胡慧艷，文志強，任婧婻，李曉，范剛，潘思軼，張璐璐

1.華中農業(yè)大學食品科學技術學院/環(huán)境食品學教育部重點實驗室/果蔬加工與品質調控湖北省重點實驗室，武漢 430070；2.湖北省畜牧良種場，荊州 434010；3.河南工業(yè)大學糧油食品學院，鄭州 450001

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）被認為是一種不可逆的神經系統(tǒng)疾病，其特點是細胞外β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）積累、突觸破壞、細胞內神經元纖維纏結、大腦炎癥和記憶喪失[1]。一些研究表明，氧化應激與AD的神經元損傷之間存在聯(lián)系[2]。此外，AD患者還有膽堿能系統(tǒng)的功能減退癥狀，這可能是膽堿能神經元的顯著喪失、膽堿能神經元和軸突的異常以及突觸后神經元對乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）的可利用性降低引發(fā)的[3]。目前采用的阿爾茲海默癥治療方法多以膽堿酯酶抑制劑為主，但可能有加重中風或死亡的副作用[4]。因此，需要從自然來源中尋找更安全的替代品來提供神經保護[5]。

佛手柑精油（bergamot essential oil，BEO）是來自佛手柑鮮果的一種重要的植物衍生物，被廣泛用于化妝品、醫(yī)藥和食品行業(yè)[6]。隨著BEO的廣泛應用，它的一些生物效應已經被發(fā)現(xiàn)，如BEO可以減輕卡拉膠誘導的大鼠炎癥[7]。此外，還有研究表明，BEO可以改善情緒、緩解壓力引起的焦慮癥狀[8-9]。之前的研究探討了BEO不同嗅聞時間對AD小鼠模型的影響[1]，在此基礎上，本研究通過行為學實驗并測定氧化應激水平和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）活性，進一步評估BEO嗅聞濃度對D-gal和AlCl3誘導的AD小鼠認知功能障礙的緩解作用，旨在為進一步應用芳香療法治療AD提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

佛手柑精油，上海妙爾香料有限公司；D-gal和無水氯化鋁（AlCl3），中國醫(yī)藥集團有限公司；鹽酸多奈哌齊，衛(wèi)材（中國）制藥有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）試劑盒，上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Y-迷宮，北京眾實迪創(chuàng)有限公司；電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機械廠。

1.3 實驗動物

35只SPF級4周齡的雄性昆明小鼠（KM），動物合格證號為SCXK（鄂）2020-0019，實驗動物和飼料購自華中農業(yè)大學實驗動物中心。日光燈人工照明（照明時間：08：00－20：00），溫度（22±2）℃。小鼠自由飲水飲食。所有試驗都得到了華中農業(yè)大學動物實驗委員會的批準（倫理號為HZAUMO-2021-0047）。

1.4 方法

1）動物建模與分組。采用蒸餾水制備25%和75%的BEO稀釋液。制備24 g/L的D-gal溶液和2 g/L AlCl3的溶液。將上述D-gal和AlCl3溶液等體積混合得到12 g/L的D-gal和1 g/L的AlCl3的混合溶液。實驗小鼠被隨機分為5組（n=7）。對照組（Con）：連續(xù)49 d接受生理鹽水腹腔注射；模型組（Mod）：連續(xù) 49 d腹腔注射D-gal（120 mg/kg）和AlCl3（10 mg/kg）；鹽酸多奈哌齊組（Don）：連續(xù)49 d腹腔注射D-gal（120 mg/kg）和AlCl3（10 mg/kg），第29天起每天口服鹽酸多奈哌齊（2 mg/kg），持續(xù)21 d；25%BEO組和75%BEO組：連續(xù)49 d腹腔注射D-gal（120 mg/kg）和AlCl3（10 mg/kg），并且從第29天開始嗅聞25%BEO和75%BEO，每天1 h，持續(xù)21 d。隨后，在第50天開始進行行為學實驗。行為學實驗結束后，從眼球中提取血液，并收集腦組織用于測試。

2）曠場實驗。曠場實驗（open field test，OFT）是用來確定小鼠在陌生環(huán)境中的行為活動及其對陌生環(huán)境的探索行為。OFT過程參考文獻[1]。

