賈 偉，馬 強(qiáng)，宿靜瑤，李正男，劉義龍，孫平平*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.呼和浩特市園林植保站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

楊樹(shù)(Populusspp.)為楊柳科楊屬植物，因速生性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，成為我國(guó)東北、西北和華北地區(qū)防護(hù)林、用材林和綠化的先鋒樹(shù)種[1]。楊樹(shù)腐爛病又稱爛皮病，是楊樹(shù)干部的常見(jiàn)病及多發(fā)病，造成楊樹(shù)樹(shù)干干腐或枯梢[2]。干腐型在發(fā)病初期病斑呈水漬狀暗褐色，溫濕度適宜時(shí)，發(fā)病部位迅速壞死，皮層內(nèi)部變軟、腐爛，有酒糟味，后期病斑失水干縮下陷，病斑部樹(shù)皮龜裂，與健康部形成明顯無(wú)固定形狀的黑褐色邊緣，患病部位易與木質(zhì)部剝離，病斑上長(zhǎng)出許多黑色的針頭狀小突起，為病原菌的分生孢子器，濕度大時(shí)能從里面分泌出乳白色黏稠液體，遇空氣變干后呈橙黃色或橙紅色卷絲狀，為病原菌的分生孢子角?？萆倚驮诎l(fā)病初期呈暗灰色或暗褐色，不形成明顯的病斑，病斑在適宜條件下不斷擴(kuò)大，包圍樹(shù)干近1周時(shí)，上部枯死[3]。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)楊樹(shù)整株死亡，甚至毀林，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。楊樹(shù)腐爛病除危害楊樹(shù)外，還可危害楊柳科、榆科等林木樹(shù)種，在我國(guó)南北方均嚴(yán)重發(fā)生[4-5]，在東北尤為嚴(yán)重，在川西高原和長(zhǎng)江中游一帶的發(fā)病率也高達(dá)50%，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[6]。

隨著楊樹(shù)腐爛病的嚴(yán)重發(fā)生，目前已有多人對(duì)其病原菌進(jìn)行分離和鑒定。郭開(kāi)發(fā)等[7]利用ITS與β-tublin基因?qū)π陆锬竞酉掠魏鷹顦?shù)腐爛病的主要病原菌進(jìn)行鑒定，確定新疆胡楊樹(shù)腐爛病的病原為金黃殼囊孢(Cytosporachrysosperma)；孫祥瑞[8]利用形態(tài)學(xué)、組織學(xué)結(jié)合分子鑒定證明引起河北省白楊樹(shù)腐爛病的病原菌為金黃殼囊孢(C.chrysosperma)，有性型為(Valsasordida)。Wang等[9]和Zhang等[10]研究表明C.chrysosperma、C.translucens、C.fugax(有性態(tài)為V.salicina)、C.atrocirrhata、C.kantschavelii、C.nivea(有性態(tài)為V.nivea)、C.tritici和C.davidiana8種腐爛病病原菌在國(guó)內(nèi)楊樹(shù)上均有發(fā)生。內(nèi)蒙古地處我國(guó)北方，寒冷、干旱的氣候條件給腐爛病菌的侵染提供了有利條件，腐爛病在內(nèi)蒙古全境均嚴(yán)重發(fā)生。

為了明確內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市楊樹(shù)腐爛病的病原菌種類(lèi)，本研究于2020年4月對(duì)呼和浩特市內(nèi)公園進(jìn)行楊樹(shù)腐爛病樣品采集。對(duì)采集的表現(xiàn)為典型楊樹(shù)腐爛病的樣品進(jìn)行了病原菌分離、致病性測(cè)定及病原菌鑒定。該結(jié)果將為內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)楊樹(shù)腐爛病的防控提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料采集 于2020年4月在呼和浩特市的賽罕區(qū)草原絲綢之路文化公園、賽罕區(qū)敕勒川公園、新城區(qū)成吉思汗公園、玉泉區(qū)南湖公園和回民區(qū)新華公園5個(gè)公園進(jìn)行楊樹(shù)腐爛病樣品的采集。新疆楊(Populusalbavar.pyramidalis)已經(jīng)發(fā)展成為這些公園的主要栽培樹(shù)種，本次采集的樣品均為發(fā)病新疆楊。將采集的樹(shù)皮組織置于自封保鮮袋中帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存，用于病原菌的分離。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和試劑 孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂(無(wú)水)0.5 g,孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(Potato Dextrose，PD)：同PDA，不加瓊脂粉。

