蘇梅 郭麗娟 秦引林

(江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司，江蘇 南京 210014)

腦脈利顆粒是由益母草、三七、黃芪、姜黃、川芎、紅花、丹參、赤芍、當(dāng)歸、白芍、川牛膝十一味中藥組成的復(fù)方制劑，經(jīng)多中心隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證明，腦脈利顆粒治療血瘀氣虛型中風(fēng)療效顯著[1-2]，無(wú)明顯不良反應(yīng)，為臨床治療中風(fēng)病的一劑良藥。針對(duì)腦脈利顆粒質(zhì)量研究，文獻(xiàn)報(bào)道有鹽酸水蘇堿、黃芪甲苷、益母草堿、芍藥苷的定量檢測(cè)[3]，以及丹參酮 ⅡA、姜黃素、人參皂苷 Rgl的含量測(cè)定[4]，未見(jiàn)腦脈利顆粒中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高有文章報(bào)道。

腦脈利顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中鑒別有四項(xiàng)。其中，丹參的鑒別用到了有毒試劑苯，現(xiàn)尋找無(wú)毒環(huán)保的試劑進(jìn)行替換，開(kāi)發(fā)合適的薄層鑒別展開(kāi)劑。姜黃的鑒別，根據(jù)生產(chǎn)工藝原標(biāo)準(zhǔn)僅控制姜黃素，方法穩(wěn)定性差，故此次標(biāo)準(zhǔn)提高用姜黃對(duì)照藥材作為對(duì)照鑒定本品中的姜黃。鹽酸水蘇堿含量擬采用HPLC-ELSD 法替代TLCS法測(cè)定，儀器方法專(zhuān)屬性及精密度、準(zhǔn)確度均有明顯提高，另外樣品處理進(jìn)行簡(jiǎn)化，省時(shí)省力，對(duì)控制生產(chǎn)成本有較顯著影響。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260液相色譜儀、Agilent 1260 infinity蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、Agilent Zorbax 300-SCX(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱；METTLER XS105十萬(wàn)分之一電子天平、XS3DU百萬(wàn)分之一電子天平。硅膠G板(青島海洋化工分廠)，硅膠GF254板(青島海洋化工分廠)。

1.2材料 姜黃對(duì)照藥材(批號(hào)：121188-201605)；丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-201721含量99.5%)、鹽酸水蘇堿(批號(hào)：110712-201916含量99.2%)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，)；缺丹參陰性樣品(江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：11-180916)；缺姜黃陰性樣品(江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：11-181101)；缺益母草陰性樣品(江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：210317)；腦脈利顆粒(江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：11-190605、11-190610、11-191006、11-191010、11-190610、11-200101、11-200110、11-210107、11-210110、11-210112、11-210110)；乙腈(TEDIA，色譜純)；Milli-Q超純水，其余試劑均為分析純。

2 TLC鑒別

2.1丹參鑒別 取腦脈利顆粒3 g，研細(xì)，加水30 mL，加濃氨試液2 mL，搖勻，用無(wú)水乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并無(wú)水乙醚提取液，揮干，殘?jiān)佣燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加二氯甲烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-二氯甲烷(1∶6)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的暗紅色斑點(diǎn)。陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

1.缺丹參陰性樣品，2.腦脈利顆粒 批號(hào)11-190101,3.腦脈利顆粒 批號(hào)11-190102，4.腦脈利顆粒 批號(hào)11-190103,5.丹參酮ⅡA對(duì)照品 批號(hào)110766-201721

2.2姜黃鑒別 取本品3 g，置適宜的具塞三角瓶中，加水2 mL使?jié)櫇瘢o置5 min，再加無(wú)水乙醚6 mL，充分搖勻后，置冰水浴中超聲處理45 min，取上清液濃縮定容至1 mL，作為供試品溶液。另取姜黃對(duì)照藥材0.9 g，置適宜的具塞三角瓶中，加水2 mL使?jié)櫇瘢o置5 min，再加無(wú)水乙醚6 mL，充分搖勻后，置冰水浴中超聲處理45 min，取上清液至20 mL量瓶中，加無(wú)水乙醚至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液、陰性溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(20∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果：供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.缺姜黃陰性樣品;2.腦脈利顆粒 批號(hào)11-190101;3.腦脈利顆粒 批號(hào)11-190102;4.腦脈利顆粒 批號(hào)11-190103;5.姜黃對(duì)照藥材 批號(hào)121188-201605

3 HPLC-ELSD含量測(cè)定

3.1分析方法

3.1.1色譜條件 色譜柱：以強(qiáng)陽(yáng)離子交換鍵合硅膠為填充劑(Agilent Zorbax 300-SCX，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈- 0.03 mol·L-1甲酸銨溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH值至2.0)(15∶85)；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35 ℃。理論塔板數(shù)：按鹽酸水蘇堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

