祁 皓，馬 肅,2，袁朝陽，吳國棟，劉培紅,2

下頜髁突軟骨(mandibular condylar cartilage，MCC)是覆蓋下頜髁突表面的次級軟骨，由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成[1]。MCC作為下頜骨的發(fā)育中心，對下頜骨的形態(tài)發(fā)生和長度、高度的增長至關(guān)重要[2]。研究表明，多種生長因子和信號通路參與髁突發(fā)育，包括成纖維細(xì)胞生長因子23，Wnt信號通路及FAM20(family with sequence similarity 20)家族成員蛋白等[3-5]。

FAM20C是FAM20家族三個成員之一，又被稱為牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白4，是一種高爾基酪蛋白激酶，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[6]。FAM20C通過磷酸化S-x-E/pS序列中的絲氨酸殘基，修飾細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與組織礦化、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、傷口愈合、細(xì)胞分化等多種生物過程[7]。敲除Fam20C基因的小鼠發(fā)生嚴(yán)重的低磷性佝僂病，表現(xiàn)為血清和骨中磷酸鹽降低和成纖維細(xì)胞生長因子23升高[8]。人類Fam20C突變導(dǎo)致Raine綜合征，表現(xiàn)為骨硬化性骨發(fā)育不良、佝僂病、軟骨病以及低磷血癥等[9]。

目前FAM20C在骨、牙齒發(fā)育及礦化方面的研究已有一些進(jìn)展[10-11]，而關(guān)于FAM20C在下頜髁突中的表達(dá)和作用機(jī)制尚無報道。本研究通過免疫組化觀察小鼠出生前后下頜髁突軟骨中FAM20C的表達(dá)情況，推測其在下頜髁突發(fā)育中的潛在作用，為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定組織學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物和組織準(zhǔn)備

選取20只8周齡野生型C57BL/6小鼠(體質(zhì)量18～24 g)作為親代小鼠。實(shí)驗(yàn)設(shè)計經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。小鼠合籠交配，晨起觀察到陰道栓確定妊娠，記為胚胎0.5 d(E0.5)。取胚胎17.5 d(E17.5)和出生后0、7、21 d(P0、P7、P21)共4個時間點(diǎn)小鼠的下頜髁突，4%多聚甲醛常規(guī)外固定。其中P7和P21組小鼠下頜髁突分別在15%EDTA(pH=7.4)溶液中4 ℃低溫脫鈣3 d和9 d。各組標(biāo)本以矢狀位常規(guī)制作蠟塊，每組選取5個小鼠髁突組織蠟塊進(jìn)行4 μm厚連續(xù)切片，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

蘇木素染液、伊紅染液(北京蘭杰柯)；改良番紅O-固綠染色液試劑盒(北京索萊寶)；PV-兩步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；兔抗FAM20C多克隆抗體(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院龍江學(xué)者實(shí)驗(yàn)室)；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德)。Leica DM2500光學(xué)顯微鏡(德國徠卡)，Nikon ECLIPSE 80i顯微鏡、NIS-ELements BR 3.0成像分析系統(tǒng)(日本尼康)。

1.3 組織切片染色

1.3.1 蘇木精-伊紅(HE)染色 按照常規(guī)染色步驟進(jìn)行。

1.3.2 改良番紅O-固綠染色 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 免疫組化染色 每組選取5只小鼠髁突組織蠟塊，取連續(xù)切片中間部位一張進(jìn)行FAM20C免疫組化染色。檸檬酸修復(fù)液(pH=6.0)高溫抗原修復(fù)；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶；山羊血清封閉；一抗(FAM20C，1∶100稀釋)，IgG代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；二抗37 ℃孵育30 min；DAB顯色；甲基綠復(fù)染。

1.3.4 結(jié)果判讀 改良番紅O-固綠染色結(jié)果判讀：軟骨基質(zhì)為深紅色，軟骨細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌肉、膠原纖維及骨組織為灰綠色；免疫組化染色結(jié)果判讀：棕黃色顆粒為蛋白陽性表達(dá)。

1.4 免疫組化結(jié)果的半定量分析

每組選取5只小鼠免疫組化切片進(jìn)行半定量分析，將每張切片中的髁突分為前、中、后3個部位，在高倍鏡下每個部位隨機(jī)選取1個視野拍照。通過Image-pro plus 6.0圖像軟件測量每張切片3個部位FAM20C陽性區(qū)域的累計光密度值(integrated optical density，IOD)，以陽性區(qū)域IOD與圖片面積的比值——平均光密度值(mean optical density，MOD)作為免疫組化半定量指標(biāo)，每張切片3個部位MOD取平均值，即為該切片F(xiàn)AM20C的陽性表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)結(jié)果

鑒于E17.5、P0和P7髁突在100倍鏡下基本可以展示全貌，所以選取100倍鏡下拍照，但是P21髁突體積較大，只選取中間部位拍照。E17.5小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突軟骨明顯，番紅O染色可見基質(zhì)充滿細(xì)胞間隙，軟骨細(xì)胞排列整齊。P0小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突軟骨的長度和寬度明顯增加，尤其是肥大細(xì)胞區(qū)，各層軟骨細(xì)胞清晰可辨，包括關(guān)節(jié)表面纖維層、靜止軟骨細(xì)胞層、增殖軟骨細(xì)胞層、前肥大軟骨細(xì)胞層、肥大軟骨細(xì)胞層(非礦化)和礦化肥大軟骨細(xì)胞層。P7小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突前、中、后帶輪廓初具，髁突軟骨初級結(jié)構(gòu)基本形成。P21小鼠髁突染色結(jié)果可見髁突前、中、后帶形態(tài)分明，發(fā)育接近完成。P0、P7、P21，隨著軟骨內(nèi)骨化的進(jìn)展，肥大軟骨細(xì)胞層縱向縮短，軟骨下骨體積增加，下頜髁突體積增大。見圖1～3。

