單亞靜，吳坤坦，高健瑋，楊旭晨，鄭嶸

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070

高溫處理可以減少動(dòng)物尸體中存在的病原菌[1]，但將高溫處理后的動(dòng)物尸體直接施用于農(nóng)田，將造成“二次發(fā)酵”，導(dǎo)致燒苗現(xiàn)象[2]，因此需對(duì)高溫處理后的尸體進(jìn)行發(fā)酵腐熟的堆肥處理。但堆肥過(guò)程中的高溫、高pH促使NH3逸出、厭氧條件下反硝化作用引起的N2O和N2彌散以及水溶性含氮成分的滲濾均造成了氮素?fù)p失[3]。在豬尸體堆肥中加入氨轉(zhuǎn)化細(xì)菌、亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化菌和固氮菌可以加速氮的積累，減少氮素的損失[4]。而具有纖維素降解性和固氮性的菌劑可以促進(jìn)木質(zhì)纖維素的降解，提高堆肥效果[5]。如孫元烽等[6]篩選到的細(xì)菌能有效強(qiáng)化菌劑的纖維素降解能力，并一定程度上提高堆肥中的總養(yǎng)分；武肖莎等[7]篩選得到枯草芽孢桿菌應(yīng)用于牛糞-秸稈的堆肥中，發(fā)現(xiàn)菌劑組能有效提高堆肥效率。目前關(guān)于纖維素分解菌的研究大多是應(yīng)用在畜禽糞便、秸稈和生活有機(jī)廢棄物上，而用于畜禽尸體的研究相對(duì)較少[8]。課題組前期從豬尸體和秸稈堆肥樣品中篩選到1株能在80℃下生存的纖維素降解菌株，鑒定為熱葡糖苷酶地芽孢桿菌（Parageobacillus thermoglucosidasiusBGSC 95A1）[9]。該菌降解纖維素的能力很強(qiáng)，但其應(yīng)用于堆肥中對(duì)堆肥效率的影響尚不清楚。檢測(cè)堆肥中氮元素相關(guān)的物質(zhì)（銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和總氮）和氮素轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)[10-11]的變化能反映不同堆肥時(shí)期氮素轉(zhuǎn)化作用的變化。因此，本試驗(yàn)將熱葡糖苷酶地芽孢桿菌加入到高溫處理后的動(dòng)物尸體中與秸稈混合進(jìn)行堆肥，檢測(cè)氮元素相關(guān)物質(zhì)和氮素轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)的變化，探究菌劑影響動(dòng)物尸體堆肥氮素?fù)p失的途徑，以期為未來(lái)在堆肥中添加纖維素降解菌等微生物來(lái)促進(jìn)堆肥過(guò)程和減少氮素?fù)p失提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1）菌株的來(lái)源。試驗(yàn)菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期獲得的熱葡糖苷酶地芽孢桿菌（P.thermoglucosi-dasiusBGSC 95A1）[9]。該菌株可在 80 ℃下生存且產(chǎn)酶的最適溫度為65℃，其纖維素酶活性高達(dá)94.00 U/mL。根據(jù)菌株生長(zhǎng)的最適條件，將P.thermoglucosidasius培養(yǎng)約1周，至分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌液吸光度值為1.2左右時(shí)，作為最終的高溫纖維素菌劑備用。

