張保新，范卓，于晨昕，劉喆，沈永雯，惠新平，房建國

蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，蘭州 730000

1 引言

蛋白質(zhì)巰基(半胱氨酸殘基)在維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)揮著重要作用。半胱氨酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有獨特的反應(yīng)活性和空間排布，其不同的還原態(tài)和氧化態(tài)形式(如蛋白巰基、蛋白鄰二巰基和蛋白二硫鍵等)直接影響著生物體的氧化還原穩(wěn)態(tài)。生物氧化還原平衡對抵御癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病具有重要意義[1]，所以蛋白巰基含量的測定一直是科研工作者研究關(guān)注的重點。目前，已有成熟的方法用于蛋白質(zhì)中的巰基檢測，比如Ellman方法。與此同時，熒光成像技術(shù)因具有靈敏度高、操作簡單和生物兼容性好等優(yōu)點，使得熒光探針在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用得到不斷的發(fā)展。利用小分子熒光探針特異性檢測蛋白巰基，不僅能夠豐富蛋白巰基檢測的工具和方法，而且能夠推動生命科學(xué)的發(fā)展，具有重要的理論和實用意義，也是當(dāng)前科研領(lǐng)域的研究熱點之一[2–5]。

2 實驗?zāi)康?/h2>

(1) 測定牛血清白蛋白中巰基含量，掌握生物硫醇測定原理及實驗操作；

(2) 以蛋白質(zhì)巰基檢測為例，了解生物大分子化學(xué)修飾的原理及應(yīng)用；

(3) 復(fù)習(xí)鞏固化學(xué)生物學(xué)理論知識，掌握常見化學(xué)生物學(xué)實驗操作。

3 實驗部分

3.1 實驗原理

3.1.1 Ellman法檢測巰基的基本原理

5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) [5,5’-Dithiobis-(2-Nitrobenzoic Acid)，DTNB]，又被稱為Ellman試劑(圖1)，當(dāng)與巰基發(fā)生巰基-二硫鍵的交換反應(yīng)后被還原為2-硝基-5-巰基苯甲酸(2-Nitro-5-Mercaptobenzoic Acid，TNB)。TNB在偏堿性的條件下(pH ≈ 8)顯黃色且在412 nm下有很強吸收。實驗通過測定TNB的吸光度即可測定巰基含量[6]。

圖1 DTNB與巰基反應(yīng)原理

3.1.2 Naph-EA-Mal熒光探針標(biāo)記巰基蛋白的基本原理

蛋白標(biāo)記是在生理條件下(常溫常壓，水相，中性)利用高效的生物兼容性化學(xué)反應(yīng)實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。蛋白標(biāo)記通過引入額外的“標(biāo)簽”可以實現(xiàn)蛋白的可視化，進而方便對其后續(xù)功能的研究。此外，蛋白標(biāo)記也可以在體外模擬蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(Post-Translational Modification，PTM)等生物過程。

本實驗利用Naph-EA-Mal探針分子(圖2，其制備可參見文獻[7]，也可用其他具有相同作用機制的硫醇探針替代)實現(xiàn)對牛血清白蛋白(BSA)的標(biāo)記。Naph-EA-Mal分子利用馬來酰亞胺基團作為熒光淬滅基團，在蛋白標(biāo)記前，分子本身的背景熒光很弱。當(dāng)Naph-EA-Mal與BSA的巰基發(fā)生Michael加成反應(yīng)后，馬來酰亞胺的雙鍵被破壞，熒光淬滅效果消失，探針釋放出熒光(圖2)。Naph-EA-Mal與巰基發(fā)生的Michael加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高、反應(yīng)速率快，因而很容易在生理條件下實現(xiàn)對蛋白中巰基的快速選擇性標(biāo)記[7]。

圖2 Naph-EA-Mal探針分子與蛋白巰基的反應(yīng)示意圖

3.1.3 Naph-EA-Mal熒光探針對活細胞內(nèi)巰基的熒光成像

探針技術(shù)是化學(xué)生物學(xué)研究中的一種不可缺少的關(guān)鍵手段，探針常被用于對生物體系內(nèi)物質(zhì)的檢測、示蹤及生物大分子的標(biāo)記研究中。本實驗以Naph-EA-Mal分子與巰基快速高效反應(yīng)后可釋放出綠色熒光為例(如3.1.2中所述)解釋了活細胞成像的相關(guān)原理。此外，該探針分子相對分子質(zhì)量較小，具有較高的親脂性，推測其具有很好的細胞膜通透性，故Naph-EA-Mal探針分子非常適合細胞內(nèi)硫醇的可視化檢測(圖3)。

