冉茂花,趙小娟,王 璐,李 季,張 立,3△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院，江西 撫州 344000；3.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

慢性腦低灌注(CCH)是指全腦組織長時間處于缺血缺氧狀態(tài)，進(jìn)而出現(xiàn)漸進(jìn)性、持久性的神經(jīng)功能和認(rèn)知功能障礙[1]。CCH是血管性認(rèn)知障礙(VCI)的主要原因[2]。海馬是認(rèn)知領(lǐng)域的關(guān)鍵區(qū)域，其突觸的生成、數(shù)目和功能被認(rèn)為是極其重要的神經(jīng)生理基礎(chǔ)。GAP-43是一種控制F-肌動蛋白動態(tài)的主要生長錐蛋白，在神經(jīng)連接、突觸形成和軸突再生中起著關(guān)鍵作用，是發(fā)育神經(jīng)再生的標(biāo)志[3]。研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，腦部血流長期灌注不足會引起控制學(xué)習(xí)、記憶功能的海馬神經(jīng)元缺血，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元、突觸損傷和細(xì)胞凋亡。前期研究[4-6]在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、自噬和腦白質(zhì)損傷等層面證實針康法可有效改善CCH所致的認(rèn)知功能減退。本實驗通過觀察針康法對慢性低灌注大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力和GAP-43的影響，并探討相關(guān)機(jī)制，以期指導(dǎo)VCI的臨床治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司SPF級別的SD成年雄性大鼠[許可證書編號為：SCXK(魯)2019-0003]，年齡9周左右，體質(zhì)量為170～220 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，利用跑臺訓(xùn)練和Morris水迷宮實驗(Morris water maze, MWM)剔除有視覺障礙、體弱和運(yùn)動力差以及少數(shù)不配合游泳(潛水)的SD大鼠后，隨機(jī)選用60只入組，編號(1～60)稱重按照選隨機(jī)數(shù)字法把大鼠分為假手術(shù)組(n=12)和手術(shù)組。其中手術(shù)組采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(2-VO)制備慢性低灌注模型。造模成功后隨機(jī)分為模型組、針刺組、康復(fù)組和針康組，每組12只(n=12)。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器 ZH-PT型動物實驗跑臺(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；Morris水迷宮攝像機(jī)SSC-G218(日本索尼公司)；HM340E切片機(jī)[塞默爾世爾(上海)儀器有限公司]；透射電子顯微鏡(日立H-7650)；WB系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.2.2 試劑 4 %多聚甲醛溶液(雷根生物)；HE染色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；GAP-43抗體(美國Cell Signaltng Technology公司)。

1.3 動物造模

1.3.1 慢性低灌注模型制備 配置10 %水合氯醛麻醉藥物，稱量體質(zhì)量后，進(jìn)行腹腔注射麻醉(0.35 mL/100 g)。待其麻醉后仰臥于鼠板上，固定四肢，頸項部備皮，碘伏消毒后剪切約1.3 cm左右的開口，鈍性分離皮下組織，暴露一側(cè)頸總動脈(Common carotid arte-ry,CCA)，用4.0結(jié)扎線永久性結(jié)扎頸總動脈的近端與遠(yuǎn)端，并用手術(shù)剪從中間剪斷，同樣方法操作另一側(cè)，逐層縫合、消毒[7]。

假手術(shù)組操作：同樣采用制備手術(shù)組的方法步驟，將準(zhǔn)備好的大鼠頸項部進(jìn)行剃毛備皮，但只需找出CCA并仔細(xì)分離，不需結(jié)扎和剪斷，直接進(jìn)行組織和皮膚的縫合。

1.3.2 造模成功標(biāo)準(zhǔn) 具備慢性低灌注模型的大鼠表現(xiàn)出兩眼球向內(nèi)側(cè)壓低、瞳孔和眼裂均縮小、對外部刺激反應(yīng)緩慢遲緩、傷害警覺性和抵抗力降低，即霍納氏綜合征[8]。

1.4 實驗步驟及干預(yù)方法

1.4.1 實驗步驟 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，采用動物實驗跑臺訓(xùn)練和MWM篩選出實驗對象。建模前5 d做MWM行為學(xué)測驗，之后開始制備模型，建模后第28 d為模型成功時間。在治療開始前進(jìn)行MWM測驗，之后進(jìn)行28 d的治療，治療結(jié)束后做MWM行為學(xué)測驗，測驗完成后取腦，分離海馬組織備用，用于HE染色和GAP-43蛋白檢測。