2）堆肥處理。將雞和鴨的尸體（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)雞場(chǎng)提供）在焚燒爐內(nèi)進(jìn)行高溫處理后再開(kāi)展堆肥試驗(yàn)。堆肥在規(guī)格為138 L的泡沫箱中進(jìn)行，堆肥方式為好氧靜態(tài)通風(fēng)堆，均采用60 L/（m3·min）的通風(fēng)處理。將高溫處理后的動(dòng)物尸體分為2組，分別是不添加菌劑的對(duì)照組和菌劑組（根據(jù)每個(gè)堆體的總質(zhì)量添加1%高溫纖維素菌劑），每組3個(gè)重復(fù)。動(dòng)物尸體在高溫焚燒爐進(jìn)行高溫處理（160℃處理12 h）后，將動(dòng)物尸體與秸稈進(jìn)行混合，利用秸稈和竹粉調(diào)節(jié)碳氮比為30∶1，初始含水率為60%左右，堆肥時(shí)間為28 d。采用五點(diǎn)采樣法采集尸體與秸稈的混合物作為分析樣品，混勻后將樣品分為2份，一份保存于4℃冰箱，用于測(cè)定堆肥過(guò)程中的理化參數(shù)，包括溫度、pH、含水率、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、總碳和總氮。另一份保存于-80℃冰箱，用于測(cè)定樣本中氮素轉(zhuǎn)化功能基因的拷貝數(shù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1）溫度、pH和含水率的測(cè)定。記錄環(huán)境溫度并用長(zhǎng)柄電子溫度計(jì)按照時(shí)間間隔，測(cè)定堆體中心不同區(qū)域的溫度，取其平均值。堆肥樣品的pH用精密pH計(jì)（PHS-3C，上海宇隆儀器有限公司）測(cè)定。在烘箱中105℃烘干樣品至恒質(zhì)量，通過(guò)前后質(zhì)量的變化計(jì)算含水率。

2）銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量的測(cè)定。用2 mol/L氯化鉀對(duì)堆肥樣品進(jìn)行前處理，過(guò)濾后用靛酚藍(lán)分光光度法檢測(cè)銨態(tài)氮含量。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和紫外分光光度計(jì)（721，上海第三分析儀器廠）測(cè)定吸光度，計(jì)算硝態(tài)氮濃度。用鹽酸萘乙二胺分光光度法測(cè)定亞硝態(tài)氮濃度。

3）總氮和總碳含量的測(cè)定。將堆肥樣品在烘箱中80℃烘干24 h后，過(guò)篩孔徑為0.15 mm的標(biāo)準(zhǔn)篩，用分析天平稱取約4.0～4.5 mg的樣品。采用錫盒將樣品包裹成圓球狀，然后用同位素質(zhì)譜分析儀（Isoprime100，德國(guó)元素分析系統(tǒng)公司）進(jìn)行總碳和總氮含量的測(cè)定。

4）DNA的提取與熒光定量PCR檢測(cè)。為了減少外源DNA和酸性物質(zhì)所造成的污染，首先對(duì)堆肥樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚?。先加入脫腐緩沖液（100 mmol/L Tris，100 mmol/L Na4P2O7，100 mmol/L Na2EDTA，1.0%PVP，100 mmol/L NaCl，0.05%Triton X-100，pH=10.0），渦旋混勻并12 000 r/min離心，后續(xù)加入氯化鈣溶液（0.5 mol/L）和草酸鈉（0.05 mol/L）繼續(xù)前處理。用改進(jìn)的蛋白酶KCTAB法粗提取堆肥樣品中的總DNA，然后檢測(cè)總DNA的濃度和質(zhì)量。基因的引物設(shè)計(jì)如表1所示，引物合成在武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火15 s（16S rDNA為53℃退火45 s），72℃延伸20 s（16S rDNA為72℃退火90 s），35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸10 min。純化回收得到的PCR產(chǎn)物按初始濃度的10-1至10-10共11個(gè)濃度并根據(jù)不同濃度所對(duì)應(yīng)的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算樣品中相應(yīng)基因的拷貝數(shù)。熒光定量PCR所需的引物參考文獻(xiàn)[12]來(lái)設(shè)計(jì)（表1），反應(yīng)條件同PCR條件。最后根據(jù)定量數(shù)據(jù)中標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算實(shí)際樣品中的基因拷貝數(shù)。每個(gè)基因均做5個(gè)技術(shù)重復(fù)。將基因的原始拷貝數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，利用Canoco 4.5軟件和SPSS 21.0軟件對(duì)各個(gè)理化參數(shù)與氨單加氧酶基因（ammonia monooxygenase，amoA）、硝酸鹽還原酶基因（nitrate reductase subunit alpha，narG）、亞硝酸鹽還原酶基因（copper-containing nitrite reductase，nirS和nirK）和氧化亞氮還原酶基因（nitrous oxide reductase，nosZ）的拷貝數(shù)分別進(jìn)行相關(guān)性分析，確定理化參數(shù)與基因數(shù)量之間的線性相關(guān)性。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Sequence of different primers used in this experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度、總碳和總氮的變化

