郭佳豪，胡寶娥，肖雅，李攀，彭靖靖，艾平，4

1.華中農(nóng)業(yè)大學工學院，武漢 430070；2.湖北省漢川市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，漢川 432300；3.湖北省宜昌市農(nóng)村能源辦公室，宜昌 443000；4.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)碳中和工程技術(shù)與裝備研究中心，武漢 430070

對畜禽糞便進行無害化處理并加以增值化利用，是我國未來養(yǎng)殖業(yè)實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重點[1]。在碳中和大背景的影響下，沼氣工程因兼具能源與環(huán)境效益是處理畜禽糞便的有效方式之一[2]。但沼氣工程會產(chǎn)生大量厭氧消化殘留物，沼液中有機物含量和營養(yǎng)成分較高，碳氮比失調(diào)嚴重，可生化性較差，處置不當極易對環(huán)境造成嚴重污染[3]。如何高效價廉回收沼液中的養(yǎng)分，對沼液進行無害化、資源化及綜合處理利用是目前亟待解決的一大難題。

在眾多廢水處理方法中，微生物處理法因成效顯著、成本低廉、無二次污染等優(yōu)勢，已成為研究熱點之一。目前，大部分相關(guān)研究集中在單菌種微生物鑒定及其應用上，例如泛養(yǎng)硫球菌、糞產(chǎn)堿菌、惡臭假單胞菌[4]、施氏假單胞菌 T13[5]和巨大芽孢桿菌[6]等。雖然篩選出的純菌種對特定污染物去除效率較高，但混合菌群抵抗外界干擾、維持群落穩(wěn)定和降解污染物的能力優(yōu)于純菌種[7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)在實際廢水應用中，混合菌群比純菌種具有更好的脫氮效率，利用篩選的特定純菌株來處理廢水時會有菌株存活力低、與本土微生物存在競爭關(guān)系等一系列問題，這使得外加菌株處理廢水技術(shù)的發(fā)展受到了極大的限制[9]。

研究表明培養(yǎng)有機廢水中的本土微生物可以有效處理廢水并回收養(yǎng)分。有研究者在利用沼液本土混合菌群處理沼液時發(fā)現(xiàn)混合菌群對沼液中氮磷養(yǎng)分顯示出良好的去除效果，并且生物量增加到初始量的1.75倍，可作為凈化高濃度沼液的有效菌群，具有微生物增殖的較大潛力[10]。Sobhi等[11]通過改進的氣升式反應器將培養(yǎng)沼液本地微生物和沼液氨吹脫技術(shù)合并，能更好地回收沼液氮磷養(yǎng)分，同時培養(yǎng)增殖富含蛋白質(zhì)的沼液本土微生物，可用于生產(chǎn)高價值生物菌肥。沼液本土微生物菌群培養(yǎng)的設備要求和條件相對簡單，因此，適用作為沼液大規(guī)模生態(tài)利用前的初步處理，也可作為沼液達標處理工藝的前端預處理[12]。

在沼液本土微生物培養(yǎng)時，沼液碳氮比是關(guān)鍵控制參數(shù)。沼液中無機氮去除需要提高有機廢水中碳氮比（C/N）來促進異養(yǎng)微生物生長，因沼液C/N較低則需額外提供有機碳，但最佳有機碳添加量則需根據(jù)微生物在沼液中生長和水質(zhì)處理情況來確定[13]。基于此，本研究考察不同碳源及其添加量對沼液本土微生物生長以及氮磷回收效率的影響，通過沼液本土微生物菌群培養(yǎng)來實現(xiàn)沼液氮磷脫除和獲得富含微生物的增值化菌肥的目標，旨在利用沼液本土微生物增殖進行氮磷養(yǎng)分回收工藝優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沼液取自湖北省武漢市江夏區(qū)中糧集團沼氣站。發(fā)酵原料為豬廠污水，35℃中溫發(fā)酵。取回后的沼液置于陰涼處15℃密閉儲存，待試驗時取用。試驗所用沼液的化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）為（1 147.3±25.7）mg/L，總氮（total nitrogen，TN）、銨氮、硝氮、亞硝氮、總磷（total phosphorus，TP）質(zhì) 量 濃 度 分 別為（787.08±20.50）、（542.5±13.6） 、（3.16±2.10） 、（0.25±0.02） 、（15.60±5.21）mg/L，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為（0.66±0.12）g/L。