1.4.2 假手術(shù)組、模型組 不進(jìn)行任何干預(yù)，正常飼養(yǎng)即可。

1.4.3 針刺組 成模后開始為期4周的頭穴叢刺干預(yù)，參考大鼠穴位圖譜[9]，選用0.25 mm×25 mm針灸針，固定大鼠頸部和前肢后，取百會穴及其左、右各旁開2 mm處向前頂方向進(jìn)針，捻針1 min，2 h后取針，將大鼠歸籠進(jìn)行正常飼養(yǎng)，1次/d。

1.4.4 康復(fù)組 采用實驗跑臺訓(xùn)練，按照試驗方案調(diào)好參數(shù)值(訓(xùn)練坡度：0 °；訓(xùn)練速度：1～3 d為8 m/min,4～6 d為10 m/min,6 d之后為12 m/min)，然后將大鼠放置跑道上訓(xùn)練30 min，1次/d。

1.4.5 針康組 先進(jìn)行頭針治療，捻針1 min后，將帶有頭針的大鼠放置跑道上開始訓(xùn)練，30 min后取出大鼠，再留針1.5 h后取針，1次/d，具體操作方法同針刺組和康復(fù)組。

1.5 標(biāo)本取材及處理方法

隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行麻醉，具體方法參照造模麻醉。待大鼠麻醉后，將其置于冰盒上快速取腦，剝離出海馬體，入凍存管封蓋，并快速置入約-200 ℃液氮中冷凍，5 min后取出存放于-80 ℃的冰箱中。剩余6只行心內(nèi)灌注取腦術(shù)，麻醉后在其腹部膈肌下開胸，用止血鉗翻夾起膈肌，使心臟全部露出來，將大鼠右心耳剪開一小口，同時立即將注射針頭刺入左心室并固定，先快速的注射生理鹽水(0.9%)，觀察其肝臟和肺葉變白以及灌注流出來的水變清澈時，再改注射4 %多聚甲醛(PFA)溶液。隨后切開大鼠頸部，剔除腦顱骨，分離海馬，4 %多聚甲醛固定，4 ℃固定48 h備用。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 Morris行為學(xué)測驗(MWM) 裝置中注入大量水(溫度約23 ℃)，同時可加入食品級黑色素，便于攝像頭追蹤大鼠的活動軌跡。在正式開始做MWM的前1 d，先讓大鼠適應(yīng)性游泳，可以使其適應(yīng)游泳環(huán)境，還可以剔除無法入本實驗的大鼠。治療4周后，各組大鼠分別進(jìn)行MWM。

定位航行實驗(place navigation):將大鼠隨機(jī)從4個不同的象限放入水中，記錄大鼠在1 min內(nèi)找到圓形平臺并上平臺所需要的時間(即逃避潛伏期)。需注意在平臺上停留的時間超過5 s才為有效，在1 min內(nèi)找不到圓形平臺的大鼠，可以認(rèn)為干預(yù)指引其上平臺并暫時停留數(shù)秒，其逃避潛伏期應(yīng)計為60 s。每天測4次，取4次的均數(shù)為當(dāng)天大鼠的逃避潛伏期。

空間探索實驗(spatial probe test):第5天將水下1 cm處的圓形平臺取出，觀察大鼠1 min內(nèi)越過原平臺位置的次數(shù)。過原平臺位置的頻次越高，表明記憶程度越高。

1.6.2 HE染色 將海馬組織經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟滲透、包埋后，切成厚度約4 μm的石蠟切片，石蠟切片脫蠟至水，蘇木精染核10 min，自來水洗，鹽酸酒精(1%)分化1 min，氨水(0.6%)酒精返藍(lán)，伊紅染細(xì)胞質(zhì)3 min，水洗脫水透明后中性樹膠封片。

1.6.3 Western blot檢測 取出凍存管中的海馬組織，剪碎，RIPA裂解液冰上裂解，在低溫(4 ℃)高速(12 000 rpm)的離心機(jī)中離心10 min，取上清液當(dāng)作總蛋白液，BCA法測蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，TBST溶液清洗5 min,共4次，二抗室溫0.5 h，入TBST清洗5 min,共4次，ECL顯影，采用A1phaEase FC軟件設(shè)備，觀察目標(biāo)條帶并分析光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知功能比較

Mrioss水迷宮檢測大鼠行為學(xué)變化，與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期顯著延長，尋找原始平臺次數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，各治療組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，尋找原始平臺次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與針刺組和康復(fù)組比較，針康組逃避潛伏期顯著縮短，尋找原始平臺次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1～2。