堆肥過(guò)程中環(huán)境溫度在20℃以下，雖然堆肥環(huán)境溫度較低，但堆體溫度最高值均達(dá)到60℃以上。菌劑組在第8～10天達(dá)到最高值，均值為62.6℃。對(duì)照組在第10天溫度達(dá)到最高，均值為49.0℃（圖1A）。由此可以看出，菌劑組溫度上升較快，且溫度較高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，堆肥效果較好。在第10天之后2組的溫度都出現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì)，且第11天環(huán)境溫度突然降低到10℃以下，堆肥溫度也迅速下降。由于經(jīng)過(guò)高溫處理的動(dòng)物尸體較大部分蛋白質(zhì)等被高溫變性，容易被微生物分解利用，因此堆肥時(shí)間較短，堆肥進(jìn)程較快。

圖1 堆肥過(guò)程中溫度（A）、總氮（B）和總碳（C）的變化Fig.1 Changes in temperature（A），total nitrogen（B）and total carbon（C）during composting

菌劑組的總氮的變化趨勢(shì)為“升高→降低→升高→降低”，在第5天達(dá)到最高值5.8%。堆肥結(jié)束，總氮含量為4.5%。對(duì)照組總氮的變化趨勢(shì)為先增高后降低，在第8天總氮含量達(dá)到最高值6.3%，最終總氮含量為5.5%（圖1B）。而堆肥過(guò)程中總碳含量的變化呈現(xiàn)多次波動(dòng)，最終對(duì)照組和菌劑組的總碳含量分別為47.5%和47.2%（圖1C）。菌劑組堆肥溫度高且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，總碳利用率為0.6%，但總氮含量比對(duì)照組降低了0.8%。說(shuō)明微生物菌劑的添加可以提高堆肥效果，但氮素?fù)p失也會(huì)略微增加。

2.2 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量的變化

由圖2A可見(jiàn)，堆肥過(guò)程中銨態(tài)氮的變化整體呈現(xiàn)“升高→降低→升高”的趨勢(shì)。在堆肥第5天之后銨態(tài)氮含量逐漸上升，第8天達(dá)到最高值，菌劑組為7.8 mg/L，對(duì)照組為6.0 mg/L。第8～10天為高溫期，較高的溫度造成NH3大量排放，氮素?fù)p失較多，銨態(tài)氮含量逐漸降低。直至第15天降到最低值，菌劑組為3.0 mg/L，對(duì)照組為2.0 mg/L，2組差異顯著（P＜0.05）。堆肥后期堆肥溫度逐漸降低，NH3的排放減少，銨態(tài)氮含量逐漸升高。堆肥結(jié)束時(shí)菌劑組銨態(tài)氮為5.4 mg/L，對(duì)照組為3.6 mg/L。表明高溫纖維素菌促進(jìn)了堆肥過(guò)程的氨化作用，有利于銨態(tài)氮的積累。

圖2 堆肥過(guò)程中銨態(tài)氮（A）、亞硝態(tài)氮（B）和硝態(tài)氮（C）的變化Fig.2 Changes in ammonium（A），nitrite（B），nitrate（C）nitrogen during composting

由圖2B可見(jiàn)，亞硝態(tài)氮的整體變化趨勢(shì)是先升高后降低，菌劑組在第10天之前一直處于增加狀態(tài)，在第10天達(dá)到最高值1.9 mg/L，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），之后隨著NO和NO2的排放，亞硝態(tài)氮含量逐漸降低。對(duì)照組亞硝態(tài)氮含量在第5天達(dá)到最高值1.1 mg/L，在第8天之后開(kāi)始逐漸下降。至堆肥結(jié)束，菌劑組的亞硝態(tài)氮含量為0.8 mg/L，對(duì)照組為0.4 mg/L，菌劑組亞硝態(tài)氮含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。這可能是因?yàn)榫鷦┙M中的高溫纖維素菌在繁殖過(guò)程中造成氧氣減少，使得菌劑組的反硝化作用強(qiáng)于對(duì)照組。