3）Y-迷宮。采用Y-迷宮裝置來評估小鼠的自發(fā)交替行為。方法參考文獻[1]。

1.5 氧化應激標志物和膽堿能的測定

在行為學實驗完成后，從小鼠眼睛中提取血液，4℃下以3 000 r/min離心2 min進行血清分離，用試劑盒測定血清中的SOD活性和MDA含量。同時在行為學實驗結束后，立即從死亡小鼠身上收集大腦，在冰塊上解剖得到前額葉皮層和海馬結構，并用液氮速凍，樣品保存在-80℃。用試劑盒測定大腦組織中的GPX和AchE活性。

1.6 蘇木精和伊紅染色實驗

收集小鼠大腦并在4%多聚甲醛中保存48 h，然后進行石蠟包埋處理。使用厚度為4 μm的切片機進行大腦的矢狀切片，切片用蘇木精和伊紅（hematoxylin and eosin，H&E）染色后在顯微鏡下觀察海馬區(qū)神經細胞結構。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)值均以“平均值±標準差”來表示。使用Graphpad Prism 7.0進行分析與繪圖，用SPPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），并采用Duncan’s法進行多重檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 曠場實驗結果

OFT的結果如圖1所示。與對照組相比，模型組在水平跨越格子數(shù)（圖1A）和直立次數(shù)（圖1B）上都有明顯的下降（P＜0.01），這表明小鼠在OFT中的精神狀態(tài)發(fā)生惡化。與Mod組相比，BEO的聯(lián)合治療組的水平跨越格子數(shù)和直立次數(shù)明顯增加，表明BEO減少了D-gal和AlCl3誘導的AD模型的焦慮樣行為。25%BEO處理組和75%BEO處理組在OFT中的水平跨越格子數(shù)和直立次數(shù)有明顯差異（P＜0.01），表明75%BEO處理對改善小鼠的精神狀態(tài)有更好的效果。

圖1 嗅聞BEO對D-gal和AlCl3處理的小鼠在OFT中的水平跨越格子數(shù)（A）和直立次數(shù)（B）的影響Fig.1 Effects of the inhaled BEO on the number of squares across（A）and the number of uprights（B）of the D-gal and AlCl3treated mice in the OFT

2.2 Y-迷宮測試結果

在Y-迷宮測試中，單因素方差分析顯示各組之間存在著整體的顯著差異。與對照組相比，模型組的自發(fā)交替百分比（圖2A）和進入新臂的次數(shù)（圖2B）急劇下降（P＜0.01），表明模型組的小鼠在腹腔注射D-gal和AlCl3后出現(xiàn)了認知障礙。然而，在經過灌胃鹽酸多奈哌齊和嗅聞75%BEO持續(xù)21 d后，自發(fā)交替百分比的下降幅度明顯減弱（鹽酸多奈哌齊組P＜0.01，75%BEO組P＜0.05），進入新臂的次數(shù)也有顯著提高（P＜0.05）。這一結果表明，本研究中使用2種劑量的BEO，特別是75%BEO，對模型小鼠在Y-迷宮任務中短期記憶的獲得表現(xiàn)出更好的治療效果?？赡苁歉邼舛鹊木痛偈雇ㄟ^血腦屏障的生物活性分子（如芳樟醇等）的數(shù)量增加，起到了提高自發(fā)交替行為的作用。

圖2 嗅聞BEO對D-gal和AlCl3處理的小鼠在中自發(fā)交替百分比（A）和進入新臂的次數(shù)（B）的影響Fig.2 Effects of the inhaled BEO on the percentage of alternation（A）and the number of entries into the new arm（B）of the D-gal and AlCl3treated mice

2.3 嗅聞BEO對阿爾茲海默癥小鼠氧化應激程度的影響

與對照組相比，模型組MDA（圖3A）的水平明顯上升（P＜0.01），而SOD（圖3B）的活性明顯下降（P＜0.01）。然而，與Mod組小鼠相比，嗅聞BEO（25%和75%）可明顯減弱MDA水平的增加幅度（25%BEO組，P＜0.05；75%BEO組P＜0.01）。此外，與模型組相比，75%BEO組的處理明顯增加了SOD的活性（P＜0.01）。

