos和NetNGlyc分析溶血素家族蛋白基因編碼產(chǎn)物的糖基化位點和磷酸化位點；PSORTb 3.0(http://www.psort.org/psortb)和CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細胞位置。

1.5 Tp溶血素家族蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用Protein-Blast將數(shù)據(jù)庫蛋白與梅毒螺旋體溶血素家族蛋白進行比對，通過MEGA 7.0.26繪制生物進化樹從而分析蛋白一級結(jié)構(gòu)相似性；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)服務(wù)器和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)服務(wù)器預(yù)測分析梅毒螺旋體溶血素家族蛋白二級結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)域。

1.6 Tp溶血素家族蛋白B細胞表位預(yù)測

將梅毒螺旋體溶血素家族蛋白序列輸入在線軟件SVMTriP(http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/)預(yù)測溶血素家族蛋白基因編碼產(chǎn)物的B細胞抗原表位。

1.7 Tp溶血素家族蛋白CD4+T細胞及CD8+T細胞表位預(yù)測

NetMHC II pan-3.2(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2)在線預(yù)測溶血素家族蛋白基因編碼產(chǎn)物CD4+T細胞表位；綜合SYFPEITHI和IEDB兩種在線預(yù)測溶血素家族蛋白基因編碼產(chǎn)物CD8+T細胞表位結(jié)果最終確定抗原表位，本研究選擇了在中國人群中覆蓋率較高的MHC-Ⅱ類分子等位基因，如DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*0802、DRB1*1101和DRB1*1501來預(yù)測CD4+T細胞表位。將預(yù)測肽段長度設(shè)置為15，其余為默認值。同樣選擇了中國人群出現(xiàn)率較高的MHC-Ⅰ類分子等位基因，如HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*2601來預(yù)測CD8+T細胞表位。將預(yù)測肽段長度設(shè)置為9，其余為默認值。

2 結(jié) 果

2.1 Tp溶血素家族蛋白一般性質(zhì)分析

數(shù)據(jù)庫顯示TpNichols株有5個編碼具有潛在細胞毒性的Tp基因：hlyA(Tp0027)、hlyB(Tp0028)、tlyC(Tp0649)、hlyC(Tp0936)、hlyIII(Tp1037)。預(yù)測出的5種Tp溶血素家族蛋白基因性質(zhì)見表1。溶血素家族蛋白氨基酸長度約230～460個氨基酸，其中Tp1037是Tp溶血素家族中最小的蛋白，Tp0027是Tp溶血素家族中最大的蛋白。除Tp0649等電點<7，且其不穩(wěn)定指數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白外，其余4種溶血素家族蛋白等電點均>7、不穩(wěn)定指數(shù)<40都為較穩(wěn)定蛋白。5種溶血素蛋白疏水性及脂肪指數(shù)略有差異。

表1 Tp溶血素家族蛋白基因編碼產(chǎn)物一般性質(zhì)

通過BioEdit軟件預(yù)測蛋白親疏水性發(fā)現(xiàn)，Tp0027和Tp1037在1～70位氨基酸之間有1個典型的疏水結(jié)構(gòu)域，Tp0027、Tp0028和Tp1037疏水區(qū)域分布較多，而Tp0694和Tp0963的親疏水區(qū)域分布比較平均(圖1)。

圖1 Tp溶血素家族蛋白親疏水性正值為疏水性區(qū)域；負值為親水性區(qū)域。

2.2 Tp溶血素家族蛋白結(jié)構(gòu)域和信號肽分析

利用TMHMM Server軟件在線分析Tp溶血素家族蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。Tp0027含有4個跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于第35～57位、95～117位、122～144位、165～187位氨基酸殘基處；Tp1037含有7個跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于第37～59位、74～96位、103～122位、132～154位、161～178位、188～210位、217～236位；其余3種溶血素?zé)o跨膜結(jié)構(gòu)。通過NCBI分析可知，在Tp溶血素蛋白家族中，除Tp1037結(jié)構(gòu)域為hlyⅢ外，其余4種預(yù)測的溶血素蛋白均含有tlyC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑OG1253超家族。而SMART預(yù)測結(jié)果則為除Tp1037外，其余4種溶血素家族蛋白均含有CorC_HlyC功能結(jié)構(gòu)域，同時Tp0649在49～98位氨基酸存在一個CBS結(jié)構(gòu)域(圖2)。通過SignalP 6.0預(yù)測蛋白信號肽，發(fā)現(xiàn)僅Tp0028存在一個長為26個氨基酸的信號肽，其余Tp溶血素家族蛋白不含信號肽。

圖2 Tp溶血素家族蛋白結(jié)構(gòu)域

2.3 Tp溶血素家族蛋白糖基化、磷酸化位點及亞細胞定位預(yù)測

溶血素家族蛋白發(fā)生磷酸化的殘基主要有絲氨酸(serine,Ser)、蘇氨酸(threonine，Thr)和酪氨酸(tyrosine、Tyr)。將磷酸化閾值設(shè)為0.5時，溶血素家族蛋白均含有多個磷酸化位點(表2)。另外，除Tp0027外，其余蛋白均不具有糖基化位點。Tp0027的糖基化位點位于第373位天冬氨酸(Asn)。結(jié)果顯示兩種方法對Tp0936的預(yù)測結(jié)果相矛盾，但CELLO預(yù)測出在細胞胞質(zhì)膜中的可信度達7分，所以推測5種溶血素家族蛋白位于細胞胞質(zhì)膜的可能性大(表3)。

