陳傳玉，譚樊杰，殷平，張德林

作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北洪山實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

植物和細(xì)菌處于營養(yǎng)脅迫時，會產(chǎn)生一種由核苷酸代謝產(chǎn)物（pp）pGpp誘導(dǎo)的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)[1]，即氨基酸饑餓時發(fā)生蛋白合成及相關(guān)基因表達(dá)停滯的反應(yīng)[2-3]。信使分子（pp）pGpp，也被稱為警報素分子，是細(xì)菌和植物生存所必需的。信使分子（pp）pGpp主要分為3種：鳥苷五磷酸（pppGpp，G5P）、鳥苷四磷酸（ppGpp，G4P）和鳥苷三磷酸（pGpp，G3P）。（pp）pGpp與GTP結(jié)構(gòu)非常相似，在五碳糖的5′依次遞減一個磷酸基團(tuán)，五碳糖的3′焦磷酸基團(tuán)被一個羥基取代。

（pp）pGpp作為常用的信號傳遞分子[4]，對許多病原菌（例如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）的黏附[5]、侵入[6]、免疫逃避、傳播、生物膜形成[7]和慢性感染[7]起著重要作用。鞭毛是大多數(shù)細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞的關(guān)鍵。（pp）pGpp能夠通過抑制病原體鞭毛基因的表達(dá)，從而影響病原體入侵。（pp）Gpp通過產(chǎn)生毒素和調(diào)節(jié)生物膜形成在免疫逃避和細(xì)菌傳播中發(fā)揮作用[8]。由于信使分子（pp）pGpp對細(xì)菌和病原體的毒性、致病性的特殊作用，使其可能成為一種潛在的新型的抗菌藥物[9-11]。

在細(xì)菌中，主要由3種信使分子合成酶（RelA、GppA、YvcI）負(fù)責(zé)催化合成（pp）pGpp[12]。細(xì)菌中（pp）pGpp的合成和水解主要由雙功能RSH代謝酶（例如RelA）決定，RSH合成酶活性過高，（pp）pGpp水平升高，激活應(yīng)激反應(yīng)，抑制細(xì)胞生長和基因表達(dá)。RSH水解酶使（pp）pGpp水平過低，細(xì)胞不能對營養(yǎng)脅迫產(chǎn)生適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。而RSH酶特有的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)不存在哺乳細(xì)胞中，因此，利用（pp）pGpp類似物抑制細(xì)菌生長為開發(fā)新的抗菌藥物提供了可能。盡管（pp）pGpp被發(fā)現(xiàn)已有近50年的歷史，但是（pp）pGpp的代謝和信號傳遞過程仍是關(guān)注的重點(diǎn)。近年來，藍(lán)細(xì)菌中的（pp）pGpp代謝機(jī)制逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，可能與現(xiàn)有的代謝調(diào)控有所差異。由于藍(lán)細(xì)菌是具有葉綠體的放氧光合性細(xì)菌，其類似的RSH活性調(diào)控機(jī)制為日益嚴(yán)重的藍(lán)藻水華治理提供了可能。

現(xiàn)有的研究中，（pp）pGpp主要來源于植物和細(xì)菌的內(nèi)源提取以及酶生物合成[13-14]，具有操作復(fù)雜、成本高昂、使用有毒試劑的弊端，無法滿足快速獲得大量的（pp）pGpp的需求。因此，本研究以體外酶合成（pp）pGpp的方法為基礎(chǔ)，建立和優(yōu)化新的生物合成（pp）pGpp體系，以期為相關(guān)生化和微生物學(xué)研究高效提供物質(zhì)保障。

1 材料與方法

1.1 菌 株

所需菌株為大腸桿菌BL21（λDE3）和DH5α，枯草芽孢桿菌168 strain。其中，信使分子（pp）pGpp合成酶的基因（relA、gppA）序列來源于大腸桿菌BL21（λDE3），yvcI來源于枯草芽孢桿菌168 strain。蛋白表達(dá)純化使用大腸桿菌BL21（λDE3），質(zhì)粒擴(kuò)繁使用大腸桿菌DH5α。

1.2 主要試劑和儀器

1）分子克隆。引物合成和測序由武漢擎科生物有限公司完成，dNTP購買于New England Biolabs公司，Pfu和Taq酶由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室Yin Lab提供。普通DNA產(chǎn)物回收試劑盒（DP204-02）和普通質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-02）購自天根生化科技（北京）有限公司。