圖3 Naph-EA-Mal細胞成像作用示意圖

3.2 實驗試劑與儀器

3.2.1 實驗試劑

本實驗所用主要試劑見表1。

表1 實驗所用試劑

3.2.2 實驗儀器

本實驗所用主要儀器見表2。

表2 實驗所用主要儀器

3.2.3 實驗溶液配制

(1) 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl)配制(50 mmol·L-1，pH = 7.4)：將605.7 mg的Tris溶解于50 mL三蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，之后稀釋至100 mL，混合均勻4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 三羥甲基氨基甲烷與乙二胺四乙酸配制的緩沖溶液(TE)配制(pH = 7.4，50 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA)：將605.7 mg的Tris溶解于50 mL三蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，稀釋至100 mL，加入29.2 mg的EDTA，溶解后混合均勻4 °C保存。

(3) 等滲磷酸緩沖鹽溶液(PBS)溶液配制(pH = 7.4)：稱取8.0 g NaCl，0.2 g KCl，2.7 g NaHPO4·7H2O，0.24 g KH2PO4加入到1 L的儲液瓶中，用三蒸水定容至1 L，混合均勻滅菌備用。

(4) BSA蛋白配制(50 mg·mL-1)：取500 mg BSA蛋白溶于10 mL的TE緩沖液中，得到50 mg·mL-1的BSA的TE溶液，混合均勻后4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

(5) DTT溶液配制(100 mmol·L-1)：將154 mg DTT溶于10 mL三蒸水中，混合均勻后4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

(6) 鹽酸胍溶液(6 mol·L-1)：將28.6 g鹽酸胍溶于50 mL Tris-HCl (50 mmol·L-1，pH = 8.0)中，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(7) DTNB溶液配制(5 mmol·L-1)：將98.8 mg的DTNB溶于5 mL無水乙醇中得到50 mmol·L-1DTNB的乙醇溶液，之后取1 mL 50 mmol·L-1DTNB加入到10 mL的6 mol·L-1鹽酸胍溶液中，混合均勻后4 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

(8) 考馬斯亮藍溶液配制：取20 mg G-250加入10 mL 95% EtOH和20 mL 85%磷酸溶解，之后用三蒸水稀釋至200 mL，攪拌30 min，用濾紙過濾后常溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(9) SDS溶液配制(10%)：將10 g SDS溶于三蒸水中，定容至100 mL備用。

(10) Naph-EA-Mal配制(100 mmol·L-1)：將39.1 mg Naph-EA-Mal溶于1 mL的DMSO中，混合均勻備用。

(11) 上樣緩沖溶液(loading buffer)配制：將1.25 mL Tris-HCl (1 mol·L-1，pH = 6.8），5 mL甘油，2 mL 20% SDS，1.2 mL DTT (1 mol·L-1)，15 mg 溴酚藍混合在一起并攪拌均勻，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 實驗步驟

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

(1) Cys標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制1 mmol·L-1Cys的TE (50 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，pH 7.4)緩沖溶液作為儲備液，用TE稀釋配制0 、20、40、80、120、160 、200 μmol·L-1溶液各1 mL；在96孔板中依次加入180 μL的DTNB (5 mmol·L-1，乙醇作為溶劑)、10 μL不同濃度的Cys溶液，37 °C避光孵育5 min，測量412 nm處的吸光度A412，每個標(biāo)準(zhǔn)樣品平行測試兩次，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

(2) BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制10 mg·mL-1BSA的TE緩沖溶液作為儲備液，用TE稀釋配制0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL-1溶液各1 mL；在96孔板中依次加入200 μL考馬斯亮藍溶液、10 μL不同濃度的BSA溶液、37 °C避光孵育5 min、測量595 nm處的吸光度A595。每個標(biāo)準(zhǔn)樣品平行測試兩次，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

3.3.2 Ellman法測量BSA巰基含量

(1) SephadexG-25凝膠層析柱的準(zhǔn)備：首先，取適量Sephadex G-25 (~10 mL，提前準(zhǔn)備)加入有墊片的分離柱中，裝柱高度約5–6 cm，小心敲打?qū)游鲋诔馀?，之后?5倍柱體積的TE緩沖溶液平衡凝膠柱，平衡結(jié)束后備用。