普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR擴(kuò)增試劑盒，購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱，HPX-9162MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；實(shí)體解剖鏡，LEICA EZ4W，德國(guó)徠卡儀器有限公司；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；顯微鏡，LEICA ICC50W，德國(guó)徠卡儀器有限公司；電泳儀，BG-Power 600K450W，北京百晶生物技術(shù)有限公司；PCR儀，624BR47696，美國(guó)伯樂(lè) Bio-Rad 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用常規(guī)組織分離法[11]分離病原菌：取采集到的楊樹(shù)皮，選取病健交界處組織，依次用1%次氯酸鈉浸泡3 min，75%酒精浸泡30 s，滅菌水漂洗3次，放入孟加拉紅培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d；挑取菌落形態(tài)不同的菌絲轉(zhuǎn)入PDA平板上恒溫培養(yǎng)，28 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)3～4 d后挑取菌落邊緣菌絲移入新的PDA平板，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，重復(fù)以上操作直至得到純培養(yǎng)物。所得菌種均保存在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院果樹(shù)病害病原生物學(xué)及綜合防控研究室。

1.2.2 病原菌的致病性檢測(cè) 參照喬國(guó)彪等[12]的方法進(jìn)行病原菌的致病性檢測(cè)。在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)新區(qū)校園中取2年生的健康楊樹(shù)枝條，去除葉片后將其截成10～15 cm長(zhǎng)。依次用1%的次氯酸鈉浸泡5 min，75%酒精浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗3次，風(fēng)干后用石蠟封住枝條兩端。用6 mm直徑的實(shí)心打孔器燙傷樹(shù)皮后，去掉燙傷樹(shù)皮，在燙傷位點(diǎn)接種在PDA上培養(yǎng)了5 d、直徑為6 mm待測(cè)分離物菌餅，浸濕無(wú)菌脫脂棉裹住接種位點(diǎn)后用保鮮膜包扎，每個(gè)處理重復(fù)10個(gè)枝條。以只接種PDA培養(yǎng)基的枝條作為陰性對(duì)照。處理枝條置于鋪有雙層紗布的塑料盤(pán)中，保鮮膜封口保濕，25 ℃、16 h光照/8 h黑暗、70%濕度條件下培養(yǎng)，在處理后5 d去掉脫脂棉，用保鮮膜包扎后繼續(xù)培養(yǎng)，定時(shí)觀察記錄發(fā)病情況。致病性檢測(cè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 病原菌形態(tài)觀察 將病原菌接種于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌落特征，并在顯微鏡下觀察發(fā)病枝條上子實(shí)體的橫切面形態(tài)結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)特征。

1.2.3.2 病原菌的分子鑒定 用無(wú)菌接種環(huán)挑取病原菌菌絲至PD液體培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，用雙層無(wú)菌紗布過(guò)濾收集菌絲體，28 ℃烘箱中烘干，液氮研磨。利用真菌DNA提取試劑盒提取病原菌的DNA。

以DNA為模板，分別采用通用引物ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b擴(kuò)增病原菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)和β微管蛋白(β-tubulin，TUB2)。ITS序列的PCR反應(yīng)體系均為：2×M5 Hipper超光速M(fèi)ix 10 μL，ddH2O 7 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。TUB2序列PCR反應(yīng)的退火溫度為61 ℃，其余同ITS序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京)回收純化后送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI利用BLASTn上進(jìn)行同源序列檢索，選取相似序列，應(yīng)用MEGA 6.0軟件，采用ClustalW算法對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，用比鄰法(neighbor-joining，NJ)，校正值設(shè)定為1 000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀和病害調(diào)查

