李佳涵，王 慧，劉佳星，杜晨暉*，閆 艷*

整合指紋圖譜與多成分含量測定的酸棗仁湯質(zhì)量評價(jià)研究

李佳涵1，王 慧2，劉佳星1，杜晨暉2*，閆 艷1*

1. 山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006 2. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030619

利用HPLC-DAD-ELSD分析技術(shù)，建立酸棗仁湯指紋圖譜結(jié)合多成分含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供參考。采用Phenomenex C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，體積流量為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，在282 nm和335 nm檢測波長下，分別以芒果苷和斯皮諾素為參照峰；ELSD漂移管溫度105 ℃，載氣體積流量2.5 L/min條件下，以酸棗仁皂苷A為參照峰，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)對10批自制酸棗仁湯進(jìn)行相似度評價(jià)；同時(shí)建立13個(gè)指標(biāo)成分含量測定方法，應(yīng)用于市售產(chǎn)品及自制樣品的質(zhì)量評價(jià)。10批自制酸棗仁湯的平均出膏率為21.57%，在282 nm和335 nm分別標(biāo)定了5個(gè)和4個(gè)共有峰，相似度分別為0.907～0.999、0.926～0.999；HPLC-ELSD指紋圖譜中標(biāo)定了4個(gè)共有峰，相似度為0.946～0.999。13種指標(biāo)成分在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（＞0.995 9），平均加樣回收率為93.69%，RSD值平均為2.04%。10批不同劑型市售產(chǎn)品中新芒果苷、烏藥堿、芒果苷、異芒果苷、甘草苷、斯皮諾素、阿魏酸、6′′′-阿魏酰斯皮諾素、異甘草苷、知母皂苷BII、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和甘草酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.30～3.38、0.02～0.20、0.27～6.04、0.33～1.38、1.54～12.02、0.16～0.87、0.16～1.27、0.04～0.35、0.25～3.12、3.66～20.92、0.36～0.98、0.32～0.89、4.90～36.37 mg/g，波動(dòng)范圍大。自制酸棗仁湯13種成分含量波動(dòng)范圍小。建立了酸棗仁湯HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜與多成分含量測定相結(jié)合的質(zhì)量評價(jià)方法，方法準(zhǔn)確、可靠，為市售酸棗仁湯產(chǎn)品的質(zhì)量控制和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究提供參考。

酸棗仁湯；高效液相色譜法；指紋圖譜；多成分含量測定；質(zhì)量評價(jià)；新芒果苷；烏藥堿；芒果苷；異芒果苷；甘草苷；斯皮諾素；阿魏酸；6′′′-阿魏酰斯皮諾素；異甘草苷；知母皂苷BII；酸棗仁皂苷A；酸棗仁皂苷B；甘草酸

酸棗仁湯（Suanzaoren Decoction）始載于東漢末年張仲景所著《傷寒雜病論》：“酸棗二升、甘草一兩、知母二兩、茯苓二兩、川芎二兩”，“虛勞虛煩不得眠，酸棗湯主之”[1]。方中重用酸棗仁，以其性味甘平，入心肝經(jīng)，養(yǎng)血補(bǔ)肝，寧心安神，為君藥；茯苓寧心安神，知母滋陰清熱，為臣藥，以助君藥安神除煩之效；佐以川芎調(diào)暢氣機(jī)，疏達(dá)肝氣，與君藥相配，酸收辛散并用，相反相成，具有養(yǎng)血調(diào)肝之妙；甘草生用，和中緩急，為使藥。諸藥相伍，共奏養(yǎng)血安神，清熱除煩之功[2-3]。酸棗仁湯臨床經(jīng)典用途為肝血不足、虛煩不眠證。隨著后世醫(yī)家的靈活加減演變，該方臨床多應(yīng)用于治療睡眠障礙、焦慮癥和抑郁癥等疾病[4-6]。

藥理研究表明酸棗仁湯能夠抑制正常小鼠的自主活動(dòng)，并顯著延長閾上劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠時(shí)間，具有鎮(zhèn)靜催眠的作用[7]；能夠增加生理狀態(tài)下大鼠進(jìn)入高架十字迷宮中開臂的次數(shù)，起到抗焦慮的作用[8]；具有顯著回調(diào)抑郁模型大鼠的新奇攝食時(shí)間等的抗抑郁作用[9]；對睡眠剝奪大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用[10]。