(2) 蛋白試驗：首先，將8個1.5 mL Eppendorf (EP)管分成4組并標(biāo)號待用(每組兩個)，在第1、3組EP管中加入150 μL TE溶液，第2、4組EP管中加入150 μL鹽酸胍(6 mol·L-1，50 mmol·L-1pH = 8.0 Tris-HCl作為溶劑)溶液；其次，在4組EP管中分別加入50 μL BSA蛋白(50 mg·mL-1，TE緩沖液作為溶劑)并吹打均勻，在37 °C下孵育30 min，期間不斷。之后在第1、4組EP管中加入20 μL三蒸水，第2、3組EP管加入20 μL DTT溶液(100 mmol·L-1，三蒸水作為溶劑)，用移液器吹打均勻后在37 °C條件下孵育30 min，期間不斷。孵育結(jié)束后，取出準(zhǔn)備好的G25凝膠柱，將孵育好的第2、3、4組蛋白上樣，使其自然流下，用1.5 mL的EP管收集流出液。待上樣液體幾乎流干后，加入TE緩沖液進行洗脫(每次洗脫體積為200 μL)，用1.5 mL的EP管收集流出液，每管收集約200 μL流出液。期間從每個EP管吸取10 μL流出液加入96孔板中，加入90 μL考馬斯亮藍進行檢測，若顏色變藍則有蛋白流出；同時，利用DTNB檢測BSA蛋白與DTT是否完全分離。全部檢測完畢后，將收集的蛋白合并，記錄總體積V。最后，計算最大合并蛋白體積，將第1、2、3、4組蛋白樣品均用TE稀釋至該最大體積并從中各取20 μL加入96孔板，在每孔樣品中加入180 μL的DTNB溶液，同時，取20 μL TE溶液，加入180 μL DTNB溶液作為空白對照，37 °C避光孵育5 min，測量412 nm處的吸光度A412，對比1、2、3、4組樣品所測的A412，定量分析巰基含量。

3.3.3 Naph-EA-Mal熒光探針蛋白巰基標(biāo)記實驗

(1) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)實驗儀器組裝(根據(jù)實驗時間，SDS-PAGE凝膠的制備可由預(yù)備實驗室老師提前準(zhǔn)備)：每組取一套電泳裝置，正確裝配后放置于帶膠墊的底座上待用。取15 mL分離膠儲液，向其中加入30 μL TEMED，30 μL 10%的AP溶液，加畢后立刻攪拌均勻，之后用移液器小心將膠液加入玻璃夾板之間，兩側(cè)加至相同高度。加畢后，更換槍頭，小心慢速均勻地加入無水乙醇，蓋在膠液上方。乙醇加畢后，將裝置端平，小心移動至37 °C恒溫箱中，恒溫避光孵育，待膠凝固后小心傾倒出乙醇，用濾紙條小心吸干殘留乙醇。之后準(zhǔn)備好定型上樣槽的梳子兩片，取10 mL濃縮膠儲液，向其中加入40 μL TEMED，60 μL 10%的AP溶液，加畢后立刻攪拌均勻，之后用移液器小心地將膠液加入玻璃夾板之間，兩側(cè)均加至與凹型玻璃板相同高度，將梳子光面朝向方形板插入溶膠中，梳子凸出的部分正好卡在凹型板處。最后將裝置端平，小心移動至37 °C恒溫箱中，恒溫避光孵育，待膠凝固后備用。

(2) 蛋白標(biāo)記實驗：首先，將8個EP管分成4組標(biāo)號待用(每組2個)，在每個EP管中加入200 μL BSA的Tris-HCl溶液(4 mg·mL-1)。將第1、2組蛋白在4 °C保存，第3組的每份蛋白中加入20 μL 10%的SDS溶液，第4組的每份蛋白加入20 μL Tris-HCl緩沖溶液，用移液器吸打均勻后，向第1、2組蛋白中各加入100 μL DTT (100 mmol·L-1)溶液，吹打均勻后，37 °C孵育30 min，期間不斷震蕩。孵育完成后，將第3、4組蛋白取出，加入1 mL預(yù)冷的丙酮(-20 °C)，正反倒置3–5次使其混合均勻，于-20 °C中靜置30 min。取出后用離心機離心并用移液器小心吸出丙酮，之后向蛋白固體中加入200 μL的Tris-HCl緩沖溶液復(fù)溶蛋白。蛋白復(fù)溶后取出1、2組蛋白，向1、2、3、4組蛋白中均加入20 μL 10%的SDS溶液，用移液器吸打均勻。將4組蛋白樣品各取50 μL至8個新的EP管并編號(與前面保持一致)，在2、3、4組中各加入5 μL 10 mmol·L-1Naph-EA-Mal的DMSO溶液，向1組中加入5 μL DMSO，吸打均勻后37 °C孵育10 min，期間不斷震蕩。孵育完畢后，向每份蛋白中加入20 μL上樣緩沖，吸打均勻后，干式恒溫器上100 °C恒溫10 min，加熱完畢后待其降至室溫，組裝電泳槽，加入電泳緩沖液并上樣，最后進行電泳實驗。當(dāng)溴酚藍跑至膠長度80%左右時停止電泳，拆下玻璃板，取出凝膠，利用凝膠成像儀進行凝膠成像并進行熒光強度分析；成像完畢后，用考馬斯亮藍對凝膠進行染色、脫色后將考馬斯亮藍染色結(jié)果掃描成像。

