陳晶晶，馬曉昌

高血壓是指以體循環(huán)動脈壓升高為主要特征的最常見的慢性非傳染性疾病。根據(jù)《中國心血管病報告2018》[1]，我國高血壓病的患病率持續(xù)上升，而治療率和控制率處于較低水平，成人高血壓粗患病率為27.9%[2]，控制率僅為7.2%[3]，是我國面臨的重要公共衛(wèi)生問題。中醫(yī)古籍雖無高血壓之名，但可將其歸屬于中醫(yī)“眩暈”“頭痛”等范疇，多因機體陰陽失衡、肝腎虧虛、陰虛陽亢而致，治療多以補益肝腎為法。杞菊地黃丸由枸杞子、菊花、山茱萸、山藥、熟地黃、牡丹皮、澤瀉、茯苓八味藥組成，具有補腎養(yǎng)肝、滋陰潛陽之功效。臨床研究表明，杞菊地黃丸治療高血壓的療效顯著，具有抗炎、抗氧化和改善血管舒縮功能的作用[4-5]，但其藥效物質基礎和具體作用機制尚不明確。因此，系統(tǒng)研究杞菊地黃丸治療高血壓的作用機制具有積極意義。

網絡藥理學是基于藥理學、生物信息學和系統(tǒng)生物學等相關學科，運用計算機虛擬計算技術而發(fā)展出的一門學科，可深入探索中藥及中藥復方多成分、多靶點、多通路的作用機制，尤其適用于研究中藥及其復方[6]。本研究通過網絡藥理學從分子水平闡明杞菊地黃丸的藥物活性成分、作用靶點以及與高血壓之間的相互作用關系，以期為其進一步的藥理作用和臨床應用提供理論依據(jù)和研究方向。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選 以“枸杞”“菊花”“地黃”“山藥”“山茱萸”“澤瀉”“茯苓”“牡丹皮”為主題詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中檢索藥物活性成分，以類藥性(drug likeness，DL)≥0.18和口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%為篩選條件，篩選出符合條件的活性成分進行分析。

1.2 靶點收集 將在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索得到的藥物活性成分作用靶點導入UniProt數(shù)據(jù)庫，將所有人源靶點蛋白名稱校正為其官方名稱。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“hypertension”為關鍵詞進行檢索，將檢索結果中相關度得分≥20分的靶點作為高血壓疾病靶點進行研究，同時摘錄疾病靶點的標準基因名稱。

1.3 構建Venn圖 將杞菊地黃丸藥物活性成分的作用靶點與高血壓相關靶點分別導入Venny在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools//venny/)，生成Venn 圖，獲得疾病與藥物共同作用靶點。

1.4 構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡 將獲得的疾病與藥物共同作用靶點導入STRING 11.0，選擇研究物種為人類，置信度為0.400，獲取蛋白相互作用關系數(shù)據(jù)，再將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建PPI網絡。

1.5 構建藥物活性成分-疾病靶點的可視化網絡 將獲得的疾病與藥物共同作用靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建藥物活性成分-疾病靶點的可視化網絡。

1.6 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 利用David數(shù)據(jù)庫將藥物-疾病共同靶點進行GO、KEGG富集分析。

2 結 果

2.1 藥物活性成分篩選結果 本研究基于樣本量和數(shù)據(jù)復雜性考慮，將OB、DL參數(shù)作為化學成分藥物代謝性質(ADME)篩選條件，篩選后得到139個藥物活性成分，包括45個枸杞活性成分、20個菊花活性成分、2個地黃活性成分、16個山藥活性成分、20個山茱萸活性成分、15個茯苓活性成分、10個澤瀉活性成分、11個牡丹皮活性成分。

2.2 靶點收集 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索得到1 456個杞菊地黃丸藥物活性成分的作用靶點，刪除重復項并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫校正名稱后得到235個靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到7 814個疾病靶點，相關度得分≥20分的靶點有174個，其中相關度較高的靶點是骨形成蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2)、血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)，其中BMPR2相關度得分為124.2分，ACE 為86.26分，AGT 為63.82分。

