柯 超，曹 洋，單生濤，夏葉婉，譚 艷，石文英，章 薇

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能障礙以及人格改變等癥狀為臨床表現(xiàn)的一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。近年來，其發(fā)病趨勢越來越高，國際老年癡呆協(xié)會發(fā)布數(shù)據(jù)顯示全球癡呆癥患者，截至2015年已達(dá)4 680萬，至2050年患者人數(shù)預(yù)計(jì)將達(dá)1.315億[2]。其所帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也不容小覷，中國在全球癡呆癥總成本中所占比例很高[3]，2015年、2020年、2030年、2040年和2050年，中國分別占全球癡呆癥總成本的17.52%、18.71%、20.00%、20.80%和20.70%，預(yù)計(jì)2050年我國阿爾茨海默病的直接經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將達(dá)7 453.21億元/年[4]。

阿爾茨海默病歸屬于中醫(yī)“癡呆”“善忘”“健忘”“多忘”“好忘”“善誤”“忘事”與“呆病”等。清代汪昂《醫(yī)方集解·補(bǔ)養(yǎng)之劑》曰：“人之精與志皆藏于腎，腎精不足則志氣衰，不能上通于心，故迷惑善忘也?！叭粝忍觳蛔慊蚝筇焓юB(yǎng)，致使腎精不足，則不能生髓充盈，髓?？仗摚X髓失充，元神失養(yǎng)，故表現(xiàn)為頭暈?zāi)垦?、耳鳴如蟬和記憶力減退，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。魏江平等[5]認(rèn)為“陽化氣，陰成形”的功能異常貫穿癡呆的整個(gè)過程，是癡呆病機(jī)核心。隨著年齡增長，各個(gè)臟腑陰陽逐漸衰退，陽不可化氣，陰不可成形，在此基礎(chǔ)上生成痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物，最終瘀阻腦絡(luò)、痰瘀化火、神明被擾和腦髓漸空，最終形成癡呆。故而，癡呆發(fā)病的病位在腦，與五臟相關(guān)[6]，考慮本病病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，以五臟虛損為本，痰濁瘀血為標(biāo)，虛實(shí)夾雜，最終導(dǎo)致神機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)不利，發(fā)生癡呆，故而治療上應(yīng)從五臟著手，從整體水平對該病進(jìn)行考量，實(shí)施綜合治療[7]。

針灸治療AD具有早期性、安全性、功能性與良性雙向調(diào)整的優(yōu)勢[8]，且針刺對AD的確切療效主要是通過多種途徑發(fā)揮治療作用：抑制Aβ淀粉樣蛋白過度沉積、抑制Tau蛋白過度磷酸化、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、提高自噬、提高載脂蛋白E表達(dá)、調(diào)控能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的生理病理狀態(tài)、提高雌激素水平、改善免疫系統(tǒng)、改善胰島素抵抗、提高神經(jīng)營養(yǎng)因子含量、激活海馬蛋白激酶和抑制中樞神經(jīng)炎性與改善突觸可塑性等[9-11]。針刺治療AD的機(jī)制較為復(fù)雜，表觀遺傳修飾可能參與其中，Aβ過度沉積是AD發(fā)病的重要病理特征之一，但是目前相對于表觀遺傳學(xué)機(jī)制這塊探討不多，故而筆者就表觀遺傳學(xué)中的DNA甲基化對針刺治療阿爾茨海默病Aβ過度沉積這一病理環(huán)節(jié)的可能機(jī)制研究進(jìn)行探討，綜述如下。