1.2 試驗方案

葡萄糖是污水處理培菌常用碳源，為確定最佳葡萄糖添加量，向處理組的沼液中分別添加2、4、6、8和10 g/L的葡萄糖（國藥集團化學試劑有限公司），并設置不添加葡萄糖的0 g/L對照組。根據(jù)異養(yǎng)微生物將沼液中的所有無機氮轉(zhuǎn)化為微生物生物量時所消耗的有機碳量以確定試驗組中葡萄糖最高添加量為10 g/L[14]。在250 mL錐形瓶中加入50 mL沼液，添加不同葡萄糖量后在SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（金壇市晶玻實驗儀器廠）中28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)96 h，所有處理重復3次。分別在試驗開始時和24、48和72 h后收集5 mL的樣品待測。

1.3 分析方法

1）水質(zhì)檢測。沼液樣品于8 000 r/min下離心10 min，重復離心2次后取上清液進行水質(zhì)檢測。pH值采用METTLER TOLEDO FE28型pH計（上海梅特勒-托利多）測定；TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定；銨氮（NH4+-N）采用水楊酸鈉分光光度法測定；硝氮（NO3－-N）采用紫外分光光度法測定；亞硝氮（NO2－-N）采用N-（1-萘基）乙二胺分光光度法測定；TP采用鉬酸銨分光光度法測定；COD采用重鉻酸鉀氧化法通過CM-03型便攜式COD水質(zhì)測定儀（北京雙暉京承電子產(chǎn)品有限公司）測定，每個指標至少測試3次，結(jié)果取平均值。各水質(zhì)指標去除率η計算如公式（1）所示。

式（1）中η：污染物去除率，%；C0：處理前各水質(zhì)指標質(zhì)量濃度，mg/L；C1：處理后各水質(zhì)指標質(zhì)量濃度，mg/L。

2）本土微生物的生物量特征評價。根據(jù)微生物學中的標準定性測定微生物生長曲線的方法，通過測定處理后的培養(yǎng)液在600 nm波長處的吸光值（OD600）來指示菌體細胞密度，采用紫外分光光度計（日立UH5300）測定，并用初始沼液作為空白進行調(diào)零操作[15]；利用質(zhì)量法測量生物干質(zhì)量?？偟⒖偭撞捎昧蛩?雙氧水消解的方法測定。總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度采用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司）測定；微生物的形態(tài)特征，對沼液樣品通過0.1%甲基紫染色后用生物顯微鏡（100×10，上海重逢科學儀器BM2000）觀察。

3）數(shù)據(jù)分析處理。采用SPSS19.0、Excel 2016和Origin 2018進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖添加量對微生物生長的影響

沼液本土微生物在培養(yǎng)過程中OD600的變化情況如圖1A所示，所有試驗組OD600值均呈先升后降趨勢，其中第1天各試驗組葡萄糖含量充足，OD600值均上升到0.5左右，并在第2～3天達到最大值。之后隨著時間推移，微生物因沼液養(yǎng)分殘余量不足開始衰亡，OD600值均出現(xiàn)下降[16]。而對照組因缺乏有機碳的添加，導致沼液微生物未能得到有效繁殖，其OD600穩(wěn)定在0.2左右。

圖1 不同葡萄糖添加量下沼液OD600（A）和總蛋白質(zhì)量濃度（B）的變化Fig.1Changes of OD600（A）and total protein（B）in biogas slurry with different glucose additions

本土異養(yǎng)微生物可以直接從沼液中吸收銨氮產(chǎn)生細胞蛋白，蛋白質(zhì)是組成微生物的重要成分，總蛋白質(zhì)量濃度越大說明沼液本土微生物生長情況越好[17]，可通過沼液本土微生物總蛋白的質(zhì)量濃度側(cè)面表征微生物的生長情況。所有試驗組總蛋白質(zhì)量濃度都在第1～2天達到最大值，隨后下降（圖1B）。其中0～10 g/L處理組的總蛋白增長率在第1天時分別達到了 33.3%、71.7%、78.3%、145.8%、121.7%、132.3%，其中6 g/L處理組蛋白增值率（145.8%）為各組最高，總蛋白質(zhì)量濃度從初始的0.67 g/L增加到1.64 g/L。與OD600變化情況一致。

