孔 妍,劉雙嶺,關(guān)睿騫,崔乃松,陳 奧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

缺血性腦卒中是一種由于腦血流中斷、腦局部供血不足引發(fā)的神經(jīng)功能障礙性疾病，具有高發(fā)病率、高傷殘率和高死亡率等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害了人類的生命健康和生活質(zhì)量[1-2]。調(diào)查研究顯示，我國老年患者每年新發(fā)缺血性腦卒中人數(shù)約為120～150萬，其中死亡人數(shù)高達(dá)80～100萬。在幸存患者中，又有半數(shù)以上伴有不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，如肢體麻木、痙攣性偏癱等[3]。因此，在腦組織缺血缺氧早期給予及時(shí)有效的干預(yù)治療，對(duì)于減輕神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損、預(yù)防神經(jīng)功能障礙具有重要的意義。目前臨床上針對(duì)缺血性腦卒中的治療主要采用溶栓、擴(kuò)血管和抗血小板聚集等藥物治療[4]，但由于作用靶點(diǎn)單一、治療時(shí)間窗窄等問題使得上述藥物的治療具有一定的局限性[5]?；诖耍叫柰ㄟ^對(duì)缺血性腦卒中病理生理學(xué)機(jī)制的深入研究，尋找抗缺血性腦卒中的新的更有效的作用靶點(diǎn)和治療方法。針康法是將中醫(yī)學(xué)中頭穴叢刺法與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)相結(jié)合的一種治療方法，近年來已被廣泛運(yùn)用于臨床腦卒中的治療，并發(fā)揮出較佳的治療效果[6-7]。為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法對(duì)缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展期的干預(yù)效果并探究其可能的作用機(jī)制，本研究擬采用Longa改良線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)，配合給予針康法干預(yù)治療，以探討針康法對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷的保護(hù)作用及與細(xì)胞自噬的相關(guān)性，具體報(bào)告如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)雄性健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(250±30)g，8周齡，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(吉)-2020-0004。動(dòng)物房保持12 h/12 h晝夜交替循環(huán)，每8 h自動(dòng)通風(fēng)換氣，溫度(25±2)℃，濕度40%～70 %，自由飲水、進(jìn)食，在此條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

PT型電動(dòng)跑臺(tái)(鼠用)五跑道(上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司)；Stuart SHM2組織勻漿器(英國Bibby-Stuart公司)；IX73倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；UV5紫外可見分光光度計(jì)(METTLER TOLEDO公司)；SDS-PAGE凝膠電泳儀(美國Bio-rad公司)；Invitrogen iBright凝膠成像分析系統(tǒng)(Thermo Fisher公司)；FYL-YS-310L實(shí)驗(yàn)室大鼠恒溫箱(FU.YI.LIAN公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

TTC染色液、辣根過氧化物酶(Sigma-Aldrich公司)；山羊血清封閉液、TBST溶液和蘇木素染液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；DAB顯色試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：W02612)；Beclin1、LC3-Ⅱ抗體(美國 Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：019032，021036)；山羊抗兔IgG 二抗、BCA 蛋白含量檢測試劑盒(Abcam公司，批號(hào)：ab49367，ab2593)；Trizol RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher公司，批號(hào)：868342，4366596)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與造模

將90只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組，每組各18只，剔除麻醉和手術(shù)意外死亡的以及未達(dá)入模標(biāo)準(zhǔn)的大鼠。參照Longa改良線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)[8]，步驟如下：大鼠稱重，10 %水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)上，取頸正中切口，切開皮膚，鈍性分離皮下各層組織及肌肉，暴露出頸總動(dòng)脈，小心分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(Common carotid artery,CCA)和頸外動(dòng)脈(External carotid artery,ECA)，在CCA近心端和ECA處進(jìn)行結(jié)扎，在ECA近分叉處做一直徑約0.20 mm的V型切口，將線栓自切口處輕輕導(dǎo)入，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈送入顱內(nèi)，插入深度約(18.50±0.50)mm，至有明顯阻力時(shí)停止，以阻斷大腦中動(dòng)脈血流，在缺血 90 min 后取出線栓進(jìn)行再灌注，止血消毒后縫合切口，單籠飼養(yǎng)。于術(shù)后6 h采用改良的Bederson’s標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，選擇評(píng)分為1～3分的MCAO大鼠納入本實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組只進(jìn)行麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎血管及導(dǎo)入線栓。

