劉 麗，牛曉露，常 利，朱巖巖，李合華

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)多好發(fā)于中老年人群，隨著我國老年化進程的加速，缺血性腦卒中發(fā)病率呈現(xiàn)日益上升趨勢，年均增長率在8.3%左右[1]。缺血性腦卒中后可伴有不同程度的認知功能障礙，部分病人可進展為癡呆，流行病學研究結(jié)果顯示，腦卒中后認知功能障礙及癡呆患病率分別為80.97%和48.91%[2]。然而，目前缺血性腦卒中后認知功能障礙的具體發(fā)病機制尚不清楚[3-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于一種非編碼RNA，miRNA表達水平上調(diào)或下調(diào)與缺血性腦卒中后認知功能障礙關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，急性腔隙性腦梗死病人血清miR-29c-3p水平降低，而miR-191-5p和miR-20a-5p水平升高，且均與認知功能障礙的嚴重程度明顯相關(guān)[5-6]。miR-181a長度為110 bp[7]，目前關(guān)于缺血性腦卒中病人血清中miR-181a表達水平尚不清楚，本研究分析缺血性腦卒中病人血清miR-181a表達水平與認知功能的相關(guān)性，為尋找評估缺血性腦卒中后認知功能障礙的潛在生物標志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年3月于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的168例缺血性腦卒中病人，根據(jù)是否發(fā)生認知功能障礙分為認知功能障礙組(73例)和非認知功能障礙組(95例)。納入標準：①缺血性腦卒中病人經(jīng)頭顱磁共振成像(MRI)或CT檢測確診，缺血性腦卒中診斷符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[8]中的具體診斷標準；②缺血性腦卒中病人發(fā)病前無認知功能障礙；③能完成常規(guī)保守治療；④具備小學及小學以上文化程度。排除標準：①存在腦出血、腦血管畸形及顱內(nèi)占位性病變等病人；②精神障礙性疾病病人；③住院期間合并難以控制的危急重癥；④腦卒中后抑郁、失語等影響各種量表評定病人；⑤失訪病人。認知功能障礙評估：治療結(jié)束3個月后，對所有缺血性腦卒中病人進行門診或電話隨訪，采用中文版簡易智能精神狀態(tài)檢查量表(Mini Mental State Examination，MMSE)[9]評估認知功能，MMSE主要從定向、回憶、計算、語言、復述、執(zhí)行功能與命名7個維度進行評估，回答錯誤或不知道計0分，回答正確計1分，滿分30分，MMSE得分<26分為異常。MMSE得分越低，說明認知功能越低，根據(jù)MMSE評分分為重度認知功能障礙組(MMSE評分≤10分)、中度認知功能障礙組(MMSE評分11～19分)和輕度認知功能障礙組(MMSE評分20～25分)。認知功能障礙組與非認知功能障礙組病人一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性，詳見表1。本研究中所有的研究對象均知情同意且簽署知情同意協(xié)議書。

表1 認知功能障礙組與非認知功能障礙組病人一般資料比較

1.2 檢測指標

1.2.1 血清中miR-181a表達水平的檢測 入院后于清晨空腹抽取所有研究對象外周靜脈血5 mL并離心取上層血清，立即將血清轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中并置入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用Trizol法提取所有研究對象血清中總RNA，濃度采用A260/A280比值表示，當比值為1.8～2.2時進行下一步實驗。miR-181a和內(nèi)參U6引物由上海生工生物工程有限公司合成(見表2)。根據(jù)miScript II RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(QIAGEN公司，德國)，反應體系：miScriptHispct(5x)4 μL，miScriptNucleics(10x)2 μL，miScript Reverse Transcriptase 2 μL，RNA模板12 μL，反應條件：37 ℃ 50 min，95 ℃ 8 min，最后加入80 μL雙蒸水(ddH2O)水稀釋。采用miScript SYBR Green試劑盒進行miR-181a定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測(QIAGEN公司，德國)，反應體系：SYBR Green I 混合液10 μL，U6正向引物和反向引物各0.25 μL，cDNA 6 μL，無RNA酶水3 μL。反應條件：預加熱95 ℃，30 min，變性94 ℃，15 s，退火55 ℃，30 s，延伸70 ℃，30 s，共40個循環(huán)。Ct值為反應孔的熒光信號達到設定閾值的循環(huán)數(shù)，血清中miR-181a的相對表達量為2-△Ct=CtmiR-181a-CtU6。

