張校晨，孫唯夫，方世殊，秦 文，金作林

環(huán)境對DNA序列中遺傳信息突變的影響使得細胞可以繼承和傳遞不屬于基因組序列的信息[1]。RNA修飾是這些超越傳統(tǒng)遺傳模式的表觀遺傳的重要組成部分[2]。其中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾在真核生物中最為普遍，廣泛存在于核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)、核小RNA(snRNA)、微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)[3-5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾在代謝性疾病調(diào)控方面[6]，特別是在骨質(zhì)疏松中擔任重要角色[7]。然而，m6A修飾在成骨分化中的具體機制目前尚無充分的證據(jù)且存在爭議。以下就m6A修飾機制及幾種典型相關(guān)蛋白與成骨分化關(guān)系作一綜述。

1 m6A甲基化修飾機制

m6A甲基化過程通過m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(writers)催化并由m6A去甲基酶(erasers)動態(tài)逆轉(zhuǎn)，再由m6A結(jié)合蛋白(readers)識別后調(diào)節(jié)RNA的加工代謝及后續(xù)生物學效應。

1.1 writers參與m6A編寫過程

writers核心成分是甲基轉(zhuǎn)移酶樣3(methyltransferase like 3，METTL3)和METTL14(methyltransferase like 14，METTL14)組成的異二聚體復合物，其他亞基起協(xié)同作用[8]。核心催化位點METTL3具有與S-腺苷甲硫氨酸(SAM)結(jié)合的區(qū)域和保守的DPPW基序[9]。METTL14本身不具有催化酶的功能，但可以提供一個結(jié)合支架輔助增強METTL3作用[10]。腎母細胞瘤關(guān)聯(lián)蛋白1(Wilms′ tumor-associated protein 1，WTAP)作為第三個重要亞基引導復合體定位于核斑點維持催化活性[11]。此外，病毒樣m6A甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白(vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA)能夠招募修飾位點區(qū)域的mRNA優(yōu)先甲基化[12]。鋅指結(jié)構(gòu)蛋白13(zinc finger CCCH domain-containing protein 13, ZC3H13)能夠與RNA結(jié)合基序蛋白15(RNA-binding motif protein 15，RBM15)/RBM15B結(jié)合并將其連接到WTAP上，同時引導ZC3H13-WTAP-Virilizer-Hakai復合物定位[13-14]。其中E3泛素連接酶Hakai屬于保守組分，其泛素化是異二聚體結(jié)構(gòu)形成所必需的[15]。METTL16(methyltransferase like 16，METTL16)主要作用在3′-UTR，敲除METTL16可導致m6A的甲基化減少約20%[16]。

1.2 erasers參與m6A擦除過程

目前發(fā)現(xiàn)有兩種erasers：脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity associated protein, FTO)和AlkB同源物5(AlkB homolog 5, ALKBH5)。FTO將m6A氧化成N6羥甲基腺苷(N6-hydroxymethyl adenosine, Hm6A)及6-甲酰基腺苷(6-formyl adenosine, F6A)。這兩個不穩(wěn)定的中間體通過釋放甲醛和甲酸還原為腺苷[17]。ALKBH5可以直接催化m6A使甲醛迅速釋放[18]。有研究發(fā)現(xiàn)含m6A的RNA可能是FTO最有利的堿基底物[19]。然而Mauer等[20]發(fā)現(xiàn)FTO對m6A的作用似乎是有限的，F(xiàn)TO優(yōu)先使N6, 2′-氧-二甲基腺苷(N6,2′-O-dimethyladenosine, m6Am)而不是m6A脫甲基。相反ALKBH5對m6A具有高度的特異性而對m6Am沒有活性，迄今為止也沒有發(fā)現(xiàn)ALKBH5作用的其他底物。

1.3 readers參與m6A讀取過程

readers讀取方式可以分為三種模式。主要的作用方式是直接結(jié)合m6A位點。YTH結(jié)構(gòu)域家族(YTH domain family，YTHDF)均在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，YTHDF1促進mRNA的翻譯效率[21]。而YTHDF2導致mRNA從翻譯區(qū)遷移到衰變位點(如P體)加速降解[22]。但YTHDF3可能在mRNA衰變之前先與其結(jié)合并協(xié)同YTHDF1作用[23]。細胞核成員YTH結(jié)構(gòu)域包含蛋白(YTH domain-containing proteins，YTHDC)也可以直接結(jié)合m6A，YTHDC1促進SRSF3結(jié)合并抑制SRSF10結(jié)合調(diào)控mRNA的剪切[24]，而YTHDC2選擇性地結(jié)合m6A的共有基序，增強mRNA翻譯效率，但也會降低其mRNA含量[25]。真核生物轉(zhuǎn)錄起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，EIF3)[26]和核糖體(ribosomes)[27]對mRNA的翻譯過程有一定影響。胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins, IGF2BPs)能夠以弱親和力結(jié)合m6A促進mRNA的穩(wěn)定性[28]。

另外一種方式是間接結(jié)合m6A位點，即“m6A開關(guān)”[29]，意思是m6A-U對比A-U脆弱使得RNA更容易形成簡單線性的未折疊結(jié)構(gòu)從而更容易招募蛋白。人異質(zhì)性細胞核核糖蛋白C(human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，HNRNPC)[29]和人異質(zhì)性細胞核核糖蛋白G(human heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G，HNRNPG)[30]就是通過這種方式影響mRNA的剪切。HNRNPA2/B1調(diào)控mRNA成熟、轉(zhuǎn)運和代謝以及l(fā)ncRNA的基因調(diào)控[31]。GTP酶激活蛋白-結(jié)合蛋白(GTPase-activating protein-binding proteins, G3BPs)是一種被m6A排斥的蛋白，正向調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性[32]。