由圖2C可見(jiàn)，硝態(tài)氮含量初期較高，菌劑組和對(duì)照組硝態(tài)氮含量分別為140.6 mg/L和156.3 mg/L。堆肥第5天硝態(tài)氮含量小幅度上升可能的原因是堆肥初期溫度適合硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，造成硝態(tài)氮含量的升高。第5天之后由于溫度升高不利于硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，硝化作用減弱，且高溫造成氮素的大量損失，硝態(tài)氮含量持續(xù)降低直至堆肥結(jié)束。最終菌劑組和對(duì)照組的硝態(tài)氮含量分別為64.9、81.5 mg/L，菌劑組與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05），硝態(tài)氮降低幅度分別為53.8%和47.9%。

2.3 氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵基因拷貝數(shù)的變化

與氮素相關(guān)功能基因拷貝數(shù)的變化可以反映堆肥過(guò)程中氮素轉(zhuǎn)化作用的強(qiáng)弱，與硝化/反硝化作用相關(guān)的同一基因中拷貝數(shù)越高，表明硝化/反硝化作用越強(qiáng)。如圖3所示，氨氧化反應(yīng)相關(guān)的amoA基因在菌劑組和對(duì)照組中的基因拷貝數(shù)分別在堆肥第1天和第8天達(dá)到最高值，菌劑組的基因拷貝數(shù)是對(duì)照組的41.1%。amoA的基因拷貝數(shù)變化說(shuō)明氨氧化反應(yīng)（硝化作用）主要發(fā)生在堆肥前期和中期，而堆肥后期氨氧化反應(yīng)較弱。對(duì)照組的narG基因拷貝數(shù)要高于菌劑組。對(duì)照組在第8天達(dá)到最高值，極顯著高于菌劑組（P＜0.01）。菌劑組在第15天達(dá)到最高值，與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。nirK基因和nirS基因的拷貝數(shù)整體變化趨勢(shì)為先升高后降低。菌劑組的nirK和nirS的基因拷貝數(shù)分別在在第8天和第1天達(dá)到最高值，極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。對(duì)照組在第5天nirK的基因拷貝數(shù)達(dá)到最高值，豐度顯著高于菌劑組（P＜0.05）。第8天nosZ的基因拷貝數(shù)達(dá)到最高值，菌劑組低于對(duì)照組。第28天對(duì)照組nosZ基因拷貝數(shù)顯著高于菌劑組（P＜0.05）。整個(gè)堆肥進(jìn)程中對(duì)照組的nosZ基因拷貝數(shù)要整體要高于菌劑組。與亞硝酸鹽還原反應(yīng)相關(guān)基因（narG、nirK、nirS和nosZ）的拷貝數(shù)變化，說(shuō)明菌劑組降低和延緩了反硝化過(guò)程。

圖3 堆肥過(guò)程中amoA（A）、narG（B）、nirK（C）、nirS（D）和nosZ（E）基因拷貝數(shù)的變化Fig.3 Changes in amoA（A），narG（B），nirK（C），nirS（D）and nosZ（E）gene copy numbers during composting

2.4 理化性質(zhì)與氮素相關(guān)功能基因相關(guān)性分析

分別對(duì)菌劑組和對(duì)照組的高溫處理尸體堆肥的理化性質(zhì)和氮素相關(guān)功能基因之間的相關(guān)性進(jìn)行RDA分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4中射線夾角的余弦值代表相關(guān)性的大小，余弦值越大，相關(guān)性越大。菌劑組的第1排序軸、第2排序軸的特征值分別為0.697、0.086；對(duì)照組的第1排序軸、第2排序軸的特征值分別為0.467、0.018。