2.2 干預(yù)方法

2.2.1 針刺組 于造模后24 h給予頭穴叢刺法，按照“大鼠穴位圖譜”所示[9]，在相應(yīng)的刺激區(qū)，以華佗牌針灸針(0.25 mm×25 mm)取百會(huì)穴及百會(huì)左、右側(cè)各旁開2 mm處(頂區(qū))向前平刺至頂前區(qū)，深度15 mm，以200 r/min頻率快速捻轉(zhuǎn)后留針6 h，留針期間每1 h捻轉(zhuǎn)1次，每次5 min，每日1次。

2.2.2 康復(fù)組 各組大鼠均在術(shù)前給予適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練3 d，每天30 min?？祻?fù)組于造模后24 h給予跑臺(tái)訓(xùn)練，每天30 min，1次/d。采用五跑道電動(dòng)跑臺(tái)，將大鼠置于不斷向后傳輸?shù)穆膸?，為避免履帶尾部電柵欄的電擊，大鼠不斷地在電?dòng)履帶上主動(dòng)向前奔跑，設(shè)置跑臺(tái)斜度0 °，履帶傳輸速度：術(shù)前3 d為12 m/min，術(shù)后第1天為5 m/min，術(shù)后第2天為8 m/min，第3天及以后為12 m/min。

2.2.3 針康組 于造模后24 h給予針刺結(jié)合運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)康復(fù)訓(xùn)練。

2.2.4 假手術(shù)組、模型組 術(shù)后不給予任何干預(yù)，放回籠中安靜飼養(yǎng)。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分 各組大鼠均于治療第6 h、3天、7天、14天分別進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估，采用改良的Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]：0分，無神經(jīng)功能缺失體征；1分，提尾時(shí)可見病灶對(duì)側(cè)前肢屈曲；2分，行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)傾倒；4分，意識(shí)障礙，無法自發(fā)性走，分值越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

2.3.2 TTC染色觀察腦梗死灶面積 于干預(yù)結(jié)束后斷頭處死大鼠，2 min內(nèi)取出大腦，0 ℃生理鹽水沖洗后濾紙吸干表面水分，-20 ℃冰箱冷凍 20 min后取出，去除嗅球、腦干及小腦，以大鼠腦組織切片機(jī)自前腦額極起，連續(xù)切出5片冠狀切片，片厚2 mm，將腦片置入1 %TTC染色液中，37 ℃避光孵育30 min，在15 min時(shí)翻面1次使染色均勻。TTC染色完成后將腦片置于4 %多聚甲醛溶液中固定保存，數(shù)碼相機(jī)拍照，掃描，采用Image-Pro Plus 6圖像分析軟件進(jìn)行腦梗死灶輪廓勾畫，測量缺血組織截面積(A1、A2)和同側(cè)半腦截面積(B1、B2)，用梗死百分比(%)=[(A1+A2)÷(B1+B2)]×100 %的公式計(jì)算半腦梗死百分比(%)。

2.3.3 免疫組化檢測腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ陽性表達(dá) 大鼠行神經(jīng)功能評(píng)分后，采用0.9 %生理鹽水心臟灌注處死后取出腦組織，置入4 %多聚甲醛緩沖液中固定，石蠟包埋切片，脫蠟至水化，3 %過氧化氫室溫孵育10 min，抗原修復(fù)，滴加山羊血清室溫封閉30 min，吸凈封閉液，滴加稀釋的一抗后4 ℃保存過夜，PBS沖洗3次×5 min，次日滴加稀釋的二抗后37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min，辣根酶標(biāo)記、DAB顯色后蘇木素復(fù)染，脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察，40×光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，使用Image J圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)Beclin1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.3.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測腦組織Beclin1、LC3-ⅡmRNA表達(dá) 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分后，采用0.9%生理鹽水心臟灌注處死后取出腦組織，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。Trizol法提取腦組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度，符合要求后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成 cDNA，以SYBR Green 為熒光標(biāo)記物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用Invitrogen iBright凝膠成像分析系統(tǒng)采集、分析電泳圖像，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct值計(jì)算Beclin1、LC3-ⅡmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。PCR擴(kuò)增引物序列設(shè)計(jì)如下：Beclin1 (上游：5′-CTAAGATGGGTCTGAATTGGCTA-3′，下游：5′-CACTCCAGATACGAGTGTGTCATG-3′)；LC3-Ⅱ(上游：5′-CAAGCCTTCTTCCTGATGCTAAC-3′，下游：5′-CTATCTCTCGCTCTGCGTCTTC-3′)；GAPDH(上游：5′-CAAGGCTGAGACTGGGCACAGT -3′，下游：5′-CTGAAGACGCCAGTAACGGTG-3′)。

