亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        FAM20C在小鼠下頜髁突發(fā)育過程中的時空表達(dá)

        2022-08-01 10:17:24袁朝陽吳國棟劉培紅
        口腔醫(yī)學(xué) 2022年7期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        祁 皓,馬 肅,2,袁朝陽,吳國棟,劉培紅,2

        下頜髁突軟骨(mandibular condylar cartilage,MCC)是覆蓋下頜髁突表面的次級軟骨,由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成[1]。MCC作為下頜骨的發(fā)育中心,對下頜骨的形態(tài)發(fā)生和長度、高度的增長至關(guān)重要[2]。研究表明,多種生長因子和信號通路參與髁突發(fā)育,包括成纖維細(xì)胞生長因子23,Wnt信號通路及FAM20(family with sequence similarity 20)家族成員蛋白等[3-5]。

        FAM20C是FAM20家族三個成員之一,又被稱為牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白4,是一種高爾基酪蛋白激酶,在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[6]。FAM20C通過磷酸化S-x-E/pS序列中的絲氨酸殘基,修飾細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,參與組織礦化、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、傷口愈合、細(xì)胞分化等多種生物過程[7]。敲除Fam20C基因的小鼠發(fā)生嚴(yán)重的低磷性佝僂病,表現(xiàn)為血清和骨中磷酸鹽降低和成纖維細(xì)胞生長因子23升高[8]。人類Fam20C突變導(dǎo)致Raine綜合征,表現(xiàn)為骨硬化性骨發(fā)育不良、佝僂病、軟骨病以及低磷血癥等[9]。

        目前FAM20C在骨、牙齒發(fā)育及礦化方面的研究已有一些進(jìn)展[10-11],而關(guān)于FAM20C在下頜髁突中的表達(dá)和作用機(jī)制尚無報道。本研究通過免疫組化觀察小鼠出生前后下頜髁突軟骨中FAM20C的表達(dá)情況,推測其在下頜髁突發(fā)育中的潛在作用,為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定組織學(xué)基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 動物和組織準(zhǔn)備

        選取20只8周齡野生型C57BL/6小鼠(體質(zhì)量18~24 g)作為親代小鼠。實(shí)驗(yàn)設(shè)計經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。小鼠合籠交配,晨起觀察到陰道栓確定妊娠,記為胚胎0.5 d(E0.5)。取胚胎17.5 d(E17.5)和出生后0、7、21 d(P0、P7、P21)共4個時間點(diǎn)小鼠的下頜髁突,4%多聚甲醛常規(guī)外固定。其中P7和P21組小鼠下頜髁突分別在15%EDTA(pH=7.4)溶液中4 ℃低溫脫鈣3 d和9 d。各組標(biāo)本以矢狀位常規(guī)制作蠟塊,每組選取5個小鼠髁突組織蠟塊進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 主要試劑和儀器

        蘇木素染液、伊紅染液(北京蘭杰柯);改良番紅O-固綠染色液試劑盒(北京索萊寶);PV-兩步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德);兔抗FAM20C多克隆抗體(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院龍江學(xué)者實(shí)驗(yàn)室);HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德)。Leica DM2500光學(xué)顯微鏡(德國徠卡),Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡、NIS-ELements BR 3.0成像分析系統(tǒng)(日本尼康)。

        1.3 組織切片染色

        1.3.1 蘇木精-伊紅(HE)染色 按照常規(guī)染色步驟進(jìn)行。

        1.3.2 改良番紅O-固綠染色 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.3.3 免疫組化染色 每組選取5只小鼠髁突組織蠟塊,取連續(xù)切片中間部位一張進(jìn)行FAM20C免疫組化染色。檸檬酸修復(fù)液(pH=6.0)高溫抗原修復(fù);3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶;山羊血清封閉;一抗(FAM20C,1∶100稀釋),IgG代替一抗作為陰性對照,4 ℃孵育過夜;二抗37 ℃孵育30 min;DAB顯色;甲基綠復(fù)染。

        1.3.4 結(jié)果判讀 改良番紅O-固綠染色結(jié)果判讀:軟骨基質(zhì)為深紅色,軟骨細(xì)胞核為藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)、肌肉、膠原纖維及骨組織為灰綠色;免疫組化染色結(jié)果判讀:棕黃色顆粒為蛋白陽性表達(dá)。

        1.4 免疫組化結(jié)果的半定量分析

        每組選取5只小鼠免疫組化切片進(jìn)行半定量分析,將每張切片中的髁突分為前、中、后3個部位,在高倍鏡下每個部位隨機(jī)選取1個視野拍照。通過Image-pro plus 6.0圖像軟件測量每張切片3個部位FAM20C陽性區(qū)域的累計光密度值(integrated optical density,IOD),以陽性區(qū)域IOD與圖片面積的比值——平均光密度值(mean optical density,MOD)作為免疫組化半定量指標(biāo),每張切片3個部位MOD取平均值,即為該切片F(xiàn)AM20C的陽性表達(dá)強(qiáng)度。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