圖4 理化性質(zhì)與氮素相關(guān)功能基因相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between physical and chemical properties and nitrogen-related functional genes

對(duì)圖4分析發(fā)現(xiàn)，添加菌劑后amoA基因拷貝數(shù)與NO3-含量相關(guān)性增加，說(shuō)明添加菌劑使堆肥的氨氧化作用增強(qiáng)；narG基因與NO2-含量在菌劑組呈正相關(guān)，在對(duì)照組則呈負(fù)相關(guān)，表明添加菌劑使堆肥的反硝化作用增強(qiáng)；nirK基因和NH4+在菌劑組和對(duì)照組均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），但菌劑組的相關(guān)性大于對(duì)照組，表明菌劑組的氨氧化-反硝化作用更強(qiáng)；nirS基因在菌劑組中與NO2-含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），在對(duì)照組中則呈正相關(guān)，表明菌劑組中NO2-還原為NO和NO2作用更強(qiáng)。

3 討論

在好氧堆肥中加入纖維素降解菌，能夠促進(jìn)纖維素的轉(zhuǎn)化，縮短堆肥進(jìn)程，提高堆肥效率[13]。本研究在動(dòng)物尸體中添加耐高溫纖維素降解菌，堆肥溫度達(dá)63.5℃且加速了尸體和秸稈的降解，表明微生物菌劑能夠有效提高堆肥溫度，促進(jìn)堆肥快速腐熟。黃穎婕等[14]的堆肥最高溫度比本研究中的耐高溫纖維素菌高，高溫期也更維持，但纖維素酶活低于本研究中的菌株。結(jié)果不一致的原因可能是黃穎婕等[14]研究中使用的是牛糞，本研究使用的則是動(dòng)物尸體，在纖維素含量和微生物的種類與豐度上存在差異。有研究在豬尸體堆肥過(guò)程中添加復(fù)合微生物菌劑，菌劑組促進(jìn)了尸體降解并改變了其中菌落結(jié)構(gòu)和多樣性[13]。

通過(guò)參與硝化作用的amoA基因，以及參與反硝化作用的narG、nirK、nirS和nosZ基因拷貝數(shù)的變化可以評(píng)價(jià)堆肥過(guò)程中氮素轉(zhuǎn)化作用的強(qiáng)度[14]。Guo等[15]發(fā)現(xiàn)在好氧堆肥過(guò)程中amoA基因表達(dá)豐度與NO3-含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。本研究中耐高溫纖維素菌提高了amoA在堆肥高溫期的表達(dá)豐度，表明其能通過(guò)上調(diào)amoA基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)氨氧化作用，進(jìn)而將更多的NH4+轉(zhuǎn)化為NO3-，最終減少NH3排放。含氮?dú)怏w的排放多少與反硝化作用的強(qiáng)弱有關(guān)。nirK基因編碼的酶在NO的排放起主導(dǎo)作用[16]，而narG[17]，nirS和nosZ[18]濃度與N2的排放顯著相關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)耐高溫纖維素降解菌在堆肥前期主要是降低了nirK拷貝數(shù)，在堆肥中期降低了narG拷貝數(shù)。雖然降低和延緩反硝化過(guò)程，但由于在堆肥前期nirS的拷貝數(shù)增加促進(jìn)了反硝化作用，使氮素?fù)p失加強(qiáng)。本研究中菌劑組的總氮含量比對(duì)照組降低了0.8%，這些結(jié)果與敖冬玲[8]在豬尸體堆肥和胡春曉[20]在農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥過(guò)程中反硝化作用和氮素?fù)p失增加的結(jié)果一致。因此，添加耐高溫纖維素降解菌能加快堆肥腐熟，改變氮素循環(huán)，但也會(huì)因促進(jìn)了反硝化作用而造成氮素?fù)p失的增加。因此篩選效率高、造成氮素?fù)p失低的復(fù)合微生物菌劑是未來(lái)畜禽廢棄物堆肥的發(fā)展方向之一。