中藥藥效作用的發(fā)揮有賴于其所含的化學(xué)成分，且化學(xué)成分含量的高低和穩(wěn)定性直接影響了其藥效作用的強(qiáng)弱。酸棗仁湯市售產(chǎn)品劑型種類繁多，如錠劑、顆粒劑、濃縮散劑和合劑等。課題組前期采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜定性分析了酸棗仁湯顆粒的化學(xué)成分[11]，主要為黃酮類、三萜類、苯酞類、甾體皂苷類、生物堿類和有機(jī)酚酸類等，可見其化學(xué)組成十分復(fù)雜。何博賽課題組采用HPLC-DAD-ELSD和HPLC-DAD方法分別對實(shí)驗(yàn)室自制酸棗仁湯口服液中13個(gè)成分及自制酸棗仁湯顆粒中11個(gè)成分進(jìn)行了測定[12-13]。鑒于中藥組成的多樣性及其發(fā)揮藥效多靶點(diǎn)和多途徑性的特點(diǎn)，指紋圖譜與多成分含量測定相結(jié)合的整體質(zhì)控模式，可以實(shí)現(xiàn)從宏觀全息成分到微觀指標(biāo)成分對中藥方劑的全面質(zhì)量分析[14-15]，可為評價(jià)不同市售劑型酸棗仁湯的質(zhì)量提供一種更為全面的方法。

本研究整合指紋圖譜與多成分含量測定對酸棗仁湯進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。首先，建立10批不同來源中藥材組成的自制酸棗仁湯的HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜，并采用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行相似度評價(jià)；其次，建立同時(shí)測定酸棗仁、川芎、知母和甘草中共13種指標(biāo)成分含量的方法，并應(yīng)用于10批自制酸棗仁湯和10批市售不同劑型的質(zhì)量評價(jià)。研究結(jié)果將為酸棗仁湯藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可控的物質(zhì)基礎(chǔ)，為經(jīng)典名方酸棗仁湯的整體質(zhì)量控制與評價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e 2695型高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測器和Empower工作站，美國Waters公司；蒸發(fā)光散射檢測器ELSD 6000，美國奧泰Alltech公司；WSK-A型空氣發(fā)生器，天津市津分分析儀器制造有限公司；CP214型萬分之一電子天平，奧豪斯有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Heal Force 13R型高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；MD-JY30Q3-401型煎藥壺，美的生活電器制造有限公司。

1.2 材料

試藥：色譜級甲醇、乙腈，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；屈臣氏飲用水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司，其他試劑均為分析純。

對照品烏藥堿（批號HR21517W4）、斯皮諾素（批號72063-39-9）、6′′′-阿魏酰斯皮諾素（批號HF173829198）、酸棗仁皂苷A（批號20160315）、酸棗仁皂苷B（批號PS010872）、新芒果苷（批號HR15511Z2）、芒果苷（批號HR1469S2）、異芒果苷（批號HR10037W4）、知母皂苷BII（批號HR16522S1）、阿魏酸（批號HR15328S1）、甘草苷（批號HR4919S1）、異甘草苷（批號H15423S1）和甘草酸（批號5744）均購自寶雞市辰光生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%。

處方中各藥材飲片產(chǎn)地信息見表1，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)杜晨暉教授鑒定酸棗仁為鼠李科植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子；茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Schw.) Wolf的干燥菌核；川芎為傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖；甘草為豆科植物甘草Fisch.的干燥根及根莖；知母為百合科植物知母Bge.的干燥根莖。酸棗仁湯各種制劑分別購自中國大陸、中國香港、中國臺(tái)灣和日本，各制劑生產(chǎn)廠家及批號信息見表2。

表1 飲片來源及批號信息

表2 酸棗仁湯市售制劑的基本信息

2 方法與結(jié)果

2.1 酸棗仁湯的制備

參照第5版《方劑學(xué)》教材，將酸棗仁、知母、茯苓、川芎、甘草按18∶10∶10∶5∶3的比例稱取藥材，精密稱定，加10倍量飲用水，浸泡30 min，武火煎煮至沸，換文火煎煮保持微沸30 min，8層紗布趁熱濾過。藥渣加8倍量水，文火微沸20 min，8層紗布濾過，合并2次濾液，減壓濃縮至1 g/mL（生藥量計(jì)），在壓力10 Pa，?60 ℃下冷凍干燥成凍干粉。