        2 結(jié) 果

        2.1 組織學(xué)結(jié)果

        鑒于E17.5、P0和P7髁突在100倍鏡下基本可以展示全貌,所以選取100倍鏡下拍照,但是P21髁突體積較大,只選取中間部位拍照。E17.5小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突軟骨明顯,番紅O染色可見基質(zhì)充滿細(xì)胞間隙,軟骨細(xì)胞排列整齊。P0小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突軟骨的長度和寬度明顯增加,尤其是肥大細(xì)胞區(qū),各層軟骨細(xì)胞清晰可辨,包括關(guān)節(jié)表面纖維層、靜止軟骨細(xì)胞層、增殖軟骨細(xì)胞層、前肥大軟骨細(xì)胞層、肥大軟骨細(xì)胞層(非礦化)和礦化肥大軟骨細(xì)胞層。P7小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突前、中、后帶輪廓初具,髁突軟骨初級結(jié)構(gòu)基本形成。P21小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突前、中、后帶形態(tài)分明,發(fā)育接近完成。P0、P7、P21,隨著軟骨內(nèi)骨化的進(jìn)展,肥大軟骨細(xì)胞層縱向縮短,軟骨下骨體積增加,下頜髁突體積增大。見圖1~3。

        Td:顳下頜關(guān)節(jié)盤;S:關(guān)節(jié)表面纖維層;R:靜止軟骨細(xì)胞層;P:增殖軟骨細(xì)胞層;Pr:前肥大軟骨細(xì)胞層;H:肥大軟骨細(xì)胞層(非礦化肥大軟骨細(xì)胞區(qū));M:礦化肥大軟骨細(xì)胞層;Sub:軟骨下骨

        2.2 免疫組化染色結(jié)果

        4組小鼠髁突軟骨組織中均有FAM20C表達(dá),隨著髁突軟骨發(fā)育,F(xiàn)AM20C表達(dá)逐漸減少。在增殖軟骨細(xì)胞層中,F(xiàn)AM20C主要位于細(xì)胞核;在前肥大軟骨細(xì)胞層和肥大軟骨細(xì)胞層中,F(xiàn)AM20C主要位于細(xì)胞質(zhì)。E17.5組,在增殖軟骨細(xì)胞層、整個肥大軟骨細(xì)胞層及軟骨下骨中均可以看到FAM20C強(qiáng)陽性染色且分布廣泛。P0組,在增殖軟骨細(xì)胞層和前肥大軟骨細(xì)胞層中FAM20C陽性染色較明顯,肥大軟骨細(xì)胞層中染色相對較弱且散在分布。P7組,F(xiàn)AM20C陽性染色主要集中在增殖軟骨細(xì)胞層和軟骨下骨中,肥大軟骨細(xì)胞層中陽性染色零星分布。P21組,陽性染色明顯減少,主要沿增殖軟骨細(xì)胞層分布,肥大軟骨細(xì)胞層及軟骨下骨中極少量表達(dá)。見圖4。

        A:E17.5;B:P0;C:P7;D:P21

        A:E17.5;B:P0;C:P7;D:P21

        A:E17.5;B:P0;C:P7;D:P21

        2.3 FAM20C表達(dá)的半定量分析

        E17.5、P0、P7和P21組中FAM20C的MOD值分別為0.583±0.015、0.479±0.023、0.353±0.014和0.281±0.013,組間比較F=306.296,P<0.05,4組MOD差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),兩兩組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

        3 討 論

        FAM20家族由 FAM20A、FAM20B和FAM20C三個成員組成[12]。條件性敲除小鼠Fam20B,小鼠髁突軟骨細(xì)胞增殖能力減弱,軟骨分化過程受到抑制,髁突形態(tài)纖薄短小,證明Fam20B對于髁突軟骨發(fā)育至關(guān)重要[5]。研究表明FAM20C可以磷酸化修飾大多數(shù)分泌蛋白。其中小整合素結(jié)合配體-N-連接糖蛋白家族(small integrin binding ligand-N-linked glycoproteins,SIBLINGs)在髁突軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,而該家族成員蛋白已被證明是FAM20C的直接底物[6,13]。此外,在長骨成骨過程中,長骨軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中可以檢測到FAM20C mRNA,在成熟軟骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和增生性軟骨細(xì)胞中可以檢測到FAM20C蛋白,表明FAM20C可能參與長骨軟骨的形成[14]?;谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,我們猜測FAM20C可能參與髁突軟骨發(fā)育。