分別選取0、2、6和10 g/L處理組作為不添加、少量添加、適量添加和過量添加葡萄糖組，觀察沼液本土微生物OD600和總蛋白質(zhì)量濃度變化規(guī)律。對照組在第2天和第3天時微生物數(shù)量幾乎未發(fā)生變化，而2、6和10 g/L處理組則有明顯增長（圖2）。結(jié)合OD600和總蛋白質(zhì)量濃度變化趨勢及圖2可知，沼液本土微生物數(shù)量會隨葡萄糖添加量增加而顯著增加，但并不會隨葡萄糖添加量增加而無限增殖，當達到環(huán)境飽和值以后，活細菌數(shù)會保持相對穩(wěn)定、總細菌數(shù)達到最高水平。

圖2 顯微鏡下的沼液本土微生物Fig.2 Indigenous microorganisms in biogas slurry under microscope

2.2 葡萄糖添加量對沼液本土微生物富集過程中氮遷移轉(zhuǎn)化的影響

沼液處理過程中總氮和銨氮的質(zhì)量濃度變化如圖3A、B所示。處理過程中總氮和銨氮質(zhì)量濃度都呈下降趨勢，第1天時0～10 g/L處理組總氮質(zhì)量濃度從781.1 mg/L下降至483.5～563.8 mg/L，銨氮質(zhì)量濃度從542.5 mg/L下降至430.5～471.1 mg/L?？偟弯@氮的去除在不同處理組間區(qū)別不大，此時沼液本土微生物還未大量繁殖（圖1A），沼液總氮和銨氮質(zhì)量濃度下降主要是因為在振蕩過程中破壞了沼液的氣液平衡使得溶解在沼液中的NH4+-N轉(zhuǎn)化為氨氣逸出體系導致。而第2～3天時，微生物吸收沼液中的氮作為養(yǎng)分進行繁殖，葡萄糖添加量越多，總氮和銨氮質(zhì)量濃度下降的越多，其中10 g/L處理組在第3天時總氮與銨氮去除率分別為76.8%和70.2%，總氮從787.08 mg/L下降至182.29 mg/L，銨氮從542.5 mg/L下降至161.45 mg/L，表明沼液本土微生物繁殖越多，沼液中總氮和銨氮去除率越大[12]。

圖3 不同葡萄糖添加量處理下沼液TN（A）、NH4+-N（B）、NO3--N（C）、NO2--N（D）質(zhì)量濃度的變化Fig.3 Changes of TN（A），NH4+-N（B），NO3--N（C），NO2--N（D）concentrations in biogas slurry under different glucose addition treatments

各試驗組硝態(tài)氮濃度都呈先降后升趨勢（圖3C），而對照組則為持續(xù)下降，其中10 g/L處理組在第3天時有最大的硝態(tài)氮去除率，最大去除率為93.7%。硝態(tài)氮質(zhì)量濃度在1～3 d下降可能因沼液微生物進行硝酸鹽呼吸作用將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和氮氣等導致[18]，第4天所有試驗組硝態(tài)氮質(zhì)量濃度緩慢上升，因此時微生物死亡將體內(nèi)的硝酸鹽釋放到沼液中使得硝態(tài)氮質(zhì)量濃度增加。亞硝態(tài)氮濃度在所有處理組都處于上升趨勢，其中對照組增幅最大，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度從初始的0.25 mg/L上升到1.91 mg/L（圖3D）。4～10 g/L處理組中亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的增加速率遠低于對照組和2 g/L處理組，可能是沼液本土微生物將沼液中部分亞硝酸鹽降解利用導致[19]。

2.3 葡萄糖添加量對沼液TP、COD及pH值的影響

沼液本土微生物能對磷有效回收利用（圖4A），磷在微生物增殖時會被大量利用，在細胞的能量轉(zhuǎn)移、DNA和RNA合成以及多聚磷的積累過程中起著不可忽視的作用，沼液總磷去除大部分來自沼液中懸浮微生物增殖生長后的沉降作用[20]，2和4 g/L處理組在試驗第2天達到最大總磷去除率，分別為58.2%和77.3%。且沼液總磷質(zhì)量濃度在第2天后增加，可能因后續(xù)沼液殘余碳源不足，沼液本土微生物群落衰亡，將磷釋放到沼液中導致。而6、8和10 g/L處理組總磷質(zhì)量濃度呈下降趨勢，其總磷最大去除率均在第4天，分別為84.03%、79.7%和87.7%，此時TP質(zhì)量濃度分別為2.41、3.04、1.85 mg/L。