表1 各組大鼠于造模前、治療前和治療后的逃避潛伏期比較

表2 各組大鼠于造模前、治療前和治療后的穿越平臺次數(shù)比較

2.2 各組大鼠海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞及突觸間排列密集且有序、數(shù)量眾多、種類繁多和結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元丟失不明顯，各細(xì)胞器內(nèi)未見明顯受損，細(xì)胞胞漿清晰透亮、核圓而大、仁清晰、突觸細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和邊緣清晰。相較于假手術(shù)組，模型組大鼠細(xì)胞和突觸間布列稀疏、量少且結(jié)構(gòu)不完整，神經(jīng)元嚴(yán)重丟失，細(xì)胞和突觸結(jié)構(gòu)萎縮、形態(tài)不規(guī)整且呈多角形或梭形、核膜邊界模糊，胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生水腫、核固縮和仁不清。與針刺組、康復(fù)組相比，針康組大鼠形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)、海馬突觸細(xì)胞數(shù)量以及神經(jīng)元丟失情況改善更為明顯。見圖1～2。

圖1 各組大鼠HE染色結(jié)果(100×)

圖2 各組大鼠HE染色結(jié)果(400×)

2.3 各組大鼠海馬區(qū)GAP-43蛋白表達(dá)結(jié)果

相較于假手術(shù)組，模型組GAP-43蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相較于模型組，針刺組、康復(fù)組和針康組的GAP-43蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相較于針刺組和康復(fù)組，針康組GAP-43蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

注：A-假手術(shù)組；B-模型組；C-康復(fù)組；D-針刺組；E-針康組。

表3 GAP-43蛋白表達(dá)量變化比較

3 討論

慢性低灌注是指腦組織出現(xiàn)血流不足或灌注缺陷為特征的持續(xù)性病理狀態(tài)，可引起腦代謝紊亂，表現(xiàn)為白質(zhì)損傷和認(rèn)知功能減退。研究表明[10]，持續(xù)的腦血流供應(yīng)對維持大腦結(jié)構(gòu)和功能的完整性至關(guān)重要，在神經(jīng)血管層面，持續(xù)的腦實質(zhì)供血對神經(jīng)元活動、血腦屏障功能和免疫細(xì)胞監(jiān)測等基本功能是必不可少的。有證據(jù)表明[11]，由血管疾病導(dǎo)致的慢性腦低灌注可能在VCI的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用。CCH導(dǎo)致腦組織缺血和缺氧，從而激活一系列病理反應(yīng)，包括細(xì)胞生物能損傷和離子失衡、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、興奮毒性和鈣超載等，致使神經(jīng)元死亡，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)、智力、思維、推理、語言和執(zhí)行能力下降[10]。海馬區(qū)是參與學(xué)習(xí)能力、空間記憶能力等高度相關(guān)的大腦區(qū)域，而海馬對腦缺血缺氧的狀態(tài)異常敏感[12]，缺血引起海馬結(jié)構(gòu)和功能病理性破壞，這是VCI發(fā)生的關(guān)鍵。突觸活動參與神經(jīng)細(xì)胞信號傳遞、記憶形成和維持細(xì)胞存活，被稱為獲得性神經(jīng)保護(hù)。海馬突觸可塑性受損后可引發(fā)認(rèn)知缺陷。GAP-43參與調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元發(fā)育的多個方面，包括誘導(dǎo)軸突發(fā)芽、損傷后再生，促進(jìn)神經(jīng)突的形成、延伸以及幫助突觸的形成、重建[13]。研究表明[14]，GAP-43是CCH后海馬突觸可塑性的重要標(biāo)記物。

本實驗選用2-VO是用于慢性低灌注研究最常用的動物模型[15]，造模成功后大鼠可出現(xiàn)低灌注狀態(tài)，在多項行為測試(如MWM、八臂迷宮測試、T迷宮和新物體識別試驗等)中表現(xiàn)為認(rèn)知記憶受損，且無明顯運(yùn)動功能障礙。這種造模方式常用于探索從CCH到認(rèn)知下降事件序列中的細(xì)胞和分子機(jī)制，并用于尋找神經(jīng)退行性疾病中潛在的神經(jīng)保護(hù)策略。