表2 Tp溶血素家族蛋白磷酸化及糖基化位點預(yù)測

表3 Tp溶血素家族蛋白亞細胞定位

2.4 Tp溶血素家族蛋白一級結(jié)構(gòu)相似性及功能結(jié)構(gòu)域分析

在Protein-Blast數(shù)據(jù)庫中搜索與Tp溶血素家族蛋白相關(guān)基因編碼產(chǎn)物氨基酸序列相似的蛋白序列，可發(fā)現(xiàn)與目標蛋白相似的物種多達上百種。用MEGA多序列比對5種Tp溶血素家族蛋白氨基酸序列及其最適匹配的序列，發(fā)現(xiàn)匹配度最高的3個序列均源于密螺旋體。除螺旋體來源外，梭狀芽孢桿菌與Tp0027匹配度最高，嗜糖黃桿菌與Tp0028匹配度最高，Tp0963與β變形桿菌匹配度最高。

2.5 Tp溶血素家族蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD發(fā)現(xiàn)，預(yù)測的Tp溶血素家族蛋白均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主要的二級結(jié)構(gòu)類型，中間由延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角連接(圖3)。

圖3 Tp溶血素家族蛋白二級結(jié)構(gòu)分析垂直線由長到短依次為α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。

2.6 Tp溶血素家族蛋白B細胞表位分析

SVMTriP在線軟件分析Tp溶血素家族蛋白均含有多個B細胞表位。Tp0028含有9個抗原表位，Tp0027和Tp1037含有6個抗原表位，Tp0649和Tp0936均含有4個抗原表位，軟件推薦可信度最高的B細胞表位見表4。

表4 Tp溶血素家族蛋白B細胞表位預(yù)測

2.7 Tp溶血素家族蛋白CD4+T細胞和CD8+T細胞表位預(yù)測

NetMHC II pan-3.2預(yù)測可知5種溶血素家族蛋白CD4+T細胞表位各有不同。SYFPEITHI分數(shù)與結(jié)合能力呈正比，IEDB百分位數(shù)與結(jié)合能力呈反比。利用SYFPEITHI和IEDB兩種在線軟件預(yù)測抗原表位，篩選出兩種軟件顯示結(jié)合能力均高的結(jié)果。結(jié)果表明：Tp溶血素家族蛋白有多個細胞表位，即Tp0027有7個CD4+T細胞表位、36個CD8+T細胞表位；Tp0028有62個CD8+T細胞表位；Tp0649有22個CD8+T細胞表位；Tp0936有1個CD4+T細胞表位、25個CD8+T細胞表位；Tp1037有4個CD4+T細胞表位、25個CD8+T細胞表位。

3 討 論

既往研究表明Tp主要有菌體莢膜樣物質(zhì)、外膜蛋白、透明質(zhì)酸酶3種致病因素[11]，尚未證實其具有致病毒素，且具體致病機制尚不明確。溶血素通常被認為是多種人類病原體的毒力因子，鉤端螺旋體及豬痢疾蛇形螺旋體產(chǎn)生的溶血素具有細胞毒性，在其致病機制中發(fā)揮重要的作用[12-13]?；蚪M分析顯示Tp有5種與細菌溶血素相似的編碼序列。本研究利用生物信息學(xué)從基因水平分析出了除Tp1037外的其余4種梅毒螺旋體溶血素家族蛋白有CorC_HlyC結(jié)構(gòu)域。同源性分析Tp1037與蠟樣芽胞桿菌的溶血素Ⅲ在進化樹上相距較近，Tp0649與豬痢疾蛇形螺旋體溶血素tlyC在進化樹上相距較近，說明Tp1037與蠟樣芽胞桿菌的溶血素Ⅲ和Tp0649與豬痢疾蛇形螺旋體可能來源于同一祖先，而蠟樣芽胞桿菌溶血素Ⅲ的溶血功能已被證實[14]，Tp的5種溶血素蛋白均具有發(fā)揮細胞毒性的分子基礎(chǔ)。

本文預(yù)測出蛋白質(zhì)的一般性質(zhì),如氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、等電點、親水指數(shù)等可為預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用提供參考。氨基酸序列的疏水性特征與蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[15]。亞細胞定位與蛋白質(zhì)功能相關(guān)聯(lián)[16-17]。在線分析出5種溶血素家族蛋白位于細胞胞質(zhì)膜的可能性最大，同時通過BioEdit軟件預(yù)測Tp溶血素家族蛋白Tp0027和Tp1037有跨膜結(jié)構(gòu)域，說明溶血素可能作為一種膜蛋白而發(fā)揮作用，對Tp溶血素家族的后續(xù)研究提供新思路。分析發(fā)現(xiàn)Tp的5種溶血素家族蛋白均含有人B細胞表位和T細胞表位，說明溶血素家族蛋白對人的T細胞和B細胞存在某種識別機制。以溶血素為抗原的新型疫苗還有待研究。

綜上所述，Tp溶血素家族蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果為研究梅毒的致病機制提供新方向及理論基礎(chǔ)，這5個溶血素家族蛋白基因在Tp致病過程中發(fā)揮的具體作用還需實驗進一步證實。