圖4 不同葡萄糖添加量處理對沼液TP（A）、COD（B）及pH（C）的影響Fig.4 Effect of different glucose addition on TP（A），COD（B）and pH（C）of biogas slurry

COD去除率是確定沼液最佳處理條件的關(guān)鍵指標之一。對照組沼液初始COD為1 147.3 mg/L，沼液的初始COD濃度因葡萄糖的添加量不同而呈現(xiàn)梯度差異，隨后除了對照組以外，各試驗組中COD都得到了較好的去除（圖4B）。第1天時沼液本土微生物處于適應期，繁殖速率較慢，COD去除量較少，2～10 g/L處理組對COD去除率為9.6%～19.2%。第2天沼液本土微生物消耗大量葡萄糖進行增殖，2～10 g/L各組COD去除率分別達到了65.2%～83.9%，最佳COD去除效率優(yōu)于Qin等[21]的添加有機碳后沼液COD去除率（72%）。第3天各試驗組的沼液COD變化較小，甚至在第4天時因為沼液中剩余有機碳的量不足，微生物死亡細胞破裂導致4～8 g/L處理組的COD略有上升。因此，在利用本土微生物增殖進行沼液氮磷回收需注意處理時間，處理時間太短導致微生物來不及利用COD，時間太長反而導致COD的增加。

各組pH值變化趨勢較為一致（圖4C）。沼液初始pH值為8.26，第1天時pH值從8.2升至9.4左右，在繼續(xù)培養(yǎng)過程中，4～10 g/L處理組的pH值在第2天下降顯著，葡萄糖添加量越多則pH值下降越明顯。第1天沼液pH上升是因為在振蕩培養(yǎng)作用下沼液中溶解的CO2溢出導致，作用機制與氨吹脫類似[22]。但第2天微生物快速繁殖，沼液中葡萄糖通過糖酵解過程轉(zhuǎn)化為丙酮酸，導致pH值下降。隨著丙酮酸逐漸地被微生物利用，所有試驗組pH值在第4天逐漸穩(wěn)定，此時對照組的pH最高為9.35，10 g/L的pH最低為8.98。

2.4 工藝過程養(yǎng)分質(zhì)量平衡及工藝經(jīng)濟效益分析

綜合考慮沼液本土微生物生長情況及處理水質(zhì)情況，從節(jié)約成本的角度考慮選用6 g/L葡萄糖添加量，微生物培養(yǎng)時間為2 d，進行工藝過程養(yǎng)分質(zhì)量平衡及工藝經(jīng)濟效益分析。

1）工藝過程養(yǎng)分質(zhì)量平衡分析。以1 t沼液為基準，添加6 kg葡萄糖處理沼液2 d后，沼液本土微生物富集過程中的氮磷質(zhì)量平衡分析如圖5所示。沼液初始生物干質(zhì)量為1.67 kg，總蛋白0.66 kg，微生物培養(yǎng)增殖后生物干質(zhì)量為4.11 kg，其中富含總蛋白1.38 kg。因此計算可得，1 t沼液處理后本土微生物的生物干質(zhì)量從1.67 kg增加到了4.11 kg，增加了146.1%，總蛋白質(zhì)從0.66 kg增加到了1.38 kg，增加了109.1%。

圖5 沼液本土微生物富集氮磷質(zhì)量平衡分析Fig.5 Mass balance analysis of N and P enrichment by indigenous microorganisms in biogas slurry

在該工藝下沼液總氮下降了520.30 g，去除率為66.1%，本土微生物利用了其中150.76 g總氮，回收率達到29.0%。在其他沼液本土微生物培養(yǎng)研究中，沼液總氮去除率為78%，高于本工藝，但對總氮的回收率低于本工藝，僅為19%[12]。沼液總氮出現(xiàn)這種高去除率、低回收率的原因可能是培養(yǎng)的沼液本土微生物來不及利用總氮，大部分氮就以氨氣的形式揮發(fā)到空氣中[23]。因此，后續(xù)可考慮將本工藝和回收揮發(fā)性氨氣進行耦合，在提高氮回收率的同時降低總運行成本。