2）蛋白純化試劑。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺（B546018）、Tris SDS pH 6.8（B546022）、Tris SDS pH 8.8（C526033）購自生工生物工程股份有限公司、Tris（V900866）、NaCl（V900058）、咪唑（V900153）購買于Sigma公司。

3）信使分子合成試劑。ATP（A600020）和GTP（A620250）購于生工生物工程股份有限公司，Tris、MgCl2、NaCl試劑均購買于Sigma公司。

4）主要儀器。蛋白純化儀（?KTA?pure 25，GE Healthcare）、制冷型臺式真空離心濃縮儀（北京中科科爾儀器有限公司）。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

負(fù)責(zé)合成（pp）pGpp的3種酶基因來源于大腸桿菌BL21（λDE3）和枯草芽孢桿菌（168 strain）。將大腸桿菌 BL21（λDE3）和枯草芽孢桿菌（168 strain）菌株分別涂布無抗生素的LB平板，培養(yǎng)6～8 h；隨后挑取多菌落于50 μL超純水，100℃煮5 min破碎細(xì)胞壁，12 000 r/min離心5 min后，取5 μL的上清作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得DNA片段；將DNA片段裝載于pET15D或pET21b，進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)，選取陽性克隆測序，確定基因序列，進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.4 大腸桿菌培養(yǎng)

將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（λDE3）感受態(tài)細(xì)胞中，接入10 mL含有相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)12 h。再按照1∶100的比例將其接入1 L LB培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃培養(yǎng)4～5 h至OD600達(dá)到1.0左右；將溫度降至16℃誘導(dǎo)14～16 h。

1.5 蛋白純化

使用高壓破碎的方式破碎細(xì)菌，使細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破碎，釋放胞質(zhì)中的蛋白。破碎好的菌液，14 000 r/min 4℃冷凍離心1 h，離心后取上清。因pET15D載體的N端融合6×His純化標(biāo)簽或pET21b載體C端融合8×His純化標(biāo)簽，通常使用Ni柱親和層析獲得目的蛋白，隨后進(jìn)一步使用Source Q 10-100進(jìn)行純化，獲得高純度的信使分子（pp）pGpp合成酶。

1.6 酶活反應(yīng)

以ATP和GTP為原料，通過RelA催化合成G5P，再由焦磷酸激酶GppA水解G5P生成G4P，最后磷酸水解酶YvcI水解G5P或G4P生成G3P。

1）RelA的催化反應(yīng)。RelA以ATP和GTP為原料，將底物ATP-5′端的焦磷酸轉(zhuǎn)移到GTP的3′端上，取代羥基的位置，合成產(chǎn)物AMP和pppGpp。

2）GppA的催化反應(yīng)。GppA以pppGpp為底物，降解其5′端的γ-磷酸基團(tuán)，催化生成產(chǎn)物ppGpp。

3）YvcI的催化反應(yīng)。YvcI以pppGpp和ppGpp為底物，降解5′端的γ和β-磷酸基團(tuán)，催化生成產(chǎn)物pGpp。

RelA1-400以ATP和GTP為底物，于37℃反應(yīng)30 min后使用Source Q 10-100進(jìn)行分離純化，獲得G5P。隨后GppA以G5P為底物催化生成G4P。經(jīng)驗(yàn)證YvcI以G5P和G4P作為底物，催化合成G3P。

1.7 終止反應(yīng)

于95℃終止反應(yīng)，避免使用苯酚等試劑危害人體，同時將蛋白酶變性形成沉淀，除去蛋白等雜質(zhì)，為進(jìn)一步提純信使分子做準(zhǔn)備。

1.8 信使分子(pp)pGpp分離提純

與傳統(tǒng)信使分子提取分離不同，不需要使用有機(jī)試劑萃取，采取更為環(huán)保安全的方式進(jìn)行純化。根據(jù)底物和產(chǎn)物所帶電荷不同，利用Source Q 10-100對信使分子進(jìn)一步分離提純，其中A buffer：25 mmol/L Tris pH 8.0，B buffer：25 mmol/L Tris pH 8.0，1 mol/L NaCl。

1.9 凍 干

利用脫鹽柱將純化后的信使分子置換到需要的超純水中，隨后使用制冷型真空離心濃縮儀，將信使分子濃縮冷凍成干粉，可于-80℃長期保存。

1.10 濃度測定

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的體外表達(dá)純化

將負(fù)責(zé)合成（pp）pGpp的3種酶基因relA、gppA、yvcI，從E.coliBL21（λDE3）和Bacillus subtilis168 strain基因組中克隆到pET15b或pET21D載體上，進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化。如圖1所示，經(jīng)鎳柱親和層析和離子交換層析，3種信使分子合成酶蛋白純度高、性質(zhì)穩(wěn)定，可用于信使分子的體外合成。