10批自制酸棗仁湯根據(jù)藥材產(chǎn)地隨機(jī)組合見表3，均采用上述方法提取，制成凍干粉。編號分別為S1～S10，凍干粉得率依次為21.79%、20.83%、22.14%、21.58%、21.66%、19.98%、20.37%、23.90%、21.87%、21.57%。

按上述方法及比例制備缺各藥味陰性樣品。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取對照品適量，精密稱定，加70%甲醇分別制成含新芒果苷2 mg/mL、烏藥堿1 mg/mL、芒果苷1 mg/mL、異芒果苷1 mg/mL、甘草苷1 mg/mL、斯皮諾素1 mg/mL、阿魏酸 1 mg/mL、6′′′-阿魏酰斯皮諾素1 mg/mL、異甘草苷1 mg/mL、知母皂苷BII 2 mg/mL、酸棗仁皂苷A 1 mg/mL、酸棗仁皂苷B 1 mg/mL、甘草酸2 mg/mL的單一對照品儲(chǔ)備液；分別吸取以上13種對照品儲(chǔ)備液適量，加70%甲醇制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

表3 10批酸棗仁湯飲片組合信息

2.2.2 供試品溶液的制備 取酸棗仁湯凍干粉約0.3 g（按生藥量計(jì)1.5 g），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得酸棗仁湯供試品溶液。

酸棗仁湯散劑、顆粒劑、錠劑約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得酸棗仁湯散劑、顆粒劑、錠劑供試品溶液。

精密量取酸棗仁湯合劑3 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得酸棗仁湯合劑供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備缺酸棗仁陰性、缺知母陰性、缺川芎陰性、缺甘草陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫條件：0～11 min，8.0%～16.7%乙腈；11～12 min，16.7%乙腈；12～13 min，16.7%～17.0%乙腈；13～15 min，17.0%～18.2%乙腈；15～16 min，18.2%乙腈；16～28 min，18.2%～26.0%乙腈；28～32 min，26.0%～28.0%乙腈；32～36 min，28.0%～31.0%乙腈；36～37 min，31.0%～42.0%乙腈；37～39 min，42.0%乙腈；39～46 min，42.0%～44.0%乙腈；46～55 min，44.0%～100.0%乙腈；55～65 min，100%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；紫外檢測波長為282、335 nm；ELSD參數(shù)：漂移管設(shè)定溫度105 ℃、空氣體積流量為2.5 L/min。樣品中13種待測成分在以上色譜條件下分離度良好，見圖1～3。

2.4 酸棗仁湯指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度考察 取同一批次的酸棗仁湯凍干粉（S5），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各共有峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明，HPLC-DAD 282、335 nm及HPLC-ELSD指紋譜圖中，樣品各共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

1-新芒果苷 2-烏藥堿 3-芒果苷 4-異芒果苷 5-甘草苷

6-斯皮諾素 7-阿魏酸 8-6′′′-阿魏酰斯皮諾素 9-異甘草苷

10-知母皂苷BII 11-酸棗仁皂苷A 12-酸棗仁皂苷B 13-甘草酸

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取同一批次的酸棗仁湯凍干粉（S5），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于室溫放置0、3、6、9、18、30 h后，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各共有峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果顯示，同一樣品室溫放置30 h內(nèi)HPLC-DAD 282、335 nm及HPLC-ELSD指紋譜圖中，樣品各共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明供試品溶液在室溫條件下30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性考察 取同一批次的酸棗仁湯凍干粉（S5），分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各共有峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果顯示，HPLC-DAD 282、335 nm及HPLC-ELSD指紋譜圖中，樣品各共有峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明該提取方法的重復(fù)性良好。