有研究發(fā)現(xiàn)[16]，在VCI發(fā)展過程中海馬萎縮程度為11.6%。海馬神經(jīng)元容量的減少降低了它與其他腦區(qū)的連通性，導(dǎo)致突觸傳遞存在缺陷。而海馬和新皮質(zhì)中的突觸喪失是公認(rèn)的血管性癡呆早期事件和認(rèn)知功能障礙的主要原因。因此，靶向調(diào)節(jié)海馬突觸活動和可塑性是改善CCH后認(rèn)知障礙的新方向。GAP-43是軸突和突觸前膜終末的主要成分，作為突觸功能障礙或喪失的生物標(biāo)志物，在神經(jīng)發(fā)育和軸突再生中促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)。在神經(jīng)元損傷后，軸突向正確目標(biāo)生長和形成突觸連接十分重要。研究表明[3]，GAP-43在老年癡呆癥、帕金森病和肌萎縮側(cè)索硬化癥等眾多疾病中參與調(diào)控，幫助保護(hù)存活的神經(jīng)元使其重新建立突觸連接。人體大腦發(fā)育過程中，隨著軸突完成對其靶區(qū)的神經(jīng)支配，GAP-43在大多數(shù)腦區(qū)下調(diào)，但它們在學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的重要區(qū)域(如新皮質(zhì)和海馬區(qū)等部位)仍保持高表達(dá)[17]。因此，GAP-43是一個研究慢性低灌注造成認(rèn)知功能下降病理機(jī)制的重要靶點。

雖然大量證據(jù)已經(jīng)確定了臨床前血管疾病與VCI相關(guān)的風(fēng)險因素[1-2]，但這些風(fēng)險因素導(dǎo)致VCI病理，進(jìn)而產(chǎn)生認(rèn)知障礙的機(jī)制未完全確定，加之阿爾茨海默病和血管性癡呆病理重疊導(dǎo)致的診斷不確定性，治療此疾病的能力非常有限。除了控制血管風(fēng)險因素(如高血壓和糖尿病)的標(biāo)準(zhǔn)措施外，只有少量膽堿酯酶抑制劑在臨床上被證明是有效的[18]，但這些藥物也只能適度改善認(rèn)知功能，而不能改善整體預(yù)后。在這種情況下，迫切需要發(fā)現(xiàn)和完善旨在預(yù)防VCI發(fā)作、改善其進(jìn)展或兩者兼有的新療法。

近年來，針刺作為干預(yù)方法在認(rèn)知障礙治療中的作用越來越明顯，對針刺治療血管性癡呆的機(jī)制研究也越來越深入。針刺被廣泛用于 VCI的治療，改善VCI患者記憶功能的機(jī)制涉及改善腦局部血液循環(huán)，抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)海馬膽堿能系統(tǒng)，調(diào)控海馬區(qū)自噬功能，調(diào)節(jié)清除自由基能力和抗氧化能力等[19]。朱氏等[20]發(fā)現(xiàn)針刺可減少或延遲海馬神經(jīng)元丟失和死亡、改善神經(jīng)元可塑性和樹突結(jié)構(gòu)及改善神經(jīng)元線粒體病理性損傷。Yao等通過研究[21]，認(rèn)為靳三針治療通過患者腦血流狀態(tài)的改善、防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡等途徑來調(diào)節(jié)患者的神經(jīng)電生理，從而降低認(rèn)知功能的損害?？祻?fù)訓(xùn)練是臨床輔助治療血管性癡呆的常規(guī)手段，包括認(rèn)知康復(fù)訓(xùn)練、日常生活能力、記憶力、言語與運(yùn)動功能訓(xùn)練等針對患者的綜合訓(xùn)練方式。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[22]，康復(fù)訓(xùn)練可以增加腦血流量，提高氧利用率，并上調(diào)促進(jìn)突觸可塑性和神經(jīng)元存活相關(guān)的分子靶標(biāo)的基因表達(dá)，改善學(xué)習(xí)記憶能力。叢刺和康復(fù)同時同步進(jìn)行作為本實驗的干預(yù)方法，雙向調(diào)節(jié)，可達(dá)到整體康復(fù)的效果。實驗結(jié)果顯示，針康組大鼠逃避潛伏期縮短，穿臺次數(shù)增加，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到提高。HE染色結(jié)果顯示，針康組大鼠海馬細(xì)胞間排列較密集齊整，細(xì)胞和突觸結(jié)構(gòu)較完整，突觸細(xì)胞數(shù)量及神經(jīng)元的丟失緩解。海馬區(qū)GAP-43蛋白表達(dá)顯示，針康組GAP-43蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，上調(diào)幅度高于針刺組和康復(fù)組。

綜上，針康法可以有效提高慢性腦低灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷，提高生長相關(guān)蛋白-43表達(dá)水平。針康法調(diào)節(jié)突觸可塑性、保護(hù)神經(jīng)、突觸結(jié)構(gòu)和功能完整的途徑可能為恢復(fù)CCH所致學(xué)習(xí)記憶等能力受損提供新思路。