最后一種方式是與直接結(jié)合蛋白發(fā)生結(jié)合。脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein, FMRP)以不依賴RNA的方式與YTHDF2相互作用，逆轉(zhuǎn)降解以維持穩(wěn)定性[33]。

2 m6A甲基化修飾參與成骨分化調(diào)控

2.1 writers與成骨分化

METTL3可以通過以下途徑促進成骨分化功能:①選擇性剪切，METTL3抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子A(VEGFA)剪切，促進成骨細胞的成熟[34];②翻譯效率，METTL3促進骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)中甲狀旁腺激素1受體(parathyroid hormone 1 receptor, PTH1R)mRNA的蛋白質(zhì)合成，增強甲狀旁腺激素(PTH)誘導的成骨反應[35]；③與YTHDF2協(xié)同調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性，YTHDF2與METTL3誘導的甲基化pre-miR-320結(jié)合并促進降解，增強BMSCs成骨分化[36]。有趣的是，METTL3對于一些其他來源細胞會產(chǎn)生相反的作用。METTL3促進MYD88RNA甲基化及表達量，增強NF-κB信號通路抑制月經(jīng)血來源間充質(zhì)干細胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)成骨分化[37]，同時可以啟動破骨細胞骨吸收功能[38]。

目前對于METTL14促進成骨作用的研究結(jié)論較為一致，可以直接增強成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄本Klotho的m6A水平導致其降解，促進人血管平滑肌細胞(HASMC)骨化并降低血管修復功能[39]。還可以增強微處理器蛋白DGCR8對pri-miR-103-3p的識別，負向調(diào)節(jié)miR-103-3p成熟，間接逆轉(zhuǎn)功能上的抑制成骨細胞活性[40]。

2.2 erasers與成骨分化

erasers通過調(diào)控mRNA穩(wěn)定性影響成骨分化。但是也有積極、消極兩方面作用。FTO通過Hspa1a-NF-κB信號軸增強mRNA穩(wěn)定性，保護成骨細胞免受基因毒性物質(zhì)(UV和H2O2)損傷[41]。另外，在人股骨頭MSCs樣本中FTO介導過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, Pparg)mRNA去甲基化，并以依賴于YTHDF1的方式降低其穩(wěn)定性，促進BMSCs成骨分化[42]。但是，Shen等在小鼠BMSCs體外實驗中發(fā)現(xiàn)FTO使Pparg mRNA去甲基化進而表達量增加，促進BMSCs向脂肪細胞分化而不是成骨細胞分化[43]，可見不同物種的反應也是不同的。而同樣矛盾的結(jié)果在另一項人BMSCs的體外實驗中也被發(fā)現(xiàn)，即FTO過表達降低成骨相關(guān)因子Runx2 mRNA的表達水平，抑制成骨分化[44]?？梢奆TO確切機制還有待更廣泛研究證實。

ALKBH5似乎可以充當METTL3抑制成骨作用的拮抗劑[37-38]，還可以使BMP2 脫甲基并激活AKT信號通路促進黃韌帶骨化(ossification of the ligamentum flavum, OLF)[45]。體外下調(diào)ALKBH5后，大鼠顱骨成骨細胞分化和礦化減少是由于Runx2 mRNA穩(wěn)定性降低所致[46]。然而體內(nèi)實驗卻有不同的結(jié)果，Li等在條件敲除ALKBH5的小鼠股骨中觀察到骨密度顯著增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過增加PRMT6 mRNA衰減率，抑制骨發(fā)育過程中PI3K/AKT通路的激活，從而負向調(diào)節(jié)人BMSCs的成骨分化[47]。這種矛盾作用可能與研究細胞所處的復雜體內(nèi)環(huán)境有密切關(guān)系。

2.3 readers與成骨分化

readers直接參與成骨過程的研究較少。低表達YTHDF2可以增強LPS誘導的炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-12)的表達水平，加重炎癥和骨質(zhì)疏松[48-49]。文俊儒等[50]研究也發(fā)現(xiàn)敲除YTHDC2可以促進人BMSCs的成骨分化而抑制成脂分化。

3 小結(jié)與展望

m6A引起人們的興趣，不僅因為它參與調(diào)節(jié)各種生物學過程(基因表達控制、mRNA的穩(wěn)定性和動態(tài)平衡等)，而且在疾病的病因研究、診斷防治中也發(fā)揮著重要作用。MSCs因其成骨分化潛能被視為骨修復和骨再生的種子細胞，而m6A在骨骼生物學中充當?shù)年P(guān)鍵角色使其成為再生醫(yī)學、骨組織工程和骨相關(guān)疾病防治中的一個很有前途的靶點。然而，m6A與成骨分化相關(guān)性研究仍有許多功能調(diào)控問題需要進一步探討。首先，目前對幾個關(guān)鍵m6A相關(guān)蛋白(METTL3/FTO)研究比較深入，而其他亞基的研究較少，不同組分之間的相互作用也有很大的探索空間。其次，m6A與成骨的關(guān)系存在矛盾。實驗中使用不同類型的細胞、調(diào)控過程中不同動態(tài)階段的影響以及測序方法的差異可能導致結(jié)果不同，規(guī)范升級檢測方法和加強合作交流是必要的。最后，基于m6A成骨功能的藥物應用研究幾乎沒有，期望從成熟的體外細胞實驗向體內(nèi)實驗過渡，為相關(guān)疾病的防治盡早提供新策略。