2.2 信使分子合成酶活性測定

RelA以ATP和GTP為原料，催化ATP的5′端β位磷酸基團(tuán)斷裂，轉(zhuǎn)移到GTP的3′端取代羥基，合成信使分子G5P（圖2A）。GppA催化G5P的5′端γ位磷酸斷裂合成G4P（圖2B），YvcI以G5P或G4P為底物，催化合成產(chǎn)物G3P（圖2B）。

圖2 信使分子合成酶活性測定Fig.2 Messenger molecular synthase activity assay

2.3 不同條件對產(chǎn)物得率的影響

1）pH對信使分子G5P合成的影響。反應(yīng)體系中的pH依次為Bis-tris pH 6.0，Tris-HCl pH 7.0、8.0、9.0，Glycine pH 10.0，RelA1-400用不同的pH稀釋100倍，濃度為1 μmol/L。如圖3所示，G5P合成量隨pH升高逐漸升高，pH=9時G5P產(chǎn)量最高，RelA1-400的活性最強(qiáng)，pH=10時G5P產(chǎn)量反而降低，RelA1-400的活性降低。

圖3 pH對信使分子G5P合成的影響Fig.3 The effect of pH on the synthesis of the messenger molecule G5P

2）金屬離子對信使分子G5P合成的影響。如圖4所示，在 Tris-HCl pH 9.0、RelA1-400濃度為 1 μmol/L的反應(yīng)體系中，探索金屬離子Ca2+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+對信使分子G5P合成的影響。結(jié)果顯示，RelA1-400在含有Ca2+、Ba2+、Zn2+的反應(yīng)體系中，無催化活性，不合成G5P；RelA1-400在Mg2+存在下，合成效率最高，G5P的產(chǎn)量最高。

圖4 金屬離子對信使分子G5P合成的影響Fig.4 Effects of metal ions on the synthesis|of messenger G5P

3）反應(yīng)時間對信使分子G5P合成的影響。如圖5所示，在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、RelA1-400濃度為1 μmol/L的反應(yīng)體系中，在5～120 min隨時間延長G5P的產(chǎn)量逐漸增加。為縮短反應(yīng)時間，提高合成效率，下文探索G5P合成酶的濃度。

圖5 反應(yīng)時間對信使分子G5P合成的影響Fig.5 The effect of reaction time on the synthesis of messenger molecule G5P

4）酶濃度對信使分子G5P合成的影響。在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、反應(yīng)時間為10 min的反應(yīng)體系中，探索 1、2、4、6、8 μmol/L 酶濃度對信使分子G5P合成的影響（圖6）。結(jié)果顯示，酶濃度在2、4、6 μmol/L時RelA1-400的活性最高，G5P的合成量最高；隨著酶濃度升高，G5P的產(chǎn)量反而降低。為提高反應(yīng)效率，減少反應(yīng)體系中的蛋白酶，提高信使分子的純度，選擇2 μmol/L的RelA1-400作為最佳反應(yīng)酶濃度。

圖6 酶濃度對信使分子G5P合成的影響Fig.6 The effect of enzyme concentration on the synthesis of the messenger molecule G5P

5）反應(yīng)時間對信使分子G4P合成的影響。為提高合成效率，在RelA催化合成反應(yīng)10 min后，直接加入GppA或YvcI繼續(xù)反應(yīng)合成G4P或G3P。這樣，只需一步純化就可以獲得目標(biāo)產(chǎn)物，避免了二次純化的損失。因此，本研究在RelA1-400合成G5P的基礎(chǔ)上，探索優(yōu)化合成信使分子G4P、G3P的方法。在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反應(yīng)10 min后，繼續(xù)添加1 μmol/L GppA參與反應(yīng)，探索反應(yīng)時間對信使分子G4P合成的影響（圖7）。結(jié)果顯示，隨時間延長，信使分子G4P的產(chǎn)量逐漸升高。為提高合成效率，選取反應(yīng)時間20 min，繼續(xù)優(yōu)化GppA酶濃度。

圖7 反應(yīng)時間對信使分子G4P合成的影響Fig.7 The effect of reaction time on the synthesis of messenger molecule G4P

6）酶濃度對信使分子G4P合成的影響。在Tris-HCl pH 9.0、添加 Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反應(yīng) 10 min后，繼續(xù)添加GppA參與反應(yīng)20 min，探索了不同的酶濃度對信使分子G4P合成的影響（圖8）。結(jié)果顯示，隨GppA的濃度升高，信使分子G4P的產(chǎn)量逐漸升高，添加6 μmol/L GppA反應(yīng)20 min，信使分子G4P的產(chǎn)量最高。