2.3.5 Western blot檢測腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá) 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分后，采用0.9 %生理鹽水心臟灌注處死后取出腦組織，PBS溶液清洗、剪碎后置入勻漿器中，加足量組織裂解液，4 ℃下勻漿30 min，5000 r/min離心15 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。加適量的蛋白緩沖液混勻、離心和變性，每孔上樣50 μg，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶室溫封閉孵育2 h。滴加稀釋的Beclin1、LC3-Ⅱ一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次×10 min，滴加相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗3次×10 min，DAB顯色、曝光，采用Image J凝膠成像分析系統(tǒng)采集、分析電泳圖像，以各目的蛋白與GAPDH條帶的光密度比值表示Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分比較

與假手術(shù)組比較，不同時(shí)間點(diǎn)模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分均可見明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，相同時(shí)間點(diǎn)針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分均可見降低，并在第3天、7天和14天時(shí)呈現(xiàn)顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨時(shí)間呈現(xiàn)下降趨勢。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分比較

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分比較

3.2 各組大鼠腦梗死灶面積比較

TTC染色觀察腦梗死灶面積，模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組均可見明顯蒼白色梗死灶，假手術(shù)組無肉眼可見梗死灶；與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的腦梗死百分比均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的腦梗死面積均可見明顯縮小，腦梗死百分比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，以針康組的腦梗死百分比為最低。見圖2、表2。

表2 各組大鼠腦梗死灶面積的比較

注：1-假手術(shù)組；2-模型組；3-針刺組；4-康復(fù)組；5-針康組。

3.3 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ陽性表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Beclin1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均可見明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Beclin1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均可見明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，以針康組的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)最低。見圖3、表3。

表3 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

圖3 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞分布(40×)

3.4 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)比較

由圖4可見，各目的基因的溶解曲線僅有1個(gè)峰，表明其擴(kuò)增具有特異性。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Beclin1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)均可見明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Beclin1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)均可見明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，以針康組大鼠的Beclin1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)為最低。見圖4、表4。

注:A.Beclin1；B.LC3-Ⅱ。

表4 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ mRNA表達(dá)比較

3.5 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均可見明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針刺組、康復(fù)組和針康組大鼠的Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均可見明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，以針康組大鼠的Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)為最低。見圖5、表5。

注：1-假手術(shù)組；2-模型組；3-針刺組；4-康復(fù)組；5-針康組。

表5 各組大鼠腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)比較

4 討論

缺血性腦卒中在中醫(yī)理論中歸屬于“中風(fēng)”“卒中”范疇。中醫(yī)對(duì)中風(fēng)的認(rèn)識(shí)由來已久，如《景岳全書》記載：“中風(fēng)麻木不仁等證，因其血?dú)獠恢?，所以不知痛癢，蓋氣虛則麻，血虛則木，麻木不已，偏枯痿廢，漸至日增”[11]。中風(fēng)是以猝然昏仆、半身不遂、言語不利和口眼歪斜等為主癥的病癥，取其“風(fēng)性善行而數(shù)變”的特征命名為中風(fēng)，又因其發(fā)病突然、起病急驟，故又稱為“卒中”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中風(fēng)病的病位在腦之脈絡(luò)，其基本病因?yàn)闅馓撗?、升降逆亂和痰瘀互阻等[12]。近年來，中醫(yī)關(guān)于中風(fēng)病的治法呈現(xiàn)出多元化的趨勢，包括針法、方藥、中醫(yī)運(yùn)動(dòng)康復(fù)及中西醫(yī)結(jié)合的綜合治療方案等。唐強(qiáng)教授在對(duì)不同針法與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)聯(lián)合治療腦卒中的聯(lián)合時(shí)機(jī)、聯(lián)合點(diǎn)等進(jìn)行系統(tǒng)研究后，提出了“針康同步、動(dòng)態(tài)治療、整體康復(fù)”的中西醫(yī)整合康復(fù)理念，創(chuàng)立了針康法治療技術(shù)，使頭穴叢刺法與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)療效最大化[13-14]。