2.4.4 指紋圖譜的建立及相似度分析 取“2.1”項(xiàng)下方法提取的10批酸棗仁湯，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行制備，按“2.3”項(xiàng)下測定方法分析供試品溶液，并記錄生成的HPLC-DAD-ELSD色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012年版）”對上述圖譜進(jìn)行處理分析。以色譜圖S1為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，對10批酸棗仁湯的指紋圖譜進(jìn)行擬合生成對照圖譜（R），根據(jù)峰面積的穩(wěn)定性和分離度共標(biāo)定了13個(gè)共有峰。在HPLC-DAD 282 nm指紋圖譜中標(biāo)定5個(gè)共有峰，其中以芒果苷峰作為參比峰（S峰），見圖4；HPLC-DAD 335 nm指紋圖譜中標(biāo)定4個(gè)共有峰，選擇斯皮諾素峰作為參比峰（S峰），見圖5；HPLC-ELSD指紋圖譜中標(biāo)定4個(gè)共有峰，以酸棗仁皂苷A峰作為參比峰（S峰），見圖6。10批酸棗仁湯的指紋圖譜與對照指紋圖譜自動(dòng)匹配，282 nm下相似度為0.907～0.999，335 nm下相似度為0.926～0.999，ELSD下相似度為0.946～0.999。

1-新芒果苷 2-烏藥堿 3-芒果苷（S） 4-異芒果苷 5-甘草苷

6-斯皮諾素（S） 7-阿魏酸 8-6′′′-阿魏酰斯皮諾素 9-異甘草苷

2.5 多成分含量測定

2.5.1 專屬性考察 分別取“2.2.2”項(xiàng)下制備的酸棗仁湯供試品溶液、系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液及缺各藥味陰性溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，結(jié)果如圖7～9所示，各指標(biāo)成分與其相鄰成分之間的分離度＞1.5，各藥味陰性樣品溶液色譜圖在待測成分出峰位置無干擾，表明該方法下13種待測成分專屬性良好。

10-知母皂苷BII 11-酸棗仁皂苷A（S） 12-酸棗仁皂苷B 13-甘草酸

1-新芒果苷 2-烏藥堿 3-芒果苷 4-異芒果苷 5-甘草苷

2.5.2 線性關(guān)系考察 將“2.2.1”項(xiàng)下制成的6個(gè)質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測定，并記錄13種成分的峰面積。其中知母皂苷BII、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B及甘草酸以質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)（），指標(biāo)成分峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到相關(guān)系數(shù)和線性范圍；其它成分以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到相關(guān)系數(shù)和線性范圍。按信噪比為3計(jì)算13種指標(biāo)成分的檢測限，按信噪比為10計(jì)算13種指標(biāo)成分的定量限，結(jié)果見表4。13種指標(biāo)成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

6-斯皮諾素 7-阿魏酸 8-6′′′-阿魏酰斯皮諾素 9-異甘草苷

10-知母皂苷BII 11-酸棗仁皂苷A 12-酸棗仁皂苷B 13-甘草酸

2.5.3 精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄6次進(jìn)樣中13種指標(biāo)成分的峰面積，計(jì)算峰面積RSD值，為日內(nèi)精密度；第2、3天吸取同一混合對照品溶液10 μL，按相同條件進(jìn)樣分析，每天連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算13種指標(biāo)成分的峰面積RSD值，為日間精密度。結(jié)果（表5）表明，13種成分日內(nèi)、日間精密度RSD值均小于3%，儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性考察 取酸棗仁湯凍干粉（S6）約0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、3、6、9、18、30 h后，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，提取其在282、335 nm下的色譜圖，記錄13種成分在測定波長下的峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，計(jì)算RSD值，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，13種成分含量的RSD值小于3%，供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4 13種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限

表5 13種成分的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度

Table 5 Precision, stability, repeatability and accuracy of 13 compounds

2.5.5 重復(fù)性考察 取同一批次酸棗仁湯凍干粉（S6）6份，每份約0.2 g。按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，提取其在282、335 nm下的色譜圖，記錄13種指標(biāo)成分在測定波長下的峰面積，并用外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，計(jì)算RSD值，得6份供試品各成分含量重復(fù)性結(jié)果，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，6份供試品溶液中13種成分含量的RSD值小于3%，提取方法的精密度良好。