3.3.4 Naph-EA-Mal熒光探針對活細胞的熒光成像實驗

首先，將裝有HeLa細胞的六孔板從CO2培養(yǎng)箱中取出(本部分實驗培養(yǎng)好的細胞由預(yù)備實驗室提前準(zhǔn)備，有條件的學(xué)校也可以讓學(xué)生自己培養(yǎng)細胞)，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，確定每孔細胞狀態(tài)良好，數(shù)量適中。其次，選取第1、2號孔為第1組(Control組)，第3、4號孔為第2組(實驗組)，第5、6號孔為第3組(實驗組) (圖4)；向第1、2、3、4號孔中加入20 μL等滲磷酸緩沖(PBS)，向5、6號孔中加入20 μLN-乙基馬來酰亞胺(NEM，10 mmol·L-1，三蒸水作為溶劑)進行巰基封閉。加完后蓋上蓋子，搖晃均勻后，放回CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育30 min，孵育結(jié)束后向1、2號孔中加入2 μL DMSO，向3、4、5、6號孔中加入2 μL Naph-EA-Mal (1 mmol·L-1)的DMSO溶液，蓋上蓋子，搖晃均勻后，再次放回CO2培養(yǎng)箱孵育5 min。孵育結(jié)束后用移液器將孔中培養(yǎng)基吸出，每孔沿壁加入1 mL PBS溶液進行洗滌(洗滌3次)，洗滌結(jié)束后每孔加入1 mL PBS，將六孔板放置在倒置熒光顯微鏡上，調(diào)好焦距和亮度后，進行成像拍照。

圖4 六孔板示意圖

4 結(jié)果與討論

4.1 Ellman法定量測定蛋白中巰基的含量

Ellman法的產(chǎn)物TNB需在弱堿性緩沖體系中才具有較強吸收，同時DTNB在高pH條件下不穩(wěn)定，所以反應(yīng)體系的pH控制在7.4–8.0之間較為合適。Ellman法定量測定蛋白巰基個數(shù)可以通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來進行(本實驗)，也可以采用已知的TNB摩爾消光系數(shù)(ε(412 nm) = 14150 mol·L-1·cm-1）數(shù)據(jù)有誤，已核實[8]進行濃度換算。本實驗測量如表3所示，表明理論值與實驗值相符。該實驗結(jié)果表明：1) Ellman法可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)巰基的定量測定；2) 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對其所含基團反應(yīng)活性影響很大。

表3 Ellman法定量測定蛋白中巰基的含量結(jié)果

本部分實驗操作需要注意以下幾點：1) 準(zhǔn)備Sephadex G-25凝膠柱時需要盡可能除去柱內(nèi)氣泡，否則會影響分離效果；2) 蛋白樣品需一次全部上樣，樣品上樣體積要求不超過凝膠體積的10%；3) 本實驗使用EP管收集蛋白流出液，對EP管要清晰編號，不可混淆。

4.2 Naph-EA-Mal熒光探針蛋白巰基標(biāo)記實驗

本實驗中，1號樣品是純BSA，作為空白對照無熒光；2號樣品未經(jīng)變性還原，理論上只有一個裸露的巰基，熒光強度較弱；3號樣品經(jīng)過變性還原，條帶的熒光強度最強；4號樣品未變性只進行還原，熒光強度介于2號與3號樣品之間，具體實驗結(jié)果如圖5所示。該實驗結(jié)果表明：1) Naph-EAMal熒光探針可以實現(xiàn)BSA蛋白巰基的標(biāo)記；2) 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對其所含基團反應(yīng)活性影響很大。