圖3 嗅聞BEO對D-gal和AlCl3處理的小鼠血清中MDA濃度（A）、SOD水平（B）、海馬（C）和皮層（D）中GPX水平的影響Fig.3 Effects of the inhaled BEO on the concentration of MDA（A），SOD（B），GPX levels in the hippocampus（C）and cortex（D）of D-gal and AlCl3-treated mice

圖3C、D是小鼠海馬和皮層中的GPX活性的測定結果。與對照組相比，Mod組在海馬和大腦皮層中的GPX活性明顯下降（P＜0.01）。與Mod組相比，BEO（25%和75%）處理可顯著提高小鼠海馬和皮層中GPX活性。結果表明，BEO具有抗氧化活性，可增強AD小鼠體內SOD和GPX的活性，降低MDA含量，緩解氧化應激導致的認知障礙。

2.4 嗅聞BEO對阿爾茲海默癥小鼠的膽堿能的影響

模型組小鼠大腦海馬和皮層中的AchE活性（圖4）顯著增加（P＜0.01），表明攝入D-gal和AlCl3對膽堿能神經系統(tǒng)具有抑制作用。嗅聞25%BEO和75%BEO后，模型小鼠海馬和大腦皮層中的AchE活性均顯著降低（P＜0.01），導致Ach水平的增加。因此，BEO對AchE活性的調節(jié)可能也參與了小鼠認知功能的改善。

圖4 嗅聞BEO對D-gal和AlCl3處理的小鼠的海馬（A）和皮層（B）中的AchE水平的影響Fig.4 Effects of the inhaled BEO（25% and 75%）on the AchE level in hippocampus（A）and cortex（B）in the D-gal and AlCl3treated mice

2.5 嗅聞BEO對阿爾茲海默癥小鼠海馬組織的影響

圖5是小鼠海馬組織切片的H&E染色結果。藍色帶是海馬的細胞帶，藍色周圍的紅色部分是這些細胞的樹突和細胞基質?？瞻捉M小鼠腦組織切片藍色細胞帶密集而整齊，神經元細胞排列緊密，結構完整。而模型小鼠海馬中的細胞帶排列相對松散，神經元及其細胞核的正常結構喪失，可能出現(xiàn)神經退行性病變，表明D-gal和AlCl3聯(lián)合模型對模型小鼠的神經細胞造成了一定的損傷。與模型組相比，治療組海馬的細胞帶比模型組更緊密、清晰。上述結果表明，嗅聞BEO可以緩解D-gal和AlCl3誘導的模型小鼠海馬的神經元數(shù)目的減少，起到了一定的神經保護作用。

圖5 小鼠海馬組織H&E染色結果（400×）Fig.5 HE（400×）staining results of mice hippocampus in groups

3 討論

本研究分別運用OFT和Y-迷宮測試了各組小鼠的精神狀態(tài)和認知功能，發(fā)現(xiàn)嗅聞BEO精油21 d（每天1 h）后，小鼠的精神狀態(tài)和認知功能顯著改善，且高濃度精油處理顯示出更好的效果。這與前人的研究結果[10-11]相一致，其研究顯示AlCl3誘導處理的小鼠自發(fā)交替行為的百分比減少。同時也與Abou等[12]的研究結果相似，柑橘種子及其次生代謝產物改善了AlCl3誘導的AD模型大鼠的精神狀態(tài)并明顯增加了行走頻率。