3.1.2對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸水蘇堿對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并制成每1 mL約含0.2 mg的溶液，即得。

3.1.3供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，取適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.1.4陰性溶液的制備 取缺益母草陰性樣品研磨，取約1 g，精密稱(chēng)定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱(chēng)定重量，密塞，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

3.2方法驗(yàn)證

3.2.1專(zhuān)屬性 精密量取空白溶劑、缺益母草陰性樣品、對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結(jié)果表明：方法專(zhuān)屬性良好。

圖3 腦脈利顆粒含量測(cè)定專(zhuān)屬性圖

3.2.2進(jìn)樣精密度 精密量取對(duì)照品溶液5 μL、20 μL分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察進(jìn)樣精密度，結(jié)果表明：進(jìn)樣體積為5 μL時(shí)對(duì)照品溶液保留時(shí)間RSD值為0.07%，小于1.0%，峰面積對(duì)數(shù)RSD值為0.3%，小于5.0%；進(jìn)樣體積為20 μL時(shí)對(duì)照品溶液保留時(shí)間RSD值為0.3%，小于1.0%，峰面積對(duì)數(shù)RSD值為0.2%，小于5.0%。說(shuō)明本方法進(jìn)樣精密度良好。

3.2.3溶液穩(wěn)定性 分別取同一供試品溶液及對(duì)照品溶液在室溫條件下放置，分別于0、2、4、8、12、24、48 h精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察溶液的放置穩(wěn)定性，結(jié)果表明：供試品溶液在室溫條件下放置48 h，鹽酸水蘇堿峰面積對(duì)數(shù)RSD值為0.9%，小于5.0%；對(duì)照品溶液在室溫條件下放置48 h，鹽酸水蘇堿峰面積對(duì)數(shù)RSD值為0.5%，小于5.0%；說(shuō)明供試品溶液和對(duì)照品溶液在室溫條件下放置48 h穩(wěn)定性良好。

3.2.4線性 密量取3.1.2項(xiàng)下鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液3，5，10，15，20，30 μL注入液相色譜儀，每個(gè)進(jìn)樣量進(jìn)樣兩針，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸分析。

結(jié)果表明：對(duì)照品溶液在618.41 ng～6184.13 ng范圍內(nèi)，以進(jìn)樣量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸分析，相關(guān)系數(shù)(R)為0.9999，故線性關(guān)系良好。

圖4 鹽酸水蘇堿含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2.5重復(fù)性 取本品(11-210110批)平行配制6份供試品溶液，分別精密量取對(duì)照品溶液5 μL、20 μL，供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算結(jié)果，考察重復(fù)性，結(jié)果表明：6份供試品含量均不少于25 mg/袋，均值為51.7 mg/袋，且含量的RSD值為1.5%，小于5.0%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

3.2.6中間精密度 由不同實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，溶液的配制同重復(fù)性。分別精密量取對(duì)照品溶液5 μL、20 μL，供試品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算結(jié)果，考察中間精密度，結(jié)果表明：12份供試品含量均不少于25 mg/袋，且含量的RSD值為3.3%，小于5.0%，故中間精密度良好。

3.2.7準(zhǔn)確度 本底溶液：同中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(54.4 mg/袋)。

80%回收率溶液：取本品(11-210110批)適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入0.031 mg·mL-1的鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液50 mL，稱(chēng)定重量，密塞，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，平行配制3份。

100%回收率溶液：取本品(11-210110批)適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入0.052 mg·mL-1的鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液50 mL，稱(chēng)定重量，密塞，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，平行配制3份。

120%回收率溶液：取本品(11-210110批)適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱(chēng)定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入0.073 mg·mL-1的鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液50 mL，稱(chēng)定重量，密塞，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，平行配制3份。

精密量取本底溶液、回收率溶液20 μL，對(duì)照品溶液5 μL、20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察準(zhǔn)確度，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率結(jié)果

結(jié)果表明：80%、100%和120%這三個(gè)濃度各三份樣的回收率均在95%～105%的范圍內(nèi)，9份回收率的RSD值為3.0%，小于5.0%，故準(zhǔn)確度良好。

3.2.8耐用性 在改變流速(±0.1 mL·min-1)、柱溫(±5 ℃)、流動(dòng)相比例(±2%)、pH值(±0.05)、不同色譜柱、不同進(jìn)樣體積(30 μL)條件下，空白溶劑和缺益母草陰性樣品對(duì)含量測(cè)定均無(wú)干擾，對(duì)照品溶液的理論塔板數(shù)均符合規(guī)定，供試品的含量均不少于25 mg/袋，且含量的RSD值為2.9%，小于5.0%，故本方法耐用性良好。