        本實(shí)驗(yàn)在使用傳統(tǒng)HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察的基礎(chǔ)上,結(jié)合改良番紅O-固綠染色方法觀察了下頜髁突軟骨及軟骨下骨的形態(tài)學(xué)變化。因?yàn)檐浌腔|(zhì)含有特定的蛋白多糖,這些蛋白多糖包含許多陰離子糖鏈,可以結(jié)合番紅O、固綠進(jìn)行染色。軟骨與番紅O結(jié)合呈現(xiàn)紅色,骨與固綠結(jié)合呈現(xiàn)綠色或藍(lán)色,與呈現(xiàn)紅色的軟骨對比鮮明,從而將軟骨組織和骨組織區(qū)域明顯分開[15]。本實(shí)驗(yàn)改良番紅O-固綠染色結(jié)果表明:隨著軟骨內(nèi)骨化的進(jìn)展,軟骨細(xì)胞層縱向縮短,軟骨下骨體積增加,這與既往研究結(jié)論一致[5]。

        在哺乳動物中,骨形成的方式有兩種:膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為MCC的成骨方式為軟骨內(nèi)成骨,即軟骨祖細(xì)胞首先通過增殖和分化成軟骨細(xì)胞形成軟骨,后軟骨細(xì)胞肥大、凋亡,引發(fā)血管侵入,最終被骨取代[16]。近期有研究表明,少量軟骨細(xì)胞可以在下頜髁突組織中直接分化為成骨細(xì)胞,參與下頜髁突軟骨下骨的形成[17]。在軟骨內(nèi)成骨過程中,軟骨細(xì)胞經(jīng)歷嚴(yán)格控制的增殖和分化階段,調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨的縱向生長[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:在4個時間點(diǎn),增殖軟骨細(xì)胞層中均有FAM20C陽性表達(dá),且隨著時間的推移,陽性表達(dá)逐漸減少。在胚胎期及出生后早期階段的肥大軟骨細(xì)胞中FAM20C高表達(dá),而在髁突軟骨發(fā)育后期FAM20C表達(dá)較弱,這表明FAM20C可能參與了髁突軟骨早期軟骨細(xì)胞的分化。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FAM20C在小鼠下頜髁突發(fā)育中具有一定的生物學(xué)作用,可能通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和軟骨細(xì)胞分化速率來塑造或維持下頜髁突軟骨的形態(tài),參與下頜髁突成骨過程,關(guān)于FAM20C調(diào)控下頜髁突發(fā)育的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步體內(nèi)外研究。

        猜你喜歡
        小鼠
        晚安,大大鼠!
        萌小鼠,捍衛(wèi)人類健康的“大英雄”
        視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生令小鼠復(fù)明
        科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:30
        小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
        今天不去幼兒園
        清肝二十七味丸對酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用
        中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
        米小鼠和它的伙伴們
        高氟對C57BL/6J小鼠睪丸中AQP1、AQP4表達(dá)的影響
        Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
        加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
        国产偷v国产偷v亚洲偷v| 亚洲精品欧美精品日韩精品| 国产av麻豆mag剧集| 久久天天躁狠狠躁夜夜爽蜜月| 国产免费午夜福利蜜芽无码| 美女露出奶头扒开内裤的视频 | 亚洲偷自拍国综合第一页| 一本一本久久aa综合精品| 91福利视频免费| 精品人妻一区二区三区av | 亚洲精品国产熟女久久| 日韩中文字幕素人水野一区| 国产精品中文久久久久久久| 日韩成人大屁股内射喷水| 亚洲成a人片在线| 最大色网男人的av天堂| 日本一区二区在线高清观看| a级毛片无码久久精品免费 | 日本精品久久久久中文字幕1| 成人亚洲av网站在线看| 狠狠综合亚洲综合亚洲色| 又污又爽又黄的网站| 欧美日韩色| 亚洲中文字幕无线乱码va | 欧美一区二区三区激情| 国产黑丝在线| 久久精品国产成人午夜福利| 午夜桃色视频在线观看| 新婚少妇无套内谢国语播放| 国产中文字幕乱人伦在线观看| āV第三区亚洲狠狠婷婷综合久久| 午夜视频免费观看一区二区| 精品少妇人妻av一区二区蜜桃| 亚洲av成人片在线观看| 精品久久久久久中文字幕| 亚洲中字幕永久在线观看| 中文字幕人妻互换av| 亚洲中文字幕无码不卡电影 | 蜜桃成熟时日本一区二区| 边添小泬边狠狠躁视频| 四川丰满少妇被弄到高潮|