1 DNA甲基化

1.1 DNA甲基化定義

表觀遺傳是指不改變基因序列，對基因進(jìn)行可逆性的修飾從而改變基因的表達(dá)。DNA甲基化、組蛋白共價(jià)修飾和RNA編輯等均屬于表觀遺傳的方式。其在AD發(fā)病中也發(fā)揮著重要的作用，涉及到AD多個(gè)環(huán)節(jié)：AD中的記憶缺失、淀粉樣前體蛋白水解(APP)、Aβ淀粉樣斑塊形成、Tau蛋白磷酸化、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與線粒體功能障礙等[2]。其中，DNA甲基化是目前最具特征、研究最多和最為常見的表觀遺傳修飾，在AD發(fā)病過程中起著相當(dāng)重要的作用[12]。研究表明，DNA甲基化與AD的學(xué)習(xí)記憶能力、淀粉樣斑塊形成和磷酸化Tau蛋白形成等多環(huán)節(jié)相關(guān)。DNA甲基化是指經(jīng)過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)介導(dǎo)作用，在基因啟動子中CpG島胞嘧啶的5位碳原子上加入一個(gè)甲基基團(tuán)，阻礙轉(zhuǎn)錄因子和啟動子的結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄，達(dá)到介導(dǎo)基因沉默的目的。

1.2 參與DNA甲基化調(diào)控的物質(zhì)

在DNA甲基化的過程中，DNMT、MeCP2及SAM/SAH參與DNA甲基化的調(diào)控。SAM為甲基供體，可以在DNMT的作用下，去掉一個(gè)甲基就轉(zhuǎn)變?yōu)镾AH，去掉的甲基參與DNA甲基化過程，SAH會進(jìn)一步形成同型半胱氨酸(Hcy)，Hcy在接受5-甲基四氫葉酸后會共同合成蛋氨酸，繼而又轉(zhuǎn)化成SAM，如此循環(huán)。若SAM/SAH比率降低，會損害細(xì)胞DNA、RNA、組蛋白和細(xì)胞核受體輔助調(diào)節(jié)因子的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)[3]。也就是說，SAM是DNA甲基化過程中甲基的主要來源，SAM/HCY循環(huán)是體內(nèi)的甲基循環(huán)途徑。

DNMT是參與DNA甲基化的主要酶，可以將SAM上的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上，由此形成5甲基胞嘧啶。DNMTs家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a及DNMT3b等。DNMT3a的表達(dá)與神經(jīng)退行性疾病有密切關(guān)聯(lián)[4]，DnMT3a和3b負(fù)責(zé)DNA的從頭甲基化[13]，而DNMT1是維持甲基化酶[14]。有研究顯示[15]DNMT3a優(yōu)先參與維持甲基化，使胞嘧啶半甲基化，然后由DNMT1和MeCP2作用，以確?；虻耐耆种?。因此，DNMT3a的任何改變最終都會導(dǎo)致低甲基化，從而激活特定的靶基因。

甲基結(jié)合蛋白(MBDs)是連接DNA甲基化和組蛋白修飾的關(guān)鍵蛋白。MBD蛋白家族主要有5個(gè)成員，包括MBD1、MBD2、MBD3、MBD4以及MeCP2(甲基CpG蛋白2)[16]。該蛋白在成熟神經(jīng)元中的大量存在表明，它對神經(jīng)元的功能特別重要，MeCP2具有轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子的雙重作用[17]，在神經(jīng)系統(tǒng)中，MeCP2主要是通過轉(zhuǎn)錄抑制子發(fā)揮作用。MeCP2優(yōu)先結(jié)合到甲基化DNA位點(diǎn)，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子與神經(jīng)細(xì)胞特異性基因啟動子發(fā)生特異性結(jié)合，并對其產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

1.3 DNA甲基化的發(fā)生位點(diǎn)

DNA甲基化主要發(fā)生在CpG島和啟動子區(qū)，當(dāng)DNA甲基化發(fā)生在啟動子區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄水平通過兩種途徑影響：①由于該區(qū)域DNA的甲基化轉(zhuǎn)錄因子不能結(jié)合基因啟動子，即啟動子區(qū)域被甲基所占領(lǐng)，故而不能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄受到抑制;②甲基CpG結(jié)合蛋白結(jié)合這些甲基化的DNA序列，即啟動子區(qū)域被甲基結(jié)合蛋白所占領(lǐng)，不能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄受到抑制。最終，高甲基化抑制基因的表達(dá)，低甲基化則促進(jìn)基因的表達(dá)。見圖1。

