劉思遠(yuǎn)，于明帥，張 科

常見的心血管疾病有冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和心臟病等，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，心肌缺血再灌注引起的心肌損傷是心血管疾病的主要誘因，因此，如何有效減緩心肌細(xì)胞缺血再灌注引起的細(xì)胞損傷是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1-2]。心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)作為心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌損傷機(jī)制[3]。普魯卡因(procaine，PCA)是一種局部麻醉的氨基酯類藥物，具有毒性小、麻醉效果好和價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)[4]。有研究顯示，PCA可以通過上調(diào)熱休克蛋白27(HSP27)促進(jìn)過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減緩心肌細(xì)胞的氧化損傷[5]。有研究結(jié)果顯示，Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)可能參與心肌細(xì)胞H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[6]。蔡智慧等[7]研究結(jié)果顯示，梔子苷可以通過抑制TLR4/NF-κB通路減緩H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞炎性損傷。因此，本研究通過H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞建立模型，探討PCA是否可以通過TLR4/NF-κB通路影響H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 大鼠H9c2心肌細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、高糖DEME培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素、鏈霉素、四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；鹽酸普魯卡因注射液，購(gòu)自江蘇悅興藥業(yè)有限公司，規(guī)格：50 mg(20 mL)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32024570；NF-κB通路抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；Bcl-2抗體、Bax抗體、TLR4抗體、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)p65抗體、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)抗體、NF-κB p65抗體、NF-κB抑制蛋白(IκBα)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；凋亡試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 培養(yǎng)細(xì)胞和分組 取出H9c2心肌細(xì)胞在含有胎牛血清、雙抗(1%青霉素-鏈霉素)的高糖DEME培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，且培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2、95%N2。每隔2 d換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，然后將細(xì)胞分組，對(duì)照組(Con組)在培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)細(xì)胞；H/R組在95% N2和5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，然后在正常條件下培養(yǎng)6 h；PCA低劑量組(H/R+PCA-L組)、PCA中劑量組(H/R+PCA-M組)、PCA高劑量組(H/R+PCA-H組)分別采用濃度為3.50 mg/L、7.00 mg/L、14.00 mg/L的PCA處理細(xì)胞，30 min后參照H/R組培養(yǎng)條件，進(jìn)行H/R處理細(xì)胞。H/R+PCA組、H/R+PCA+PDTC組分別采用14.00 mg/L PCA及5 μmol/L NF-κB通路抑制劑PDTC處理細(xì)胞，之后進(jìn)行H/R處理。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度，取100 μL添加至96孔板內(nèi)，每孔加入相應(yīng)的MTT試劑20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)試劑。然后采用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，調(diào)整密度后添加至6孔板內(nèi)，每孔內(nèi)2×105個(gè)細(xì)胞，置入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。加入胰酶消化重懸細(xì)胞，離心倒去上清液。每孔加入相應(yīng)的5 μL磷酯酰絲氨酸熒光素(AnnexinV-FITC)和10 μL碘化丙啶(PI)試劑，室溫下反應(yīng)20～30 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Bcl-2、Bax和TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞用于提取各組細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)過BCA試劑檢測(cè)定量蛋白的濃度。在蛋白加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸變性10 min后，經(jīng)過SDD-聚丙烯酰胺(PAGE)分離處理，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入稀釋的Bcl-2、Bax、TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα、NF-κB p65、IκBα一抗，孵育過夜，加入二抗，孵育1 h后，加入增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。以GAPDH為內(nèi)參，通過Image J軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)LDH、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，2 500 r/min離心10 min后，收集各組細(xì)胞的上清液，然后采用LDH試劑盒、MDA試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-6試劑盒和TNF-α試劑盒檢測(cè)LDH、MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 PCA對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力和凋亡的影響 與Con組比較，H/R組細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖1和表1。

圖1 PCA對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響(A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率；B為各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖)