2.3 藥物與疾病交集靶點的Venn圖 對杞菊地黃丸活性成分作用靶點及高血壓疾病靶點取交集，構建Venn圖，共得到29個藥物與疾病交集靶點(見圖1)，包括核受體亞家族3 c族成員2(NR3C2)、β2-腎上腺素能受體(ADRB2)、β1-腎上腺素受體(ADRB1)、溶質轉運家族6成員4(SLC6A4)、過氧化物酶體增殖物激活受體G(PPARG)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、核受體亞家族3C組成員1(NR3C1)、表皮生長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、原癌基因FOS(FOS)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、白細胞介素 6(IL6)、血紅素加氧酶1(HMOX1)、小窩蛋白1(CAV1)、凝血因子Ⅲ(F3)、縫隙連接蛋白α1(GJA1)、CC型趨化因子配體2(CCL2)、E選擇素(SELE)、內皮型一氧化氮合酶(NOS3)、組織型纖溶酶原激活物(PLAT)、血栓調節(jié)蛋白(THBD)、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、溶質轉運家族2成員4(SLC2A4)、C反應蛋白(CRP)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、過氧化氫酶(CAT)、載脂蛋白B(APOB)、雷帕霉素靶蛋白(MTOR)。

圖1 疾病與藥物交集靶點Venn圖

2.4 PPI網絡 構建PPI網絡(見圖2)，該網絡包括29個節(jié)點、224條邊，節(jié)點表示蛋白，節(jié)點大小和顏色深淺代表節(jié)點連接度(Degree)的大小，節(jié)點越大、顏色越深則Degree值越大；邊表示蛋白之間的相互關系，邊的粗細代表combined score值的大小，邊越粗combined score值越大。由圖中可見連接度較高靶點蛋白是NOS3、IL6、CCL2、VEGFA、MMP9、SERPINE1、PPARG、MMP2、EGFR、CRP、FOS等。

圖2 PPI網絡圖

2.5 藥物活性成分-疾病靶點可視化網絡 將獲得的藥物與疾病交集靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件構建可視化網絡(見圖3)，該網絡包括89個節(jié)點、158條邊，圖中長方形代表藥物活性成分(見表1)，包括15個枸杞活性成分，11個菊花活性成分，7個山藥活性成分，4個山茱萸活性成分，3個茯苓活性成分，5個澤瀉活性成分，1個牡丹皮活性成分以及6個多種藥物共同的活性成分；中央橢圓形代表疾病靶點。藥物活性成分中節(jié)點連接度最高的是MOL000098槲皮素(quercetin)，疾病靶點中節(jié)點連接度最高的是NR3C2。

圖3 藥物活性成分-疾病靶點可視化網絡

表1 杞菊地黃丸藥物活性成分

2.6 GO、KEGG富集分析 GO功能分析結果顯示，主要與蛋白異源二聚體活性、一氧化氮合酶結合、絲氨酸水解酶活性等有關。KEGG富集分析結果顯示，與高血壓有關的通路主要為流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并發(fā)癥的糖基化終末產物(AGE)及其受體(RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication)、缺氧誘導因子-1(hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)信號通路、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、鈣離子信號通路(calcium signaling pathway)等。將分析結果以P值降序排列，取排名前20的條目構建氣泡圖，圖中節(jié)點的大小表示富集基因數(shù)量多少，節(jié)點的顏色由紅色至綠色表示P值由大到小。詳見圖4、圖5。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

3 討 論

滋腎養(yǎng)肝法是治療高血壓病的重要方法之一。杞菊地黃丸出自《醫(yī)級·卷八》，方中枸杞滋補肝腎；菊花清肝熱；熟地黃滋補腎陰；山藥補益脾腎；山萸肉滋補肝腎；澤瀉祛濕降濁；茯苓健脾祛濕；丹皮清熱涼血。諸藥合用，共奏滋腎養(yǎng)肝之功，可有效調節(jié)機體陰陽，控制血壓。本研究分析顯示，杞菊地黃丸治療高血壓的主要藥理成分包括槲皮素、木犀草素、山奈酚等。槲皮素是具有多種生物活性的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎和心血管保護作用，能降低內皮素-1(endothelin-1，ET-1)水平和自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[7-8]。木犀草素能降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓，使自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織中血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)和ET-1表達降低，一氧化氮(nitric oxide，NO)表達升高[9]。