在采樣的5個(gè)地點(diǎn)發(fā)病楊樹(shù)主要表現(xiàn)為干腐型危害癥狀，主干樹(shù)皮壞死、下陷，樹(shù)皮上有黑色分生孢子器或黃色孢子角，壞死組織與健康組織形成明顯的病健交接，樹(shù)皮容易從樹(shù)體剝落；對(duì)于新發(fā)病楊樹(shù)主要表現(xiàn)為發(fā)病部位組織液外滲，有明顯的酒糟味(圖1)。在調(diào)查的176株新疆楊中，發(fā)病楊樹(shù)共30株，發(fā)病率占到5.9%。

注：a.感病楊樹(shù)表現(xiàn)為發(fā)病部位組織液外流；b.感病楊樹(shù)表現(xiàn)為主干樹(shù)皮壞死。圖1 感染腐爛病楊樹(shù)癥狀Fig.1 Poplar with stem rot symptoms

2.2 菌株分離、致病性檢測(cè)及組織形態(tài)觀察

從采集的樣品上共分離、純化得到8個(gè)菌株分別為從賽罕區(qū)草原絲綢之路文化公園分離的YSFL1、賽罕區(qū)敕勒川公園分離的YSFL2、新城區(qū)成吉思汗公園分離的YSFL3，玉泉區(qū)南湖公園分離的YSFL4-1、YSFL4-2、回民區(qū)新華公園分離的YSFL5-1、YSFL5-2和YSFL5-3。對(duì)分離得到的8個(gè)菌株進(jìn)行致病性檢測(cè)，結(jié)果顯示，接種了病原菌YSFL1、YSFL3和YSFL4-2的楊樹(shù)枝條均在接種后14 d開(kāi)始發(fā)病，而其他楊樹(shù)枝條均未發(fā)病。首先是接種部位出現(xiàn)腐爛變軟的現(xiàn)象，YSFL3與YSFL4-2接種后20 d病斑表面樹(shù)皮皺縮，病健交界明顯；25 d后在接種部位周邊出現(xiàn)黑色或黃褐色的分生孢子器，隨后擴(kuò)散到整枝，子實(shí)體的孔口溢出黃色膠質(zhì)卷絲狀物，為分生孢子角。YSFL1在接種后2～3個(gè)月在接種部位產(chǎn)生黑色產(chǎn)孢體，隨后溢出橙黃色分生孢子角(圖 2)。顯微鏡觀察3個(gè)菌株的分生孢子器，產(chǎn)孢體均為多腔室，分生孢子無(wú)色、單孢、臘腸型，YSFL1的孢子長(zhǎng)約為3.20 μm，YSFL3與YSFL4的孢子長(zhǎng)約為4.53 μm與4.52 μm(圖3)，3株菌的發(fā)病特性、分生孢子器及分生孢子形態(tài)完全符合楊樹(shù)腐爛病菌致病特性[3,14]。

注：CK為接種PDA，YSFL1為接種后3個(gè)月，YSFL3和YSFL4-2為接種后1個(gè)月。圖2 YSFL1、YSFL3和YSFL4-2致病菌在楊樹(shù)枝條上的危害癥狀Fig.2 Symptoms of poplar branches inoculated with YSFL1,YSFL3 and YSFL4-2

注：a1、b1、c1為YSFL1、YSFL3、YSFL4-2的分生孢子器切面；a2、b2、c2為YSFL1、YSFL3、YSFL4-2的分生孢子。圖3 YSFL1、YSFL3和YSFL4-2的產(chǎn)孢體橫切面和分生孢子Fig.3 Transverse microtome section of the conidiomata,and the conidia of YSFL1、YSFL3 and YSFL4-2

2.3 病原菌皿內(nèi)培養(yǎng)特征觀察

病原菌YSFL1在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后菌落由中心向四周呈放射狀分布，病原菌正面灰白色，菌絲緊密；背面黑黃相間。20 d后菌落顏色加深，正面中心為灰白色，菌落前沿為深灰色，背面中心為深黃色與黑色相間，前沿為黑色(圖4)。根據(jù)菌落特征及產(chǎn)孢體和分生孢子的組織形態(tài)觀察，初步判斷菌株YSFL1符合隱球殼屬(Cryptosphaerialsp.)基本特征[15]。

