顧衛(wèi)衛(wèi)，曹磊磊，施盈盈，朱 慧

天麻是一味常用而較名貴的中藥，臨床上廣泛應(yīng)用于頭暈癥、神經(jīng)衰退、血管神經(jīng)性頭痛。近年來，天麻開始應(yīng)用于治療缺血性腦卒中。缺血性腦卒中的發(fā)病原因為腦部血液供應(yīng)障礙，是老年人最為多見的疾病之一，具有較高的致殘率及致死率。隨著社會的老齡化進展，缺血性腦卒中是其中一種比較高發(fā)和嚴重的慢性疾病，導致神經(jīng)功能障礙以及不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷。缺血性腦卒中損傷機制復雜，涉及能量代謝、鈣超載、自由基損傷、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等。目前主要采用抗凝、溶栓、抗血小板以及神經(jīng)保護治療中風[1-2]?，F(xiàn)在很多人都熱衷于神經(jīng)保護藥，因為保護神經(jīng)的藥物能使大腦更能對抗中風引起的損傷。近年來越來越多的研究開始專注于傳統(tǒng)中藥，天麻就是其中一種受人們熱捧的傳統(tǒng)中藥，具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥等多種藥理活性[3]。天麻所具有的神經(jīng)保護作用備受研究者的關(guān)注[4-8]。在我國天麻用于治療缺血性腦卒中病人，療效確切，并能明顯改善病人的行為障礙[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)給予天麻28 d，可減小缺血性腦卒中大鼠的腦梗死面積，改善其行為學癥狀，降低凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3的表達水平，所以推測天麻對缺血性腦卒中病人的保護作用可能與Cathepsin B-Caspase通路有關(guān)。本研究探討天麻對腦缺血后星形膠質(zhì)細胞損傷是否具有直接保護作用及Cathepsin B-Caspase信號通路與天麻保護細胞的作用有無關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要藥品與試劑 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量300 g左右，不超過±10%。天麻純度 98.0%，紅四氮唑(TTC)，水合氯醛，抗體：Anti-GFAP(Millipore)、β-actin(Sigma)、anti-CathepsinB(MILLIPORE)、Anti-Caspase-3(MILLIPORE)。

1.2 主要實驗儀器 自動加熱墊；電子天平；標準腦立體定位儀；電子顯微鏡；大鼠抓力測定儀；電泳儀；電泳槽；離心機；超聲細胞破碎儀；恒溫電熱水浴鍋。

1.3 溶液配制 天麻的配制：10 g天麻溶于500 mL生理鹽水，然后再稀釋成4 mg/mL，常溫保存。4%TTC：稱取TTC 4 g，加入蒸餾水中，定容至100 mL，存放于4 ℃。4%多聚甲醛溶液：稱取多聚甲醛80 g，50 ℃水浴，溶解于800 mL蒸餾水，待完全溶解后，加入磷酸緩沖鹽溶液，調(diào)節(jié)pH 值為7.2～7.4，蒸餾水定容至2 000 mL，4 ℃冷藏保存。

1.4 缺血再灌注模型的建立 麻醉大鼠，固定好，切開頸部，分離出右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，扎緊頸外動脈以及頸總動脈的近心端，用動脈夾夾住遠心端，然后在此中間部位剪一小口，插入尼龍線，松開動脈夾，慢慢地將尼龍線推進血管內(nèi)8～19 mm，使得大腦中動脈缺血，缺血2 h后，將尼龍線去除，腦部血流再灌注。假手術(shù)組同樣經(jīng)過以上過程但不插線。缺血再灌注28 d對大鼠進行行為學測試以及神經(jīng)癥狀評分[10-13]。天麻持續(xù)治療28 d后，取大鼠大腦、小腦、低位腦干以及嗅球去除，然后冠狀切為5片，每片厚度一致。然后用TTC染色，37 ℃避光染色30 min。染色完畢之后，再將腦片放入4%甲醛固定，固定完后取出腦片吸干或晾干，紅色的為正常組織，白色的為缺血壞死組織，拍照，使用SigmaScan Pro 5軟件分析缺血梗死體積，腦梗死體積=梗死腦組織體積/右腦體積。