有研究利用絮凝劑來處理沼液時總磷去除率達57.0%，低于本工藝77.5%的總磷去除率，說明本工藝對總磷的去除效果優(yōu)于部分絮凝劑對總磷的去除[24]。但本工藝沼液微生物對總磷回收率僅為59.7%，低于總磷去除率，出現(xiàn)差異原因可能是在對細胞沉淀沖洗時，部分富含磷的胞外聚合物被沖洗掉，導致產(chǎn)生測量誤差，使得總磷回收率低于去除率。

2）工藝經(jīng)濟效益分析。本工藝成本來自物料、能耗兩個方面。物料成本主要來源于碳源，能耗包括加熱等運行費用。收益方面主要來源于富集本土微生物制成的生物菌肥，以及因沼液氮磷去除而節(jié)省的后端深度處理費用，此處僅以生物菌肥效益計入。在能耗方面，一般沼氣工程中溫發(fā)酵產(chǎn)生的沼液溫度為35℃，而本工藝28℃即可運行，因此只需將待處理沼液降溫后在保溫狀態(tài)下運行，無需額外加熱費用。物料成本方面采用98%的工業(yè)級葡萄糖（400元/t）為碳源，1 t沼液需添加約6.20 kg工業(yè)級葡萄糖，需花費2.48元。生物菌肥價格按1 300元/t計，本工藝中1 t沼液可生產(chǎn)4.11 kg生物干質(zhì)量，因此菌肥收益約為5.34元/t。該工藝可用于沼液深度處理的前端預處理手段，為實際工程提供參考。

3 討論

規(guī)?；B(yǎng)殖場的沼氣工程中常因沼液無法就近消納導致環(huán)境氮磷污染問題，使得沼液氮磷養(yǎng)分回收技術(shù)受到更多關(guān)注。本研究對低碳氮比（C/N）沼液采用葡萄糖添加進行沼液本土微生物富集培養(yǎng)，實現(xiàn)了沼液廢水處理和養(yǎng)分回收增值化利用。

本研究同一培養(yǎng)時間段葡萄糖添加量越多的試驗組其OD600越大，但8 g/L和10 g/L處理組相對于6 g/L的增幅較小，可見，當葡萄糖添加量達到6 g/L后繼續(xù)增加添加量對微生物增殖促進較小，在6 g/L添加量時，反映微生物增殖的OD600值在第2天達到最大值1.5。不同于OD600的是，總蛋白質(zhì)量濃度的最大值出現(xiàn)要比OD600早1 d左右，可能是因為沼液本土微生物在最開始時不會立即進行繁殖，需經(jīng)一段時間自身調(diào)整，誘導合成必要的酶、輔酶或合成某些中間代謝產(chǎn)物，此時細胞質(zhì)量增加，體積增大，但不分裂繁殖，導致其總蛋白質(zhì)量濃度很高而OD600值變化不大，之后微生物會消耗部分蛋白質(zhì)來進行生長繁殖等代謝活動。而對照組的總蛋白含量的變化幅度均較小，說明沼液本土微生物在無外加有機碳的情況下生長受限。從經(jīng)濟性考慮，當葡萄糖添加量為6 g/L，培養(yǎng)時間控制在2 d時即可達到沼液本土微生物的最佳生長繁殖效果。

在進一步對培養(yǎng)過程中的沼液水質(zhì)進行測量時發(fā)現(xiàn)，葡萄糖添加量為6 g/L的試驗組對于沼液氮磷元素的去除效果在各試驗組中也是最優(yōu)的，相較于0、2和4 g/L葡萄糖添加量組，6 g/L葡萄糖添加量組對沼液中N、P及COD去除率更高，而8和10 g/L這種高葡萄糖添加量組對污染物的去除效果與6 g/L葡萄糖添加量組也相差不大。在處理2 d的條件下，6 g/L葡萄糖添加量組對沼液TN與TP去除率分別達到了66.1%和77.5%，其中去除總氮量的29.0%和去除總磷量的59.7%被沼液本土微生物利用，生物質(zhì)量濃度從初始的1.67 g/L上升至4.11 g/L，增加了2.44 g/L，總蛋白質(zhì)量濃度從初始的0.66 g/L上升至1.38 g/L，增加了0.72 g/L。通過簡單的經(jīng)濟性分析后可知，該工藝處理沼液所需物料成本為2.48元/t，并在處理后可獲得約5.34元/t的菌肥收益，具有很好的應用潛力。