2.5.6 加樣回收率考察 取同一批次已測定13種指標(biāo)成分含量的酸棗仁湯凍干粉（S6）6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入具塞錐形瓶中，精密加入1 mL混合對照品溶液（與樣品中13種指標(biāo)成分相同含量的混合對照品溶液），按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣測試，計(jì)算6份供試品平均加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表5。6份供試品中13種指標(biāo)成分的平均回收率分別在其限度范圍內(nèi)，RSD值均小于3%，表明提取方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5.7 樣品測定 取10批自制酸棗仁湯凍干粉及10批不同劑型的市售酸棗仁湯制劑按照“2.2.2”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行制備，取供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件于282 nm下測定新芒果苷、烏藥堿、芒果苷、異芒果苷和甘草苷，335 nm下測定斯皮諾素、阿魏酸、6′′′-阿魏酰斯皮諾素和異甘草苷，在ELSD下測定知母皂苷BII、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和甘草酸，樣品含量測定結(jié)果見表6。不同廠家酸棗仁湯散劑和細(xì)粒劑中酸棗仁指標(biāo)成分斯皮諾素0.155～0.871 mg/g，酸棗仁皂苷A 0.361～0.979 mg/g；知母中知母皂苷BII 3.658～20.924 mg/g，芒果苷0.270～6.041 mg/g；甘草中甘草苷1.538～12.023 mg/g，甘草酸4.896～36.365 mg/g；川芎中阿魏酸0.160～1.269 mg/g。而實(shí)驗(yàn)室自制10批酸棗仁湯中13種成分含量波動(dòng)范圍較小，制備工藝穩(wěn)定。

2.5.8 多元統(tǒng)計(jì)分析 10批不同廠家及自制酸棗仁湯以13種指標(biāo)成分含量制成數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入聯(lián)川生物云平臺(tái)進(jìn)行層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）。由圖10可知，酸棗仁湯中13個(gè)指標(biāo)成分含量在4種不同劑型和8個(gè)不同品牌的市售產(chǎn)品中差異懸殊。STT生產(chǎn)的濃縮錠劑與濃縮顆粒劑中的指標(biāo)成分含量接近且聚為一類；SH生產(chǎn)的2種劑型也可聚為一類。

表6 不同品牌酸棗仁湯制劑及自制酸棗仁湯中13種成分的含量

*以生藥量為基準(zhǔn)；自制酸棗仁湯＝10，其余酸棗仁湯制劑＝3

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*based on the dosage of crude drug;= 10 for Suanzaoren Decoction made in laboratory,= 3 for other Suanzaoren Decoction preparations

圖10 不同品牌酸棗仁湯制劑中13種指標(biāo)成分含量的聚類熱圖

3 討論

3.1 樣品提取方法的考察

本研究所涉及的13種指標(biāo)成分，包括黃酮類、皂苷類和生物堿類，化學(xué)結(jié)構(gòu)及極性差異較大。為了滿足不同類型成分的提取效率，分別考察了70%甲醇和甲醇對酸棗仁湯凍干粉的提取效果，結(jié)果顯示70%甲醇對所有成分的提取效率更高。在此基礎(chǔ)上，考察了不同提取溶劑體積（10、20、40 mL）對待測成分提取效果的影響，結(jié)果顯示70%甲醇40 mL進(jìn)行提取時(shí)13種成分提取完全，含量測定結(jié)果穩(wěn)定。

3.2 色譜條件優(yōu)化

為了使13種指標(biāo)成分達(dá)到基線分離，且不受其它成分的干擾，本研究對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。在同一梯度洗脫條件下，首先考察了Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Agilent Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Apllo C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）和Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）4種品牌色譜柱的分離能力，結(jié)果顯示Phenomenex-C18色譜柱對13種指標(biāo)成分分離度良好，且峰型對稱；其次，分別考察了0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.2%甲酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈3種不同的流動(dòng)相體系下色譜峰的分離情況，結(jié)果顯示在0.1%甲酸水溶液-乙腈系統(tǒng)下色譜峰整體分離度較好；最后，考察了不同柱溫（25、30 ℃）對指標(biāo)成分分離能力的影響，結(jié)果顯示，柱溫為30 ℃時(shí)對13種待測成分的分離能力最強(qiáng)。