注：a1、b1、c1為YSFL1培養(yǎng)7 d，YSFL3、YSFL4-2培養(yǎng)5 d的皿內(nèi)形態(tài)；a2、b2、c2為YSFL1培養(yǎng)20 d， YSFL3、YSFL4-2培養(yǎng)14 d的皿內(nèi)形態(tài)。圖4 YSFL1、YSFL3與YSFL4-2的皿內(nèi)形態(tài)Fig.4 The morphologic characters of YSFL1,YSFL3 and YSFL4-2 on PDA medium

病原菌YSFL3在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后菌落正面呈黃灰色，背面為白色和淡黃色，14 d后菌落正面為淺棕色，背面為黃色，YSFL4-2在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后菌落呈白色，14 d為淺棕色。14 d后菌落YSFL3與YSFL4-2均長(zhǎng)出黑色球狀產(chǎn)孢體為分生孢子器，上有黃色孢子角產(chǎn)生(圖4)。根據(jù)菌落特征及產(chǎn)孢體形態(tài)，初步判斷菌株 YSFL3、4-2符合殼囊孢屬(Cytosporasp.)基本特征[14]。

2.4 病原菌分子鑒定

采用通用引物ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b從菌株YSFL1、3、4-2分別克隆獲得了長(zhǎng)度為576、595和591 bp的ITS基因片段和417、498、496 bp的BTU2片段，將上述基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLASTn程序進(jìn)行同源序列比對(duì)，選擇近緣序列使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖5、圖6)，結(jié)果表明：YSFL1的ITS序列與BUT2序列均與Cryptosphaerialpullmanensis聚在一枝上，因此YSFL1被鑒定為C.pullmanensis。菌株YSFL3與YSFL4-2的ITS、BUT2序列均與Cytosporatritici、Cytosporachrysosperma、Valsasordida聚在一枝上。V.sordida為C.chrysosperma的有性型[5]，因此YSFL3、YSFL4-2為C.tritici、C.chrysosperma中的一種。結(jié)合培養(yǎng)特性與組織觀察，由于C.tritici在PDA上的菌絲密度比C.chrysosperma小，在PDA中不能產(chǎn)生產(chǎn)孢體[5,10]，分生孢子平均長(zhǎng)度達(dá)到5.04 μm，略長(zhǎng)于C.chrysosperma的4.52 μm[14]，而本研究分離的YSFL3和YSFL4-2在PDA上的菌絲生長(zhǎng)緊密，均能產(chǎn)生分生孢子器，分生孢子為4.52 μm，形態(tài)學(xué)、組織學(xué)結(jié)合分子序列確定YSFL3與YSFL4-2屬于C.chrysosperma。

圖5 基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.5 The phylogenetic tree constructed based on the ITS sequences

圖6 基于β-tubulin序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 The phylogenetic tree constructed based on the β-tubulin sequences

3 結(jié)論與討論

本研究從內(nèi)蒙古呼和浩特市的賽罕區(qū)、新城區(qū)、玉泉區(qū)與回民區(qū)公園的新疆楊上采集樣品，并從賽罕區(qū)草原絲綢之路文化公園、新城區(qū)成吉思汗公園與玉泉區(qū)南湖公園的楊樹(shù)樣品中分別分離得到Y(jié)SFL1、YSFL3、YSFL4-2 3株能引起楊樹(shù)腐爛病的病原真菌，形態(tài)學(xué)、組織學(xué)結(jié)合ITS與BTU2序列分析將其鑒定為隱球殼屬的C.pullmanensis(YSFL1)與殼囊孢屬的金黃殼囊孢C.chrysosperma(YSFL3、YSFL4-2)。