表2 miR-181a和U6引物序列(5′-3′)

1.2.2 血清NSE和S-100β表達水平的檢測 入院后于清晨抽取所有研究對象空腹外周靜脈血5 mL于試管中，靜置10 min后離心，取上層血清保存到新的EP管中，放入-80 ℃冰箱中保存。血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和S-100β表達水平均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測，檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(中國)。所有檢測操作步驟嚴格按照說明書進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 認知功能障礙組與非認知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平及MMSE評分比較 與非認知功能障礙組相比，認知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平均明顯升高，而MMSE評分明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。詳見表3。

表3 兩組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平及MMSE評分比較

2.2 認知功能障礙各亞組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平比較 輕度認知功能障礙組、中度認知功能障礙組和重度認知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；與輕度認知功能障礙組、中度認知功能障礙組相比，重度認知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平明顯升高(P<0.05)，重度認知功能障礙組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平明顯高于中度認知功能障礙組(P<0.05)。詳見表4。

表4 認知功能障礙各亞組血清miR-181a、NSE和S-100β表達水平比較

2.3 認知功能障礙組血清miR-181a與NSE、S-100β和MMSE評分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-181a與NSE呈正相關(guān)(r=0.514，P<0.05)，與MMSE評分呈負相關(guān)(r=-0.336，P<0.05)，而與S-100β無明顯相關(guān)性(r=0.223，P=0.087)。

2.4 血清miR-181a表達水平在診斷缺血性腦卒中后認知功能障礙的ROC曲線 繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，miR-181a診斷缺血性腦卒中后認知功能障礙的曲線下面積(AUC)為 0.889[95%CI(0.826，0.951)]，當取最佳截斷值為1.14時，診斷敏感度和特異度分別為90.5%和84.2%。詳見圖1。

圖1 血清miR-181a診斷缺血性腦卒中后認知功能障礙的ROC曲線

3 討 論

認知功能障礙嚴重影響缺血性腦卒中病人生活質(zhì)量，增加再住院和死亡風險，年齡、教育程度、載脂蛋白E基因多態(tài)性、高血壓、糖尿病、高脂血癥等均是腦卒中后認知功能障礙的危險因素[10]。目前，缺血性腦卒中后認知功能障礙具體機制尚不清楚。miRNA屬于一種非編碼RNA，主要參與信號轉(zhuǎn)導、細胞分化及增殖等多種生物學功能，miRNA在體內(nèi)血清中表達穩(wěn)定，易于檢測[11]，miR-181a屬于一種功能性miRNA，研究顯示，miR-181a與缺血性腦卒中發(fā)病機制有關(guān)[12-13]。本研究分析缺血性腦卒中病人血清中miR-181a表達水平及其與缺血性腦卒中后認知功能障礙的相關(guān)性。