Td：顳下頜關(guān)節(jié)盤；S：關(guān)節(jié)表面纖維層；R：靜止軟骨細(xì)胞層；P：增殖軟骨細(xì)胞層；Pr：前肥大軟骨細(xì)胞層；H：肥大軟骨細(xì)胞層(非礦化肥大軟骨細(xì)胞區(qū))；M：礦化肥大軟骨細(xì)胞層；Sub：軟骨下骨

2.2 免疫組化染色結(jié)果

4組小鼠髁突軟骨組織中均有FAM20C表達(dá)，隨著髁突軟骨發(fā)育，F(xiàn)AM20C表達(dá)逐漸減少。在增殖軟骨細(xì)胞層中，F(xiàn)AM20C主要位于細(xì)胞核；在前肥大軟骨細(xì)胞層和肥大軟骨細(xì)胞層中，F(xiàn)AM20C主要位于細(xì)胞質(zhì)。E17.5組，在增殖軟骨細(xì)胞層、整個肥大軟骨細(xì)胞層及軟骨下骨中均可以看到FAM20C強(qiáng)陽性染色且分布廣泛。P0組，在增殖軟骨細(xì)胞層和前肥大軟骨細(xì)胞層中FAM20C陽性染色較明顯，肥大軟骨細(xì)胞層中染色相對較弱且散在分布。P7組，F(xiàn)AM20C陽性染色主要集中在增殖軟骨細(xì)胞層和軟骨下骨中，肥大軟骨細(xì)胞層中陽性染色零星分布。P21組，陽性染色明顯減少，主要沿增殖軟骨細(xì)胞層分布，肥大軟骨細(xì)胞層及軟骨下骨中極少量表達(dá)。見圖4。

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

A：E17.5；B：P0；C：P7；D：P21

2.3 FAM20C表達(dá)的半定量分析

E17.5、P0、P7和P21組中FAM20C的MOD值分別為0.583±0.015、0.479±0.023、0.353±0.014和0.281±0.013，組間比較F=306.296，P<0.05，4組MOD差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩兩組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

FAM20家族由 FAM20A、FAM20B和FAM20C三個成員組成[12]。條件性敲除小鼠Fam20B，小鼠髁突軟骨細(xì)胞增殖能力減弱，軟骨分化過程受到抑制，髁突形態(tài)纖薄短小，證明Fam20B對于髁突軟骨發(fā)育至關(guān)重要[5]。研究表明FAM20C可以磷酸化修飾大多數(shù)分泌蛋白。其中小整合素結(jié)合配體-N-連接糖蛋白家族(small integrin binding ligand-N-linked glycoproteins，SIBLINGs)在髁突軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，而該家族成員蛋白已被證明是FAM20C的直接底物[6,13]。此外，在長骨成骨過程中，長骨軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中可以檢測到FAM20C mRNA，在成熟軟骨細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和增生性軟骨細(xì)胞中可以檢測到FAM20C蛋白，表明FAM20C可能參與長骨軟骨的形成[14]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，我們猜測FAM20C可能參與髁突軟骨發(fā)育。

本實(shí)驗(yàn)在使用傳統(tǒng)HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，結(jié)合改良番紅O-固綠染色方法觀察了下頜髁突軟骨及軟骨下骨的形態(tài)學(xué)變化。因?yàn)檐浌腔|(zhì)含有特定的蛋白多糖，這些蛋白多糖包含許多陰離子糖鏈，可以結(jié)合番紅O、固綠進(jìn)行染色。軟骨與番紅O結(jié)合呈現(xiàn)紅色，骨與固綠結(jié)合呈現(xiàn)綠色或藍(lán)色，與呈現(xiàn)紅色的軟骨對比鮮明，從而將軟骨組織和骨組織區(qū)域明顯分開[15]。本實(shí)驗(yàn)改良番紅O-固綠染色結(jié)果表明：隨著軟骨內(nèi)骨化的進(jìn)展，軟骨細(xì)胞層縱向縮短，軟骨下骨體積增加，這與既往研究結(jié)論一致[5]。

在哺乳動物中，骨形成的方式有兩種：膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為MCC的成骨方式為軟骨內(nèi)成骨，即軟骨祖細(xì)胞首先通過增殖和分化成軟骨細(xì)胞形成軟骨，后軟骨細(xì)胞肥大、凋亡，引發(fā)血管侵入，最終被骨取代[16]。近期有研究表明，少量軟骨細(xì)胞可以在下頜髁突組織中直接分化為成骨細(xì)胞，參與下頜髁突軟骨下骨的形成[17]。在軟骨內(nèi)成骨過程中，軟骨細(xì)胞經(jīng)歷嚴(yán)格控制的增殖和分化階段，調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨的縱向生長[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：在4個時間點(diǎn)，增殖軟骨細(xì)胞層中均有FAM20C陽性表達(dá)，且隨著時間的推移，陽性表達(dá)逐漸減少。在胚胎期及出生后早期階段的肥大軟骨細(xì)胞中FAM20C高表達(dá)，而在髁突軟骨發(fā)育后期FAM20C表達(dá)較弱，這表明FAM20C可能參與了髁突軟骨早期軟骨細(xì)胞的分化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FAM20C在小鼠下頜髁突發(fā)育中具有一定的生物學(xué)作用，可能通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和軟骨細(xì)胞分化速率來塑造或維持下頜髁突軟骨的形態(tài)，參與下頜髁突成骨過程，關(guān)于FAM20C調(diào)控下頜髁突發(fā)育的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步體內(nèi)外研究。