3.2.9十批樣品檢測(cè) 取近3年生產(chǎn)的10批樣品，按照擬定的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)樣品中鹽酸水蘇堿的含量。含量均不少于25 mg/袋，符合標(biāo)準(zhǔn)限度規(guī)定。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果

4 討論

4.1TLC鑒別

4.1.1丹參鑒別 為了替換原標(biāo)準(zhǔn)方法中的苯，嘗試選擇與苯/乙酸乙酯系統(tǒng)極性相近的石油醚/二氯甲烷系統(tǒng)，考察不同配比石油醚/二氯甲烷=1∶4、石油醚/二氯甲烷=1∶6、石油醚/二氯甲烷=1∶8進(jìn)行展開(kāi)，石油醚/二氯甲烷系統(tǒng)在1∶4、1∶6、1∶8時(shí)，Rf值、分離度均符合要求。三種比例展開(kāi)劑相比較，1∶6和1∶8優(yōu)于1∶4，因此，考慮選用石油醚/二氯甲烷=1∶6作為展開(kāi)系統(tǒng)。

此外，為評(píng)價(jià)薄層色譜法的適用性，還對(duì)薄層色譜法進(jìn)行耐用性實(shí)驗(yàn)，分別在常溫(10～30 ℃)和低溫(2～8 ℃)、在高濕(75%RH)和低濕(20%RH)以及不同廠家硅膠板(青島海洋和青島康業(yè)鑫)等3個(gè)方面進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦脈利顆粒的TLC鑒別結(jié)果不受溫度、相對(duì)濕度和不同硅膠板等條件改變的影響，方法耐用性較好。

4.1.2姜黃鑒別 姜黃主要成分為姜黃揮發(fā)油和姜黃素[5-7]，本品在生產(chǎn)制備過(guò)程中，采用水蒸氣蒸餾法提取姜黃揮發(fā)油，提取揮發(fā)油后的水液備用。而姜黃素成分不具揮發(fā)性[8]，在水中溶解度也較小，所以原標(biāo)準(zhǔn)中采用姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品鑒別，時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，不穩(wěn)定，無(wú)法很好地監(jiān)控質(zhì)量，不可行?？紤]到姜黃揮發(fā)油是本品中姜黃提取的有效成分之一，采用姜黃藥材對(duì)照法鑒定姜黃，更全面的監(jiān)控姜黃藥材的質(zhì)量，經(jīng)研究，方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性、專(zhuān)屬性好。故修訂用姜黃藥材作為對(duì)照鑒定。

4.2HPLC-ELSD含量測(cè)定 益母草為腦脈利顆粒處方中君藥，其主要指標(biāo)性成分為鹽酸水蘇堿[9]。鹽酸水蘇堿屬于季銨堿，結(jié)構(gòu)中無(wú)共軛體系，在192 nm處有微弱吸收，可以通過(guò)HPLC紫外檢測(cè)器選擇末端吸收檢測(cè)益母草中鹽酸蘇堿含量[9-14]。中國(guó)藥典2020年版中益母草顆粒采用HPLC紫外檢測(cè)方法[15]，選擇強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀-磷酸為流動(dòng)性。雖然采用HPLC紫外末端吸收波長(zhǎng)檢測(cè)益母草中的鹽酸水蘇堿是可行的，但是對(duì)于含有多種復(fù)方成分的中成藥相關(guān)干擾較大，檢測(cè)較不準(zhǔn)確。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)為通用型檢測(cè)器，可用來(lái)檢測(cè)無(wú)紫外吸收的成分?，F(xiàn)有技術(shù)中采用HPLC-ELSD方法時(shí)[16-18]，色譜柱的選擇多為氨基柱[19]、丙基酰胺鍵合硅膠柱[20]等。腦脈利顆粒中鹽酸水蘇堿檢測(cè)采用氨基柱、丙基酰胺鍵合硅膠柱等色譜柱，需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理，且腦脈利顆粒樣品中鹽酸水蘇堿峰形較差。

原標(biāo)準(zhǔn)中TLCS方法檢測(cè)時(shí)，供試品溶液處理需采用732型氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)行除雜，操作繁瑣，且影響含量測(cè)定的準(zhǔn)確度。而采用超聲提取制備，省時(shí)省力，減少操作誤差；樣品制備操作僅需一個(gè)小時(shí)，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省了檢測(cè)成本(省去填充柱、填料等)，操作方便快捷。