MMSE量表是國內(nèi)常用于篩查認知功能障礙的量表，信度和效度均較高，國外研究顯示缺血性腦卒中后認知功能障礙發(fā)病率為24%～39%[14-15]，而我國長沙一項隊列研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中后認知功能障礙發(fā)病率為41.8%[16]。本研究通過對缺血性腦卒中病人進行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中后認知功能障礙發(fā)生率為43.45%(73/168)，與非認知功能障礙組相比，認知功能障礙組血清miR-181a表達水平明顯升高，且與認知功能障礙的嚴重程度明顯相關(guān)，提示miR-181a可能在缺血性腦卒中后認知功能障礙的發(fā)病機制中發(fā)揮了一定作用。miR-181a屬于一種典型的多功能miRNA，參與了細胞增殖、分化、免疫炎癥等多種細胞生物學過程，與腫瘤[17]、阿爾茨海默病[18]等多種疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-181a與缺血性腦卒中發(fā)病機制密切相關(guān)。呂燕妮等[19]通過生物信息學方法證實，miR-181a與多種轉(zhuǎn)錄因子相互調(diào)節(jié)相互作用，在腦卒中發(fā)病機制中的多種復雜因子構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡中處于核心位置，細胞實驗證實當干擾miR-181a表達時，下游炎癥信號通路中NF-κB p65受體受到明顯抑制，說明miR-181a可能通過炎性因子NF-κB介導腦卒中的發(fā)病機制。同時Moon等[20]發(fā)現(xiàn)當拮抗miR-181a后能明顯減少大鼠腦梗死灶體積和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失。Ouyang等[21]在體內(nèi)和體外實驗中均證實miR-181a表達水平上調(diào)后會加重缺血性腦卒中病情的發(fā)生發(fā)展。主要與miR-181a上調(diào)后明顯降低GRP78蛋白的表達有關(guān)，而葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)屬于熱休克蛋白之一，同時也是反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的一項標志性蛋白，GRP78低表達會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)遭到破壞，細胞凋亡通路被啟動，導致細胞缺血死亡[22]。紅花注射液治療缺血性腦卒中療效明顯，動物實驗證實，紅花注射液干預后會明顯縮小缺血性腦卒中小鼠腦梗死面積和降低神經(jīng)損傷評分，同時發(fā)現(xiàn)腦組織中GRP78 mRNA表達上調(diào)[23]。目前，關(guān)于miR-181a與缺血性腦卒中后認知功能障礙的研究報道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a可反映缺血性腦卒中病人認知功能障礙的嚴重程度。動物實驗證實，miR-181a屬于α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體介導的突觸可塑性和記憶機制中的一個負性調(diào)控因子，miR-181a可導致突觸功能障礙和記憶損傷，當抑制miR-181a表達后能減少小鼠的記憶缺陷[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病病人血清中miR-181a表達水平上調(diào)，且與病人輕度認知功能障礙有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)miR-181a與各項異性分數(shù)(FA)呈負相關(guān)[18]，而各項異性分數(shù)與認知功能障礙有關(guān)，頭顱磁共振擴散張量成像顯示認知功能障礙病人各項異性分數(shù)明顯降低[25]。宋磊[26]也證實，當干擾miR-181a表達后可抑制腦缺血-再灌注損傷后的炎癥反應。而過度炎癥反應會加重腦缺血損傷，使得缺血性腦卒中病人更易發(fā)生認知功能障礙[10，27]；另一方面，NSE和S-100β在腦組織細胞中的活性較高。本研究發(fā)現(xiàn)，認知功能障礙病人血清中NSE和S-100β表達水平明顯升高，且與認知功能障礙嚴重程度有關(guān)。蔡姝萍等[28]同樣發(fā)現(xiàn)，血清中NSE、S-100β表達水平越高，認知功能障礙越嚴重，與本研究結(jié)果基本相一致，但本研究還發(fā)現(xiàn)miR-181a與NSE呈正相關(guān)，但與S-100β無明顯相關(guān)性。牛莉莉等[29]研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中小鼠模型血清中NSE和S-100β表達水平明顯升高，且與梗死面積及神經(jīng)功能評分均呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示，miR-181a可能通過介導NSE的表達上調(diào)而參與缺血性腦卒中后認知功能障礙的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，缺血性腦卒中后認知功能障礙病人血清miR-181a水平明顯升高，miR-181a水平升高是其作為缺血性腦卒中后認知功能障礙的基礎，為探討血清miR-181a水平是否可作為診斷缺血性腦卒中后認知功能障礙的一項血清學標志物；ROC曲線分析后發(fā)現(xiàn)，miR-181a在診斷缺血性腦卒中后認知功能障礙的AUC為 0.889，當取最佳截斷值1.14時，診斷敏感度和特異度分別為90.5%和84.2%。因此，血清miR-181a可作為缺血性腦卒中后認知功能障礙的一項血清學標志物。

綜上所述，缺血性腦卒中后認知功能障礙病人血清中miR-181a表達水平明顯升高，高表達的miR-181a與認知功能障礙發(fā)病機制可能相關(guān)，采用ROC曲線證實miR-181a診斷缺血性腦卒中后認知功能障礙的臨床效能較好。