3.3 檢測波長的選擇

為了使指標(biāo)成分盡可能在最大吸收波長下進(jìn)行測定，本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測器對13種待測成分單一對照品進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示烏藥堿、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、甘草苷在282 nm下吸收較強(qiáng)；斯皮諾素、6′′′-阿魏酰斯皮諾素、阿魏酸和異甘草苷在335 nm下吸收較強(qiáng)；而知母皂苷BII、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B和甘草酸為三萜皂苷，在紫外下無吸收，因此選擇ELSD通用型檢測器對以上4種成分進(jìn)行測定。

3.4 定量成分的選擇

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，因此在進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)時(shí)應(yīng)進(jìn)行組方分析。中藥復(fù)方的組方藥味是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下進(jìn)行的，因此本研究選擇與君、臣、佐、使密切相關(guān)的主要化學(xué)成分作為質(zhì)控指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選擇了歸屬于酸棗仁（君）、知母（臣）、川芎（佐）和甘草（使）4味藥的13種指標(biāo)成分進(jìn)行測定。

酸棗仁中斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素是含量較高且具有鎮(zhèn)靜催眠活性的化學(xué)成分[16-17]；在體外藥效實(shí)驗(yàn)中，酸棗仁皂苷A能夠顯著抑制青霉素引起的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞興奮[18]，而酸棗仁皂苷B可以增加神經(jīng)元細(xì)胞表面的γ-氨基丁酸A型（γ- aminobutyric acid type A，GABAA）受體的表達(dá)[19]，并通過促進(jìn)氯離子通道開放起到鎮(zhèn)靜催眠的作 用[20]；烏藥堿可能是酸棗仁治療抑郁癥的重要成分之一[21-22]。

另有研究表明，知母中黃酮類化合物芒果苷等能夠通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor- κB，NF-κB）的活化改善脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞炎癥，這可能是其改善神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制[23]；知母皂苷BII則具有抗阿爾茨海默病、抗抑郁、抗糖尿病等多種藥理活性[24]。茯苓中三萜類成分茯苓酸能夠增加GABA受體的α、β亞基，減少γ亞基從而與其他鎮(zhèn)靜催眠藥物起到協(xié)同作用，延長嚙齒類動(dòng)物的睡眠[25]。

本實(shí)驗(yàn)曾試圖對茯苓中的茯苓酸A、豬苓酸C進(jìn)行測定，但在此條件下未檢測到上述成分，與岳佑淞等[26]的研究結(jié)果一致。佐藥川芎中阿魏酸的鈉鹽能夠顯著改善老年癡呆患者的認(rèn)知能力和記憶力，且具有抗血栓、抗氧化等藥理活性[27-28]。甘草苷能夠上調(diào)下丘腦5-羥色胺、去甲腎上腺素水平，并改善模型大鼠的更年期抑郁癥[29]；甘草酸對注射鐮孢菌酸致NE耗竭大鼠模型具有劑量依賴性的神經(jīng)保護(hù)作用[30]，且作為神經(jīng)炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）的抑制劑，對癲癇模型斑馬魚的記憶障礙有顯著的改善作用[31]。

3.5 不同劑型酸棗仁湯的質(zhì)量評價(jià)

由于中藥材來源廣、產(chǎn)地多等復(fù)雜情況，中藥產(chǎn)品的質(zhì)量常懸殊較大，特別是有效成分含量差異明顯。近年來酸棗仁價(jià)格攀升，采收過程中搶青嚴(yán)重成為影響酸棗仁質(zhì)量的主要因素。斯皮諾素是酸棗仁藥材及飲片的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

本研究中10批市售酸棗仁湯斯皮諾素含量波動(dòng)范圍較大（0.155～0.871 mg/g），可能與酸棗仁的采收、產(chǎn)地等原因有關(guān)。因此從源頭控制中藥材的來源和品質(zhì)對制劑質(zhì)量優(yōu)劣至關(guān)重要。對于同一生產(chǎn)廠家STT的濃縮顆粒和濃縮錠劑，13個(gè)指標(biāo)成分含量穩(wěn)定，表明該生產(chǎn)廠家的原料固定且生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。