1.5 分組方法及指標檢測

1.5.1 蛋白免疫印跡(Western Blot)法測定大鼠大腦皮層膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、Cathepsin B、Caspase-3表達 選取50只健康雄性大鼠，隨機分為假手術(shù)組、模型組、天麻低劑量(50 mg/kg)組、天麻中劑量(100 mg/kg)組、天麻高劑量(150 mg/kg)組，每組10只。天麻各劑量組和模型組均進行缺血再灌注手術(shù)，模擬人的缺血性腦卒中，假手術(shù)組進行假手術(shù)，不插線，其他操作都相同。天麻各劑量組每天給大鼠灌胃1次，天麻連續(xù)給藥28 d，模型組灌胃同體積溶劑。天麻連續(xù)給藥28 d后，取缺血區(qū)腦組織，Western Blot法檢測各組GFAP及凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3表達水平。

1.5.2 天麻對氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)誘導的星形膠質(zhì)細胞乳酸脫氫酶(LDH)的影響 細胞培養(yǎng)板中接種上星形膠質(zhì)細胞，為了觀測天麻對正常培養(yǎng)的星膠細胞生長有無影響，除了OGD/R組給予天麻處理外，正常培養(yǎng)組也給予相應(yīng)的天麻處理，總共分為8組，分別為對照組(non-OGD組)、non-OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、non-OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、non-OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組、OGD/R組[氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)2 h，再給予正常培養(yǎng)基，恢復供氧]以及OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組，每組有3個復孔。給藥要求提前0.5 h，OGD處理時以及更換培養(yǎng)基時給予相應(yīng)劑量的天麻。OGD/R結(jié)束后，細胞損傷程度測定采用LDH法。

1.5.3 Western Blot法測定OGD/R誘導的星形膠質(zhì)細胞中GFAP、Cathepsin B、Caspase-3表達變化 原代培養(yǎng)的星膠細胞分為non-OGD組、non-OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、non-OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、non-OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組、OGD/R組以及OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組。給藥提前0.5 h，OGD處理時以及更換培養(yǎng)基時給予相應(yīng)劑量的天麻。OGD/R結(jié)束后，采用Western Blot法檢測各組GFAP、Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 天麻對缺血再灌注大鼠行為學神經(jīng)癥狀的影響

2.1.1 神經(jīng)癥狀評分 模型組神經(jīng)癥狀評分為(3.00±0.67)分，天麻低、中、高劑量組神經(jīng)癥狀評分分別為(2.90±0.57)分、(2.80±0.63)分、(2.40±0.52)分。天麻高劑量組神經(jīng)癥狀評分低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

2.1.2 抓力測試 模型組前肢抓力(90.87±13.07)g，假手術(shù)組前肢抓力(175.72±4.17)g，模型組前肢抓力明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)。天麻低、中、高劑量組前肢抓力分別為(92.36±11.19)g、(102.97±12.12)g、(108.45±13.55)g，天麻中、高劑量組前肢抓力高于模型組(P<0.01)。詳見圖1。

2.1.3 圓桶測試 圓桶測試按右前肢的使用次數(shù)占總使用次數(shù)的百分比計算，模型組圓桶測試值為0.81±0.12，假手術(shù)組圓桶測試值為0.01±0.06，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。天麻低、中、高劑量組圓桶測試值為分別為0.80±0.08、0.74±0.11、0.68±0.08，天麻高劑量組圓桶測試值明顯低于模型組(P<0.05)。詳見圖1。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.2 天麻對缺血性再灌注大鼠腦梗死體積的影響 模型組腦梗死體積為(52.66±2.39)%，天麻低、中、高劑量組腦梗死體積分別為(38.61±1.89)%、(28.48±3.80)%、(14.95±1.34)%，與模型組相比，天麻低、中、高劑量組腦梗死體積明顯縮小(P<0.01)。詳見圖2、圖3。

圖2 各組TTC染色的切片圖(A為假手術(shù)組；B為模型組；C為天麻低劑量組；D為天麻中劑量組；E為天麻高劑量組。白色為缺血壞死部分)

與模型組比較，＊P<0.01。

2.3 天麻對缺血再灌注誘導的皮層缺血區(qū)及OGD/R誘導的星形膠質(zhì)細胞中GFAP、LDH的影響 Western Blot檢測結(jié)果顯示，模型組 GFAP蛋白表達明顯低于對照組(P<0.01)，天麻中、高劑量組GFAP蛋白表達高于模型組(P<0.01)。在體外試驗中，OGD/R組GFAP蛋白表達明顯低于non-OGD組(P<0.01)，OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組GFAP蛋白表達明顯高于OGD/R組(P<0.01)。LDH漏出率升高，代表細胞受到損傷，即LDH值越高，細胞損傷程度越高。為了證明天麻對缺血腦細胞的保護作用，特別是缺血星形膠質(zhì)細胞的保護作用，采用LDH法測定OGD/R 24 h 后LDH漏出率。與正常培養(yǎng)的細胞相比，OGD/R組 24 h LDH漏出率明顯升高。隨著給藥劑量的增加，LDH漏出率逐漸降低，OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組LDH漏出率低于OGD/R組(P<0.05或P<0.01)。詳見圖4、圖5。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