2 Aβ沉積與DNA甲基化異常修飾

2.1 Aβ沉積是引起AD病理損傷的中心環(huán)節(jié)

目前AD的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，存在多種假說，而各種假說的形成與既有假說的完善，使AD形成機(jī)制傾向具有復(fù)雜、系統(tǒng)和多元的特點(diǎn)，而逐步放棄單一因素致病的觀點(diǎn)。目前較為多見的假說是β淀粉樣蛋白假說/Aβ瀑布假說，其主要認(rèn)為：β-淀粉樣蛋白積累所形成的老年斑(SP)是目前公認(rèn)的AD主要的病理學(xué)特征之一，研究認(rèn)為Aβ沉積是引起AD病理損傷的中心環(huán)節(jié)。Aβ的產(chǎn)生和清除在正常情況下處于動態(tài)平衡中，病理情況下，Aβ的生成與清除失衡可導(dǎo)致細(xì)胞外Aβ過度沉積，聚集為具有神經(jīng)毒性的SP，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元變性、壞死；與此同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞(MG)、小膠質(zhì)細(xì)胞(AS)可被Aβ激活，神經(jīng)炎性因子可被Aβ誘導(dǎo)產(chǎn)生，如IL-1β、IL-6、TNF-α及INF-γ等，從而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AD進(jìn)展；此外，Aβ在聚集過程中會誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[18]；Aβ能促進(jìn)隔-海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損害[19]；Aβ過量表達(dá)會促進(jìn)神經(jīng)纖維纏結(jié)NFT形成，導(dǎo)致Tau蛋白高磷酸化[20]。由此可見，沉積的Aβ可通過各種途徑直接或間接地促進(jìn)AD的發(fā)展。

2.2 Aβ生成和清除失衡導(dǎo)致Aβ沉積

Aβ生成和清除主要是通過如下途徑,淀粉樣前體蛋白(APP)是Aβ的前體物質(zhì)，生理狀態(tài)下，APP主要通過非淀粉樣蛋白生成途徑代謝，先由α-分泌酶切割，再經(jīng)過γ-分泌酶切割，生成無毒性的P3肽和APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AICD)，釋放到細(xì)胞質(zhì)的AICD片段被蛋白酶降解。病理狀態(tài)下，APP通過淀粉樣蛋白生成途徑代謝，先由β-分泌酶(BACE1)切割，再經(jīng)過γ-分泌酶(PS1、PS2)切割，生成不同長度的Aβ片段和AICD[21]。Aβ在體內(nèi)的清除途徑包括中樞清除和外周清除，中樞清除是主要清除途徑，包括: 蛋白酶的降解作用、細(xì)胞的清除作用、血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)作用、腦脊液和組織間液淋巴引流作用。其中，蛋白酶的降解作用占據(jù)主導(dǎo)地位，盡管Aβ可以被大腦中多種蛋白酶代謝，但是仍有相當(dāng)數(shù)量的Aβ以完整形式存在。因此，Aβ的另一清除途徑也值得關(guān)注，即細(xì)胞清除，細(xì)胞內(nèi)Aβ降解主要在溶酶體中進(jìn)行，Aβ被小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元等細(xì)胞攝取內(nèi)化后，通過溶酶體中的組織蛋白酶降解[22]。

2.3 DNA甲基化參與Aβ相關(guān)基因的調(diào)控

研究表明，DNA甲基化在腦衰老和AD中起關(guān)鍵作用[23]，AD與基因組的整體低甲基化有關(guān)[24]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因組DNA的胞嘧啶甲基化隨著年齡的增長而減少，也就是說表觀遺傳因素在衰老過程的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要的作用。對AD患者皮層組織神經(jīng)元進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)患者5-甲基胞嘧啶(5mC)的免疫反應(yīng)性明顯低于同年齡正常對照組。同一神經(jīng)元中，5mC的水平也與晚期神經(jīng)纖維纏結(jié)的標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，提示5mC的顯著損失發(fā)生在AD大腦中[25]。