眾所周知，氧化應激是引發(fā)衰老和年齡相關疾病的一個重要因素，大量研究表明，氧化應激是AD的重要致病因素之一[13]。在嚙齒動物中長期注射D-gal會產生類似衰老的變化，包括大量自由基的形成和抗氧化酶活性的降低，以及神經肌肉活動和免疫反應受損[14-15]。MDA具有很強的生物毒性，很容易與磷脂和蛋白質反應形成脂褐素（脂質過氧化物氧化形成的最終產物）。MDA含量表征脂質過氧化損傷的程度[16]。SOD是體內最重要的自由基清除酶之一，它可以阻止由O2引發(fā)的自由基連鎖反應。GPX是谷胱甘肽的主要衍生物，參與其相關反應，減少脂質過氧化，保護細胞膜系統(tǒng)免受過氧化損傷[17]。GPX是一種低分子清除劑，是組織中主要的非蛋白巰基化合物，對·O2－和H2O2有直接清除作用。在本研究中，與對照組相比，用D-gal和AlCl3處理的小鼠的氧化應激標志物水平明顯增加，從而證明了腦組織和血清中自由基的增加。經75%BEO治療后，腦組織和血清中增加的自由基被清除，氧化應激程度減輕。植物精油在體內和體外的抗氧化作用均有報道，被推測為改善學習記憶障礙的可能機制之一。Cui等[6]研究表明，BEO可以抑制脂質過氧化，激活內源性抗氧化劑（SOD、GPX和過氧化氫酶），以預防小鼠的氧化應激和認知損傷。此外，有研究表明柑橘類精油中高含量的萜類化合物具有良好的抗氧化和抗膽堿酯酶活性[18]。因此，BEO的抗氧化作用可能是改善Y-迷宮和OFT中認知能力的機制之一。

Ach是中樞膽堿能系統(tǒng)中一個非常重要的神經遞質，主要作用是保持意識。AchE是水解Ach的主要酶，其活性大小可以表征膽堿能神經系統(tǒng)的功能。研究表明，金屬可能干擾穿過神經元的神經遞質流動，導致神經退行性病變、膽堿能傳遞改變和AchE活性增加，這與記憶缺陷和認知障礙有關[19]。在本研究中，BEO具有抑制AchE活性和改善膽堿能系統(tǒng)的能力，表現(xiàn)為腦乙酰膽堿酯酶活性降低，從而改善D-gal和AlCl3誘發(fā)的神經毒性作用。眾多研究表明，植物精油具有AchE的抑制活性。如Liu等[20]的研究結果表明，檸檬精油通過調節(jié)海馬突觸密度和抑制AchE，緩解了APP/PS1雙轉基因（APP/PS1）AD小鼠的認知功能障礙。Bae等[21]研究發(fā)現(xiàn)，來自Chamaecyparis obtuse的精油可以改善認知障礙，并顯著降低AD大鼠的AchE活性。因此，BEO對AchE的抑制作用可能是改善Y-迷宮和OFT中記憶表現(xiàn)的機制之一。BEO應被視為一種膽堿酯酶抑制劑，以緩解由注射D-gal和AlCl3產生的膽堿能系統(tǒng)的功能障礙。筆者在之前的研究中發(fā)現(xiàn)該品種BEO中主要成分是檸檬烯和芳樟醇等萜烯類物質[1]。Piccialli等[22]研究發(fā)現(xiàn)檸檬烯對AchE表現(xiàn)出顯著的抑制活性，且半抑制濃度幾乎與作為陽性對照的加蘭他敏相當。另有研究證明，芳樟醇除了能夠抑D-gal和AlCl3導致的AchE的升高之外[23]，也能緩解Aβ導致的膽堿能系統(tǒng)的功能障礙[24]。尤其是從柑橘皮中提取的柑橘皮精油及成分（檸檬烯和芳樟醇）對AchE的活性也具有顯著的抑制作用[25]。因此，BEO精油對AchE抑制作用可能是由檸檬烯和芳樟醇所引起。

H&E染色結果表明嗅聞BEO對D-gal和AlCl3誘導的AD小鼠腦組織具有保護作用，可明顯減少小鼠海馬神經元的損傷。劉源香等[26]研究證實，阿爾茲海默癥患者海馬區(qū)神經元的丟失，是導致AD患者出現(xiàn)學習記憶能力下降的主要原因。神經元的存活數(shù)量又會直接影響到神經突觸的可塑性，而海馬CA1、CA3區(qū)的神經突觸的形成也與學習記憶能力的提高有關。

綜上所述，BEO可以通過嗅聞的方式逆轉D-gal和AlCl3造成的模型小鼠認知障礙，且高濃度（75%）佛手柑精油效果更為顯著。BEO的活性作用可能是通過減少氧化應激和調節(jié)大腦中的AchE活性來調節(jié)的?，F(xiàn)階段的研究結果表明，BEO可提供神經保護，并可被視為AD的輔助治療方法。