圖8 酶濃度對信使分子G4P合成的影響Fig.8 The effect of enzyme concentration on the synthesis of messenger G4P

7）反應(yīng)時間對信使分子G3P合成的影響。在Tris-HCl pH 9.0、添加Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反應(yīng)10 min后，繼續(xù)添加 1 μmol/L YvcI參與反應(yīng)，探索不同反應(yīng)時間對信使分子G3P合成的影響（圖9）。結(jié)果顯示，隨反應(yīng)時間延長，信使分子G3P的產(chǎn)量逐漸升高。添加1 μmol/L YvcI反應(yīng)20 min后，底物基本消耗完。

圖9 反應(yīng)時間對信使分子G3P合成的影響Fig.9 The effect of reaction time on the synthesis of messenger molecule G3P

8）酶濃度對信使分子G3P合成的影響。如圖10所示，在Tris-HCl pH 9.0、添加 Mg2+、2 μmol/L RelA1-400反應(yīng)10 min后，繼續(xù)添加YvcI參與反應(yīng)20 min，探索不同酶濃度對信使分子G4P合成的影響。結(jié)果顯示，隨YvcI的濃度升高，信使分子G3P的產(chǎn)量逐漸升高，添加4 μmol/L YvcI反應(yīng)20 min后，信使分子G3P的產(chǎn)量最高。

圖10 酶濃度對信使分子G3P合成的影響Fig.10 The effect of enzyme concentration on the synthesis of messenger G3P

2.4 制備小分子的適用范圍測定

（pp）pGpp信使分子參與嘌呤合成通路，與嘌呤合成蛋白結(jié)合（Gmk）并抑制其功能。蛋白樣品中不能存在DTT，所以純化蛋白全程不添加DTT，并且分子篩純化時，補(bǔ)加10 mmol/L MgCl2（即25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2），與此同時凍干的信使分子也溶解于此試劑。采用信使分子滴定嘌呤合成蛋白的方法（20∶1）進(jìn)行ITC（isothermal titration calorimetry）實(shí)驗(yàn)。ITC驗(yàn)證了嘌呤合成蛋白（Gmk）與信使分子（pp）pGpp發(fā)生了強(qiáng)烈互作（圖11），說明信使分子（pp）pGpp可以應(yīng)用于生化分析。

2.5 合成通路的優(yōu)化

如圖12所示，與傳統(tǒng)的合成方法相比，新的合成方法只需要將反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離子交換柱進(jìn)行分離純化，除去多余的底物和產(chǎn)物，隨后將得到的信使分子置換到超純水中，凍成干粉即可。此方法簡單快速，不需要任何有毒試劑，安全環(huán)保。

圖11 信使分子（pp）pGpp與Gmk的互作驗(yàn)證Fig.11 Interaction verification of messenger molecule（pp）pGpp and Gmk

圖12 合成通路優(yōu)化Fig.12 Synthetic pathway optimization

2.6 成本對比分析

合成信使分子成本對比分析結(jié)果（表2）顯示，與商業(yè)化購買的信使分子相比，合成信使分子（pp）pGpp的成本降低了96%。

表2 合成信使分子成本對比分析Table 2 Comparative analysis of the cost of synthetic messenger molecules

3 討論

選擇合適的pH和金屬離子是信使分子合成酶發(fā)揮功能的關(guān)鍵，但其他因素也是影響信使分子體外合成的重要因素。體外合成信使分子容易出現(xiàn)蛋白雜質(zhì)，因此，本方法在終止反應(yīng)時，為使蛋白變性而不引入其他有機(jī)試劑，防止其他雜質(zhì)對信使分子純度的影響。另外，本研究體外合成的信使分子經(jīng)驗(yàn)證，可以運(yùn)用到ITC分析。Takahashi等[13]從擬南芥中提取信使分子，采用甲酸、甲醇等具有強(qiáng)腐蝕性和毒性的試劑進(jìn)行信使分子的萃取，進(jìn)一步進(jìn)行HPLC純化獲得信使分子。與其相比，本研究建立的體外合成方法，具有以下優(yōu)勢：一是方法簡單，不需要特殊的有毒試劑；二是原料簡單，常用的ATP、GTP即可參與反應(yīng)；三是無需任何冰上或者4℃操作，室溫操作即可；四是反應(yīng)時間大大縮短。