本研究利用ITS與TUB2序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，YSFL1均與C.pullmanensis聚到一枝，YSFL1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d仍未有產(chǎn)孢體產(chǎn)生，接種枝條后2～3個(gè)月才有產(chǎn)孢體及橙黃色孢子角產(chǎn)生，該結(jié)果與隱球殼屬腐爛病發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，不易產(chǎn)生產(chǎn)孢體，會(huì)造成樹(shù)皮死亡、變黑、呈煤煙色相一致[16]。Adam等[17]在分析南非Cytospora真菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)也發(fā)現(xiàn)利用ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)無(wú)法將C.tritici與C.chrysosperma區(qū)分開(kāi)，該研究認(rèn)為2個(gè)種為一個(gè)“種復(fù)合體”。張玉博等[14]對(duì)中國(guó)殼囊孢屬真菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)利用ITS序列無(wú)法將2個(gè)種分開(kāi)，而利用TUB2與TEF序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)C.tritici均能單獨(dú)聚為一枝，但是在NCBI中查不到該研究中所用C.tritici菌株的TUB2與TEF序列。本研究利用YSFL3與YSFL4的ITS與TUB2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)均不能區(qū)分C.tritici與C.chrysosperma，結(jié)合培養(yǎng)特性與組織學(xué)觀察，YSFL3、YSFL4-2的分生孢子為4.52 μm，在PDA上的菌絲生長(zhǎng)緊密，均能產(chǎn)生分生孢子器，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子序列確定YSFL3與YSFL4-2屬于C.chrysosperma。該結(jié)果與張玉博等[14]提出利用培養(yǎng)特征、組織學(xué)觀察和分子序列等多個(gè)手段相結(jié)合是對(duì)楊樹(shù)腐爛病進(jìn)行鑒定的有效手段一致。

金黃殼囊孢(C.chrysosperma)，有性型為V.sordida，是造成楊樹(shù)腐爛病的主要病原菌。此外，C.translucens、C.fugax、C.atrocirrhata、C.kantschavelii、C.nivea、C.tritici和C.davidiana等也是我國(guó)楊樹(shù)腐爛病的病原菌[9-10]。目前在內(nèi)蒙古地區(qū)加格達(dá)奇、烏蘭浩特和土默特的楊樹(shù)(Populussp.)、滿歸的大青楊(Populusussuriensis)、呼和浩特的山楊樹(shù)(Populusdavidiana)上均分離到了C.chrysosperma[14]，除此之外，在內(nèi)蒙古楊樹(shù)、山楊樹(shù)、大青楊上也分離到C.davidiana、C.fugax、C.atrocirrhata、與C.translucens腐爛病病原菌[9,14]。本研究在內(nèi)蒙古呼和浩特市賽罕區(qū)草原絲綢之路文化公園、新城區(qū)成吉思汗公園，玉泉區(qū)南湖公園的新疆楊上發(fā)現(xiàn)了C.pullmanensis與C.chrysosperma引起楊樹(shù)腐爛病的發(fā)生，該結(jié)果是對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)楊樹(shù)腐爛病病原菌種類(lèi)的有力補(bǔ)充。

在美國(guó)，C.pullmanensis是引起弗里氏楊樹(shù)(P.fremontii)的主要病原菌，在美國(guó)西部幾乎所有的楊樹(shù)上均有發(fā)生[18]。Mehrabi等[19]于2017年首次在伊朗發(fā)現(xiàn)C.pullmanensis可引起黑楊(Populusnigra)的腐爛病。Ma等[15]于2016年報(bào)道了C.pullmanensis可引起我國(guó)新疆地區(qū)的銀白楊樹(shù)(Populusalba)的腐爛病。郭開(kāi)發(fā)等[20]于2018年對(duì)新疆農(nóng)田防護(hù)林楊樹(shù)腐爛病的病原進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)箭桿楊(P.nigracv.afghanica)和胡楊(Populuseuphratica)的腐爛病均由C.pullmanensis引起，新疆楊(P.albacv.pyramidalis)上的病原菌為C.chrysosperma、C.nivea，未發(fā)現(xiàn)C.pullmanensis。本研究首次在內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)C.pullmanensis可引起新疆楊樹(shù)腐爛病，該結(jié)果是對(duì)C.pullmanensis的寄主及發(fā)生地點(diǎn)的有力補(bǔ)充，為開(kāi)展楊樹(shù)的防治和病原菌的鑒別研究奠定基礎(chǔ)。