KEGG富集分析結果顯示，流體剪切應力信號通路、AGE-RAGE信號通路、松弛素信號通路、鈣離子信號通路和HIF-1信號通路等與高血壓密切相關。高血壓的基本病理變化包括血管內皮細胞損傷、平滑肌細胞增殖及血管重構等[10]。血流剪切力是血液流經血管壁面時產生的摩擦力，可通過激活機械感受器、特異性轉錄因子、細胞內信號通路以及基因和蛋白的表達等途徑調節(jié)內皮細胞功能[11]。高血壓病人血流動力學改變引起剪切力變化，促使血管內皮細胞損傷，引起血管內皮功能障礙，NO等血管舒張因子合成減少，ET-1等血管收縮因子合成增加，促進血管收縮，血壓升高。AGE及RAGE與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)、氧化應激之間形成正反饋，參與高血壓的發(fā)生發(fā)展。AGE與內皮細胞表面受體結合后，促使ET-1合成增加，ET-1是目前已知的收縮血管作用最強的物質，血管收縮致血壓升高[12]。HIF-1是機體在低氧狀態(tài)時產生的一種核轉錄因子，是由調節(jié)亞基α和構造亞基β組成的異二聚體。HIF-1α信號通路的激活可通過影響RAAS系統(tǒng)和交感神經系統(tǒng)活性調節(jié)血壓。長期慢性缺氧可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，同時清除NO，致血管舒張功能障礙，從而導致血壓升高。ROS可通過增加血管緊張素原的合成，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)[13]。松弛素是一種雙鏈蛋白質，可抑制ET-1和AngⅡ等縮血管物質，同時能增加血管內皮基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)活性，通過將內皮細胞合成釋放的ET-1降解為內皮素，激活內皮素B型受體，促使內皮釋放NO，產生血管擴張效應[14]。鈣離子信號通路可通過調控血管平滑肌收縮、增殖等過程參與高血壓的病理過程[15]。血管收縮力與收縮蛋白對Ca2+的敏感性和胞漿中Ca2+濃度有關，Ca2+可通過興奮-收縮耦聯(lián)調控血管平滑肌張力和小動脈阻力來調節(jié)血壓。PPI網絡中連接度較高的靶點蛋白是MMP9、MMP2、VEGFA、NOS3、IL6、CRP等。MMP是一組能降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的蛋白酶，可通過影響血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的結構和功能從而引起動脈重構，通過釋放VEGF參與血管生成。研究表明，原發(fā)性高血壓病人血清MMP9水平明顯高于血壓正常者，且MMP9水平與大動脈硬度呈正相關[16]，與高血壓左心室肥厚呈正相關，也與左心室舒張功能障礙密切相關[17]。VEGF是一種能促進血管通透性增加、血管內皮細胞遷移和增殖的促血管內皮細胞生長因子。在高血壓病人中VEGF水平明顯升高，在血壓未控制的病人中其升高水平更明顯，且VEGF水平和收縮壓水平成正比[18]。VEGF與其受體VEGFR-2結合后，通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑[19]誘導生成內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，NO表達上調，血管擴張，從而調節(jié)血壓。

炎癥在高血壓的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。本研究KEGG富集分析中腫瘤壞死因子信號通路和IL-17信號通路，PPI網絡中IL-6和CRP是與高血壓有關的重要炎性因子。長期血清炎性因子水平過高可誘導血管微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，直接損傷血管內皮細胞，促使單核-巨噬細胞浸潤，黏附分子(cell adhesion molecules，CAM)等血管活性物質的分泌明顯增加，促進內皮細胞增殖、遷徙和分化，致使血管結構和功能改變，同時NO等內皮依賴性舒血管物質生成和分泌減少，血管阻力增加，血壓升高[20]。Bautista等[21]研究表明，高血壓病人血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6水平明顯高于血壓正常者，且TNF-α和IL-6是高血壓的獨立危險因素。TNF-α是由單核-巨噬細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等生成的一類多肽類炎性細胞因子，可直接或間接損傷血管內皮細胞，減少NO的生成，促進平滑肌細胞增殖[22]，導致高血壓發(fā)生。IL-6是由單核-巨噬細胞、血管內皮細胞及成纖維細胞等分泌的炎性細胞因子，能調節(jié)CRP的表達，促進血管平滑肌細胞增殖，增加平滑肌細胞內Ca2+濃度，促進血管收縮。IL-6基因低甲基化能增加原發(fā)性高血壓的患病風險[23]。

本研究基于網絡藥理學對杞菊地黃丸治療高血壓進行化合物、靶點、GO及KEGG通路分析，建立了杞菊地黃丸藥物活性成分-疾病靶點網絡、PPI網絡，從多個角度探索杞菊地黃丸治療高血壓的分子物質基礎和作用機制，體現(xiàn)了中藥“多成分-多靶點-多途徑”的作用特點，以期為藥物的臨床使用和進一步研究提供理論基礎。