此外，本研究收集的不同產(chǎn)地酸棗仁湯制劑原藥材組成比例差異較大。如日本和中國臺(tái)灣受仲景經(jīng)方[32]影響，酸棗仁湯中君藥酸棗仁占比較大，市售劑型中酸棗仁、茯苓、知母、川芎、甘草藥材配比分別為10∶5∶3∶3∶1和15∶5∶3∶3∶1；而中國香港和中國大陸的酸棗仁湯制劑藥材比例為5∶4∶2∶2∶1和5∶3∶2∶2∶1。

本研究建立了酸棗仁湯指紋圖譜結(jié)合多成分定量的質(zhì)量評價(jià)方法，應(yīng)用于自制和市售酸棗仁湯制劑的質(zhì)量評價(jià)。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可靠，為酸棗仁湯的質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation of Suanzaoren Decoction by integrating fingerprint and quantitative analysis of multi-component

LI Jia-han1, WANG Hui2, LIU Jia-xing1, DU Chen-hui2, YAN Yan1

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 2. Institute of Pharmaceutical & Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Taiyuan 030619, China

To develop the HPLC fingerprint combined with multi-component content determination method to comprehensively evaluate the quality of Suanzaoren Decoction (SZRD).Chromatographic separation was operated at 30 ℃ on a Phenomenex C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of 0.1% formic acid (A) and acetonitrile (B) for gradient elution, and the flow rate was set at 1.0 mL/min. Mangiferin and spinosin were chosen as reference peaks under detection wavelength of 282 nm and 335 nm, respectively. The drift tube of ELSD was set at 105 ℃ with the nebulizing gas flow rate of 2.5 L/min and jujuboside A as reference peak. Similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM was used to evaluate the similarity of 10 batches of SZRD, and a quantitative analysis method of SZRD was established by HPLC-DAD-ELSD and applied to determine 10 batches of SZRD and 10 batches of SZRD commercial products.The average yield of 10 batches of SZRD’s dry extract was 21.57%. Five and four common peaks were calibrated in HPLC-DAD fingerprint at 282 nm and 335 nm, with their similarity ranged from 0.907 to 0.999, from 0.926 to 0.999, respectively. Four common peaks were calibrated in HPLC-ELSD fingerprint, and the similarity ranged from 0.946 to 0.999. All the calibration curves showed good linearity with correlation coefficients () no less than 0.9959, the average recovery was 93.69%, and the average RSD was 2.04%. The content of neomangiferin, coclaurine, mangiferin, isomangiferin, liquiritin, spinosin, ferulic acid, 6′′′-feruloylspinosin, isoliquiritin, timosaponin BII, jujuboside A, jujuboside B and glycyrrhizic acid in 10 SZRD commercial products in different dosage forms were 0.30—3.38, 0.02—0.20, 0.27—6.04, 0.33—1.38, 1.54—12.02, 0.16—0.87, 0.16—1.27, 0.04—0.35, 0.25—3.12, 3.66—20.92, 0.36—0.98, 0.32—0.89, 4.90—36.37 mg/g, respectively.The results indicated that the new approach was applicable in the routine analysis and quality control of SZRD products. The study might provide a basis for quality control of SZRD, and further pharmacokinetic study of SZRD.

Suanzaoren Decoction; high-performance liquid chromatography; fingerprint; multi-component content determination; quality evaluation; neomangiferin; coclaurine; mangiferin; isomangiferin; liquiritin; spinosin; ferulic acid; 6′′′-feruloylspinosin; isoliquiritin; timosaponin BII; jujuboside A; jujuboside B; glycyrrhizic acid

R286.02

A

0253 - 2670(2022)15 - 4698 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.013

2022-02-01

山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20210302123237）；山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20210302123470）；山西省衛(wèi)生健康委“十大晉藥”項(xiàng)目（ZYCZL 2020007）；山西中醫(yī)藥大學(xué)青年科學(xué)家培育項(xiàng)目（2021PY-QN-07）；山西省科學(xué)技術(shù)廳-地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（201605D111004）

李佳涵，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及復(fù)方質(zhì)量評價(jià)。E-mail: 1530599693@qq.com

通信作者：閆 艷，副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴帲◤?fù)方）藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)過程及中藥質(zhì)量評價(jià)。Tel: (0351)7018379 E-mail: yanyan520@sxu.edu.cn

杜晨暉，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。Tel: (0351)3179982 E-mail: dch@sxtcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]