圖5 Naph-EA-Mal法標(biāo)記BSA蛋白巰基實驗結(jié)果

本部分實驗操作需要注意以下幾點：1) 利用10% SDS變性蛋白時切勿使用移液器劇烈吹打溶液，吸打溶液時勿將槍中的液體打盡，應(yīng)緩慢吸打，最后一次打出溶液時將槍頭提到液面以上，沿壁打盡，防止起泡；2) 加入預(yù)冷的丙酮沉淀蛋白時，切勿劇烈混合，正反倒置幾次混勻即可，丙酮沉淀之后離心時間不宜過長，否則會增加蛋白復(fù)溶難度。離心結(jié)束后盡可能小心吸盡丙酮，不可將蛋白吸走；3) 加完上樣緩沖后在干式恒溫器上100 °C加熱時，需在EP管上壓一個冰盒，防止噴濺。

4.3 Naph-EA-Mal熒光探針對活細胞的熒光成像實驗

利用熒光探針進行細胞成像實驗時要盡可能把加入的探針分子和NEM分散均勻，所以在細胞培養(yǎng)板中加入不同試劑后，應(yīng)立即輕搖培養(yǎng)板。根據(jù)實驗設(shè)計，本實驗預(yù)期實驗結(jié)果是Control組和加入NEM預(yù)孵育的實驗組在綠光通道中均無熒光，僅有實驗組的細胞呈現(xiàn)熒光。具體實驗結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示除實驗組細胞呈現(xiàn)綠色熒光外，在加入NEM預(yù)孵育的實驗組細胞也有微弱的熒光，這可能是NEM沒有徹底封閉細胞內(nèi)的巰基物種所致。這樣，當(dāng)探針Naph-EA-Mal進入細胞時，仍然會有少量的反應(yīng)，產(chǎn)生微弱的熒光。該實驗結(jié)果表明：1) Naph-EA-Mal熒光探針可實現(xiàn)細胞內(nèi)巰基的原位檢測；2) Naph-EA-Mal熒光探針可實現(xiàn)細胞內(nèi)巰基的熒光標(biāo)記。

圖6 活細胞熒光成像實驗結(jié)果

本部分實驗操作需要注意以下幾點：1) Naph-EA-Mal探針分子盡量避免反復(fù)凍融，長時間放置會導(dǎo)致部分探針分解；2) 細胞熒光拍照之前利用PBS多次洗滌，要確保無干擾背景。

5 教學(xué)建議

實驗時間建議為12 h，學(xué)生3–4人一組，合理分工協(xié)作，實驗內(nèi)容可交叉進行(表4)?；谠搶嶒?，我們還開發(fā)了虛擬仿真實驗平臺(鏈接網(wǎng)址：http://www.ilab-x.com/details/v5?id=3828&isView=true)，可供參考。

表4 實驗學(xué)時安排表

6 結(jié)語

本實驗是一個內(nèi)容前沿、角度新穎、模塊多樣的化學(xué)生物學(xué)實驗。我們將三個連續(xù)的模塊實驗：1) 蛋白質(zhì)巰基檢測、2) 蛋白巰基標(biāo)記及凝膠電泳、3) 活細胞內(nèi)硫醇熒光成像，合理規(guī)劃在12個學(xué)時的實驗教程中，不同學(xué)?？梢愿鶕?jù)本校實驗條件、教學(xué)要求、課時數(shù)等合理安排實驗相關(guān)內(nèi)容。該實驗以BSA中巰基的檢測為具體操作對象，將生物大分子與小分子的分離(有機溶劑沉淀、凝膠排阻色譜以及SDS-PAGE)、變性及非變性條件下生物大分子的化學(xué)修飾、細胞培養(yǎng)以及活細胞成像等化學(xué)生物學(xué)基本操作融入到教學(xué)當(dāng)中，可以讓學(xué)生在實驗中鞏固復(fù)習(xí)化學(xué)生物學(xué)基本知識，了解前沿科學(xué)的熱點，感受科學(xué)研究的過程，進而激發(fā)學(xué)生對科研的興趣。

7 創(chuàng)新性

(1) 本實驗內(nèi)容前沿，實驗內(nèi)容是基于實驗指導(dǎo)教師課題組的科研成果，是科教融合和學(xué)科融合的結(jié)果。

(2) 本實驗?zāi)K多樣化，在實驗的設(shè)計安排中有多種選擇和多種延伸，不同高?；谧陨韺嶒灄l件可以選擇不同的模塊開設(shè)。

(3) 培養(yǎng)學(xué)生多角度考慮問題的能力，通過本實驗的開展，學(xué)生可以更好地從化學(xué)的角度理解生命過程中的問題。