前期研究證明，異常的DNA甲基化可能增加Aβ的沉積，APP、BACE1及PS1(γ分泌酶的活性中心)受到DNA甲基化的調(diào)節(jié)。West等首次報(bào)道AD患者腦中APP啟動子會發(fā)生低甲基化[26]，PS1和BACE1基因啟動子低甲基化也促進(jìn)了Aβ的生成[27]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，APP過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠以缺乏葉酸的食物喂養(yǎng)后，BACE1、PS1啟動子區(qū)低甲基化，表達(dá)上調(diào)從而造成Aβ生成增多[28]，即通過DNA甲基化循環(huán)途徑來參與AD的病理過程。更有研究發(fā)現(xiàn)Aβ聚集會促進(jìn)隔-海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損害，引起細(xì)胞內(nèi)廣泛低甲基化，并提高NEP啟動子甲基化，形成一定的惡性循環(huán)，同時(shí)AD的發(fā)生與APOE的超甲基化密切相關(guān)[29]?；谶@些研究發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)確定在Aβ生成相關(guān)基因，例如：PS1、BACE和APP基因中，DNA甲基化降低，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄過程，促進(jìn)了Aβ生成；在Aβ清除相關(guān)基因，例如：NEP、APOE基因中，DNA甲基化增高，從而抑制轉(zhuǎn)錄過程，抑制了Aβ清除，最終增強(qiáng)了Aβ沉積。黃珮戎[30]研究發(fā)現(xiàn)AMPO模型中表觀遺傳機(jī)制調(diào)控了RPE細(xì)胞分泌Aβ增多，該模型中甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)減少，BACE1基因啟動子低甲基化，Aβ生成增多。姜黃素能通過誘導(dǎo)阿爾茨海默病細(xì)胞模型中NEP基因DNA發(fā)生去甲基化，從而上調(diào)NEP的mRNA及蛋白水平[31]。

3 針刺治療阿爾茨海默病的DNA甲基化機(jī)制

3.1 針刺可有效治療AD

有學(xué)者對1 324項(xiàng)AD臨床研究中的77項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)進(jìn)行Meta分析提示針灸治療AD具有良好的臨床優(yōu)勢[32]，具有早期性、安全性、功能性和良性雙向調(diào)整的優(yōu)勢?，F(xiàn)有研究均已經(jīng)證實(shí)針刺治療AD并非只通過某一種作用機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，而是通過多靶點(diǎn)多途徑干預(yù)實(shí)現(xiàn)[33-34]：減少Aβ沉積、抑制Tau蛋白過度磷酸化、調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)、抑制神經(jīng)元凋亡、減輕氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)能量代謝、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、緩解免疫炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)金屬離子代謝及減少線粒體損傷等方面，這與中醫(yī)所強(qiáng)調(diào)的整體觀念及綜合調(diào)治相呼應(yīng)。就減少Aβ沉積這一機(jī)制而言，針刺能夠調(diào)節(jié) Aβ 的生成與代謝，減低有關(guān)腦區(qū)Aβ水平。電針可有效降低 AD模型小鼠大腦皮層和血清中的 Aβ1-40和Aβ1-42水平，改善學(xué)習(xí)記憶能力[35]。楊文丹[36]研究發(fā)現(xiàn)電針能夠顯著減低APP/PSl模型小鼠海馬APP、BACE1表達(dá)，同時(shí)提升催化Aβ降解的水解酶IDE水平，減少海馬區(qū)SP的沉積。羅磊等[37]研究顯示針灸可降低AD大鼠血清內(nèi)Aβ含量，使大鼠海馬區(qū)兩種Aβ降解酶——NEP和PREP的表達(dá)顯著增加，從而延緩AD的病理進(jìn)程。

3.2 針刺可參與DNA甲基化調(diào)控

表觀遺傳對其所致的疾病具有可逆性[38]，針灸可通過調(diào)控表觀遺傳修飾治療缺血性腦卒中[39]、肝癌[40]等疾病。研究表明，針刺可降低坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的額葉皮層中MeCP2和DNMT酶水平，逆轉(zhuǎn)整體DNA甲基化的下降，從而緩解慢性疼痛[41]。電針可以降低多囊卵巢綜合征模型大鼠下丘腦中的整體DNA甲基化水平和DNMT3b的表達(dá)[42]。電針治療慢性傳輸型便秘大鼠可以增加結(jié)腸組織中GDNF啟動子區(qū)的CpG水平，降低甲基化水平[43]。電針慢性不可預(yù)知性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠可升高海馬DNMT3L基因的mRNA水平、降低MBP基因的mRNA水平，考慮這可能有Dnmt3L基因和MBP基因表觀調(diào)節(jié)變化[44]。