表1 各組心肌細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

2.2 PCA對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較，H/R組LDH、MDA明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組LDH、MDA明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組LDH、MDA水平比較

2.3 PCA對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響 與Con組比較，H/R組IL-1β、IL-6、TNF-α明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組IL-1β、IL-6、TNF-α明顯降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 單位：pg/mL

2.4 PCA對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB通路的影響 與Con組比較，H/R組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與H/R組比較，H/R+PCA-L組、H/R+PCA-M組、H/R+PCA-H組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖2及表4。

圖2 各組心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組心肌細(xì)胞TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)比較

2.5 PCA通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、凋亡的影響 與H/R+PCA組比較，H/R+PCA+PDTC組細(xì)胞活力、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖3及表5。

圖3 PCA通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響(A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡率；B為凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖)

表5 兩組心肌細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

2.6 PCA通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 與H/R+PCA組比較，H/R+PCA+PDTC組LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α明顯降低(P<0.05)。詳見表6。

表6 兩組心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子比較

3 討 論

心肌缺血再灌注是因?yàn)楣跔顒?dòng)脈阻塞、供血不足一段時(shí)間后，心肌重新恢復(fù)灌注引起的心肌細(xì)胞損傷，近年來，在我國(guó)心血管疾病病人發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，受飲食習(xí)慣、吸煙、環(huán)境和精神等眾多因素的影響[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌細(xì)胞H/R模型，發(fā)現(xiàn)在H/R條件下，心肌細(xì)胞的活力受到抑制，細(xì)胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減低，Bax蛋白表達(dá)增加，提示心肌細(xì)胞H/R模型構(gòu)建成功。Bcl-2和Bax屬于Bcl-2家族的成員，在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中起著核心的作用，多種疾病中Bcl-2表達(dá)升高起到抗凋亡的作用，而Bax表達(dá)下調(diào)起到促凋亡的作用[10-11]。LDH是一種氧化還原酶，大多存在于腎臟器官中，其次是心肌組織和骨骼，LDH含量的高低可以反映氧化損傷的程度[12-13]。MDA在機(jī)體內(nèi)抗氧化過程中具有重要作用，若機(jī)體內(nèi)氧自由基大量增多，導(dǎo)致過氧化物含量增加，可以間接反映氧化損傷[14]。炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α參與多種細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)增加，在病理狀態(tài)下加重細(xì)胞的炎性損傷[15]。PCA作為一種局部麻醉藥，在多種抗腫瘤方面取得了明顯的作用效果[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過PCA處理細(xì)胞后，與H/R模型組比較，PCA各劑量組細(xì)胞活力明顯增加，細(xì)胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)降低，這說明PCA可以明顯減緩H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并提高細(xì)胞活力。

TLR4/NF-κB信號(hào)通路是心肌缺血再灌注損傷研究中經(jīng)典的信號(hào)通路，TLR4異常激活后可以啟動(dòng)MyD88蛋白表達(dá)增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)下游NF-κB蛋白的活化，促進(jìn)炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6釋放，造成心肌細(xì)胞的炎性損傷[17-18]。TLR4、NF-κB在H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制TLR4/NF-κB可以減緩H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)[19]。劉婷婷等[20]研究結(jié)果顯示，氧化苦參堿通過抑制NF-κB信號(hào)通路減緩H/R誘導(dǎo)的凋亡和氧化應(yīng)激，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。花旗松素能夠抑制NF-κB信號(hào)通路減緩H/R誘導(dǎo)心肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，抑制心肌細(xì)胞的凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，在H/R模型中，TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα在心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，經(jīng)過PCA處理后，PCA各劑量組TLR4、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)，說明PCA可以抑制TLR4/NF-κB通路表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過加入NF-κB通路抑制劑PDTC后，細(xì)胞活力明顯增加，而細(xì)胞凋亡率、LDH、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)受到抑制，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)減低，說明PCA通過抑制TLR4/NF-κB的表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，PCA能夠減緩H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)。