與non-OGD組比較，＊P<0.01；與OGD/R組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.4 天麻對缺血再灌注誘導的大腦皮層缺血區(qū)Cathepsin B、Caspase蛋白表達的抑制作用 Western Blot檢測結(jié)果顯示，模型組缺血區(qū)Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)，天麻低、中、高劑量組大腦皮層缺血區(qū)Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平均低于模型組(P<0.05或P<0.01)。詳見圖6、圖7。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01。

2.5 天麻對OGD/R 誘導的凋亡蛋白Cathepsin B、Caspase-3的影響 non-OGD組Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達水平較低，但經(jīng)OGD/R處理后，與這兩種凋亡蛋白明顯激活，OGD/R組Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達較non-OGD組明顯升高(P<0.01)，OGD+天麻小劑量(0.1 μmol/L)組、OGD+天麻中劑量(1 μmol/L)組、OGD+天麻大劑量(10 μmol/L)組Cathepsin B、Caspase-3蛋白表達明顯低于OGD/R組(P<0.05或P<0.01)，提示天麻(0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L)可有效地降低OGD/R誘導的星形膠質(zhì)細胞中Cathepsin B、Caspase-3的蛋白表達。詳見圖8、圖9。

與non-OGD組比較，＊P<0.01；與OGD/R組比較，#P<0.05，△P<0.01。

與non-OGD組比較，＊P<0.01；與OGD/R組比較，#P<0.01。

3 討 論

缺血性腦卒中是嚴重的致殘和致死疾病，會引起嚴重的腦損傷以及行為學障礙。有文獻報道，在大鼠大腦創(chuàng)傷性損傷模型以及心肌缺氧缺血模型中，長期給予天麻，能改善行為學癥狀，明顯減小壞死灶體積[14]，也有文獻報道天麻可以明顯地抑制繼發(fā)性炎癥[15]。以往研究著重于缺血急性期的大腦病理學變化，但現(xiàn)在開始關(guān)注缺血的亞急性期或者更長的一段時間[16-17]。缺血引起的水腫一般發(fā)生在急性期內(nèi)，但腦體積縮小或者萎縮一般會經(jīng)歷較長的一段時間，這個觀點在目前的研究中也得以證實。缺血再灌注后，長期給予天麻，可明顯改善大鼠行為學癥狀，兩前肢得以平衡使用，且明顯增強前肢抓力力度，通過染色統(tǒng)計分析，白色梗死體積明顯縮小，提示對于缺血性腦損傷模型，天麻具有腦保護作用。但是其具體的作用機制尚未明確。武海云等[18]研究證實，天麻素可以通過抑制腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)細胞中 p38 蛋白磷酸化水平，降低磷酸化及抑制活性 Caspase-3蛋白表達，Caspase-3能催化許多關(guān)鍵蛋白的裂解，細胞凋亡壞死時，其常被激活。高濃度谷氨酸能夠激活Caspase-3蛋白的表達，武海云等[18]的實驗中谷氨酸處理組Caspase-3蛋白激活，給予天麻素72 h后Caspase-3蛋白表達量與谷氨酸處理組相比明顯降低，提示天麻素可抑制谷氨酸誘導的凋亡，其機制可能與Caspase-3依賴性途徑發(fā)生的凋亡相關(guān)?；谝陨系睦碚摶A(chǔ)及研究進展，在大鼠的腦缺血再灌注模型以及細胞的OGD/R模型上觀察天麻對星形膠質(zhì)細胞的保護作用，及其對Cathepsin-caspase 信號通路的影響。本實驗研究證明，大鼠腦缺血再灌注以后，溶酶體酶Cathepsin B以及Caspase-3表達明顯升高，天麻能有效地降低溶酶體酶Cathepsin B以及Caspase-3的表達水平。同時在體外試驗中也證實了天麻對Cathepsin B、Caspase-3激活的抑制作用。本實驗證實了天麻對缺血性腦卒中的治療療效，且通過體外體內(nèi)模型試驗，闡明天麻可能通過抑制Cathepsin B Caspase的細胞凋亡途徑，從而對損傷的腦細胞發(fā)揮保護作用，為缺血性腦卒中疾病的治療提供了潛在的藥物靶點。