3.3 針刺可能通過調(diào)控DNA甲基化減少Aβ沉積

針灸可通過調(diào)控表觀遺傳修飾治療多種疾病，那么針刺是否是通過表觀遺傳修飾中的DNA甲基化途徑來治療AD的病理環(huán)節(jié)——Aβ沉積，有待繼續(xù)觀察。目前，有研究發(fā)現(xiàn)預(yù)電針和預(yù)針刺可上調(diào)細(xì)胞核中DNMT1蛋白表達(dá)水平，可顯著上調(diào)D-半乳糖誘導(dǎo)的AD樣病理大鼠中縫背核區(qū)GSK3β基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平，抑制GSK3β基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[45]。馬冉[46]發(fā)現(xiàn)電針可升高SAMP8小鼠海馬組織CDK5基因啟動子區(qū)甲基化水平，上調(diào)DNMT1的表達(dá)，從而抑制tau蛋白過度磷酸化。可見，針刺可通過調(diào)控AD發(fā)病的其他病理環(huán)節(jié)的DNA甲基化修飾途徑來治療該病，但是尚未有研究探索針刺是否通過DNA甲基化修飾途徑來治療Aβ沉積，有待進(jìn)一步完善。

4 結(jié)語

近年來，針對針灸通過調(diào)控表觀遺傳修飾治療AD的研究也逐漸增多，為針灸治療AD的作用機(jī)制提供了新的思路和研究方向。DNA甲基化作為最具特征、研究最多與最為常見的表觀遺傳修飾途徑，在AD發(fā)病過程中起著相當(dāng)重要的作用。而Aβ沉積是引起AD病理損傷的中心環(huán)節(jié)，DNA甲基化修飾異常即可影響Aβ相關(guān)生成或者清除基因的表達(dá)，從而影響其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。那么，針刺作為一種治療AD的有效方式，目前認(rèn)為其治療AD可通過多靶點(diǎn)多途徑發(fā)揮作用，前期研究發(fā)現(xiàn)針刺可通過參與甲基化的調(diào)控來參與諸多疾病的治療，那么針對于Aβ沉積這一AD的病理環(huán)節(jié)，關(guān)于DNA甲基化與針刺治療AD大鼠Aβ相關(guān)基因調(diào)控的研究比較少，其具體機(jī)制尚不清楚，針刺是否通過DNA甲基化修飾途徑來減少Aβ沉積有待深入研究。

筆者認(rèn)為后續(xù)可以充分利用分子生物學(xué)技術(shù)探討電針對AD大鼠Aβ沉積調(diào)控機(jī)制的影響,從分子水平探究Aβ相關(guān)基因的表達(dá)及其參與誘導(dǎo)Aβ相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，更加全面系統(tǒng)地揭示針灸干預(yù)AD的作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵, 為臨床運(yùn)用針灸防治AD提供更加夯實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，闡明其療效機(jī)制。與此同時(shí)，在導(dǎo)致AD發(fā)病的一些病理過程中，DNA高甲基化和低甲基化是并存的，往往并非獨(dú)立存在，同時(shí)其過程可能涉及到復(fù)雜因子和信號通路，那么如何提高相關(guān)基因的甲基化和降低相關(guān)基因的甲基化水平，如何進(jìn)行基因特異性的針刺治療，將DNA甲基化調(diào)控在一個(gè)適度的水平來防治AD也是一個(gè)值得思考的難題，有待進(jìn)一步研究。然而，盡管目前面臨諸多難題，需要探究更特異的靶點(diǎn)，但不可否認(rèn)，從DNA甲基化角度探究有望成為AD治療的發(fā)展方向，且隨著現(xiàn)代技術(shù)的提升，相信其會有更好的發(fā)展趨勢。