近年來，針康法用于臨床上腦卒中的治療已體現(xiàn)出極佳的治療作用，能夠明顯改善腦卒中后遺癥的各種功能障礙，提高患者的生活質(zhì)量，關(guān)于針康法干預(yù)治療腦缺血再灌注損傷的機(jī)制亦進(jìn)行了不斷的深入研究，如針康法可通過促進(jìn)腦細(xì)胞中Akt、14-3-3、Cyt C及Bcl-2等蛋白表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，從而改善缺血缺氧腦損傷大鼠神經(jīng)損傷癥狀[15-16]；針康法能夠降低大鼠體內(nèi)炎性因子TNF-α、IL-1β水平，改善慢性低灌注大鼠腦組織損傷和認(rèn)知功能[17]；可通過優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低腦缺血大鼠血清LPS、DAO含量，修復(fù)受損神經(jīng)元和腸黏膜損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)等[18]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬參與了腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程[19-20]，然而，關(guān)于針康法是否通過調(diào)控細(xì)胞自噬改善腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究目前尚未見報(bào)道?；诖耍狙芯坎捎肔onga改良線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)，以探討針康法對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷的保護(hù)作用及對(duì)細(xì)胞自噬的影響，為臨床探尋抗缺血性腦卒中的新作用靶點(diǎn)和治療方案提供依據(jù)。

細(xì)胞自噬是由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)成分自我降解的途徑，在細(xì)胞增值、分化與衰老的諸多生理過程中均扮演著重要的角色，在腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和癌癥等病理?xiàng)l件下也發(fā)揮著重要的作用[21]。在病理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)受損細(xì)胞器增多、細(xì)胞缺乏營養(yǎng)，在機(jī)體自噬相關(guān)基因(ATG)的調(diào)控下，細(xì)胞內(nèi)容物可被胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)包裹形成自噬體[22]，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解無用的蛋白以為受損細(xì)胞提供氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[23]。Beclin1 是最早被發(fā)現(xiàn)的參與自噬途徑的關(guān)鍵因子，能夠誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜上，調(diào)控自噬體的形成與成熟[24]。微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3(LC3)是酵母菌 ATG8 在哺乳動(dòng)物中的同源基因，在自噬相關(guān)蛋白 ATG4 的作用下，可脫去羥基生成游離 LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ又在ATG7及ATG3的共同作用下進(jìn)一步與PE結(jié)合酯化形成 LC3-Ⅱ定位于自噬體膜上，可見，LC3-Ⅱ是自噬體形成的重要生物學(xué)標(biāo)志[25]。Nitatori T[26]等在1995年首次采用透射電子顯微鏡證實(shí)了腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞中自噬現(xiàn)象的發(fā)生。近年來，越來越多的證據(jù)表明，腦缺血再灌注損傷與細(xì)胞自噬密切相關(guān)。在腦缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞自噬可被迅速激活并參與神經(jīng)細(xì)胞死亡和疾病進(jìn)展的過程。Carloni S等[27]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用自噬抑制劑雷帕霉素能夠有效抑制自噬活性，降低自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)，減輕缺血缺氧新生大鼠的神經(jīng)細(xì)胞損傷。王燕等[28]以不同劑量馬賽替尼用于腦缺血再灌注損傷大鼠的干預(yù)治療，均能不同程度地下調(diào)LC3Ⅱ/I、Beclin-1、Bax等自噬和凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬和凋亡通路，改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀。陳維達(dá)等[29]對(duì)腦缺血再灌注損傷模型(MCAO)大鼠給予加味滌痰湯干預(yù)，能夠有效改善MCAO大鼠腦組織損傷，減輕炎癥反應(yīng)，該作用可能與下調(diào) LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)、上調(diào)p62表達(dá)和抑制自噬活性相關(guān)。以上研究均證實(shí)，細(xì)胞自噬在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，在腦缺血再灌注發(fā)生后，模型組大鼠的Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死灶面積均明顯高于假手術(shù)組和其他治療組，Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA表達(dá)均可見明顯升高，提示腦缺血再灌注后細(xì)胞自噬途徑被激活。給予針刺、康復(fù)及針康組干預(yù)治療后，可見Bederson’s神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死灶面積均顯著下降，Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，以針康組降低效果最為明顯，表明針康法相比于單純頭穴叢刺法或現(xiàn)代康復(fù)方法，能夠更有效地抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，進(jìn)而改善MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷，實(shí)現(xiàn)最大化的腦缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)作用，恰符合唐強(qiáng)教授的中西醫(yī)整合康復(fù)理念。

綜上所述，針康法能夠有效改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷，其治療作用可能是通過降低腦組織Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白及mRNA表達(dá)和抑制細(xì)胞自噬實(shí)現(xiàn)的。