張盼偉，郎 杭，丁相毅，趙曉輝，李 昆，萬曉紅，李 爭

(中國水利水電科學(xué)研究院，北京 100038)

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)為七肽單環(huán)肝臟毒素，由于其分子結(jié)構(gòu)存在著環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，所以MCs具有非常高的穩(wěn)定性[1]，在發(fā)生水華的自然水體中能保持幾天不降解[2]；同時還具有較高的水溶性和耐熱性，易溶于甲醇、可溶于水，即使加熱到100℃其結(jié)構(gòu)也不會被破壞。隨著檢測儀器及分析技術(shù)不斷進步，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的MCs異構(gòu)體近百種[3-4]，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的MCs異構(gòu)體中，最常見且已商業(yè)化提取的有MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF、MC-LW、MC-WR、MC-LA、MC-LY，其中L、R、Y、F、W分別代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸[5-6]。20世紀(jì)90年代后期，中國淡水水體富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重，范圍不斷擴大，在大型湖泊、水庫、河流水華暴發(fā)時，藍(lán)藻中的MCs在其凋亡后會大量釋放，使水環(huán)境中藻毒素達到較高濃度水平，有可能造成潛在的生態(tài)風(fēng)險[7]，根據(jù)相關(guān)研究報道，淡水中MCs含量通常為0.1～1.0 μg/L，但是當(dāng)藍(lán)藻水華暴發(fā)后，凋亡后的藍(lán)藻大量腐敗消解會產(chǎn)生大量的MCs，其含量最大可達80～90 μg/L[8]，遠(yuǎn)超GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的MC-LR的標(biāo)準(zhǔn)限值(1.0 μg/L)。

目前檢測水中微囊藻毒素的主要技術(shù)方法有生物法[7]、分子技術(shù)法[10]和儀器分析法[11-13]等，其中尤以儀器分析方法較為常用。常用的儀器分析方法有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中高效液相色譜法采用保留時間定性、峰面積定量，其容易受到樣品基質(zhì)干擾，進而影響化合物的定性與定量的準(zhǔn)確性；而質(zhì)譜通常是通過離子定性與定量，準(zhǔn)確度相較于液相色譜具有非常大的提高，抗干擾能力強；其中使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的儀器分析法在MCs檢測中使用最廣，該技術(shù)具有靈敏度高和選擇性好的優(yōu)勢，對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品具有很好的篩選性能，且串聯(lián)質(zhì)譜比單級質(zhì)譜的檢測靈敏度更高[14-16]。研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)對水中8種MCs進行檢測分析，選取母離子及子離子組成離子對進行定性、定量分析。本方法相較于已經(jīng)報道的高效液相色譜法與質(zhì)譜法[6,12,17-19]，具有檢測MCs種類多、樣品前處理簡單、準(zhǔn)確度高和精密度好的優(yōu)點，且極大降低了檢出限和定量限，檢出限相較于中國MCs相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)低20～30倍；該方法能夠在10 min內(nèi)對8種微囊藻毒素進行準(zhǔn)確快速檢測，可為相關(guān)主管部門快速判別水體中痕量微囊藻毒素的污染狀況、主要優(yōu)勢異構(gòu)體的判別提供方法保障，還可為中國湖庫型水源地藍(lán)藻“暴發(fā)”期的快速監(jiān)測與預(yù)警提供技術(shù)支持。

1 試驗部分

1.1 試劑與材料

8種MCs樣品分別為MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LF、MC-LW、MC-WR、MC-LA、MC-LY(均購自Dr.Ehrenstorfer公司，德國)。試驗中所用甲醇、乙腈均為色譜純(J.T.Baker，Phillispsburg，美國)；甲酸(色譜純，Dikma 公司)；試驗用水均為純水(經(jīng)MilliQ系統(tǒng)純化，電阻率為18.3 MΩ·cm)；玻璃纖維濾膜(47 mm×0.45 μm，Whatman 公司，英國)；針式濾膜(13 mm×0.22 μm，CNW公司，德國)；HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg，Waters公司，美國)，C18固相萃取柱(6 mL/500 mg，Waters公司，美國)；氮氣(純度大于等于99.999%)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290型超高效液相色譜儀，配有Agilent 6460質(zhì)譜檢測器(ESI源)；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)濃縮儀，德國；N-EVAP-12型氮吹儀，美國；固相萃取儀，Waters公司，美國。

1.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18 RRHD(2.1×100 mm，1.8 μm)；柱溫40℃；自動進樣，進樣量為10 μL；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)；梯度洗脫程序：0～2 min、30% B，2～7 min、30%～60% B，7～10 min、60%～30% B。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple Response Monitoring，MRM)，霧化器壓力為310 kPa(45 psi)，毛細(xì)管電壓3 500 V，干燥器溫度325℃，氮氣流速為11 L/min。母離子、子離子及相關(guān)參數(shù)見表1。

1.5 樣品前處理

將固相萃取柱連接在固相萃取裝置上，依次使用10 mL甲醇、10 mL純水進行活化。準(zhǔn)確量取500 mL水樣品，使用0.45 μm玻璃纖維濾膜對量取的水樣進行過濾，將過濾后的水樣使用已活化好的固相萃取柱進行富集，樣品流速控制在8～10 mL/min。富集完成后，用10 mL 20%的甲醇溶液淋洗，每次5 mL，棄去淋洗液。用緩和氮氣吹掃固相萃取柱，以去除殘留在固相萃取柱中的水分，再用10 mL甲醇溶液洗脫固相萃取柱，每次5 mL，收集洗脫液至K-D濃縮瓶中，將洗脫液在氮吹儀上用緩和氮氣濃縮至近干，用30%甲醇水溶液定容至1 mL，混勻后用0.22 μm濾膜過濾，過濾液置于2 mL棕色進樣瓶中，待測。

表1 8種MCs母離子、子離子及相關(guān)參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

使用自動進樣器直接進樣，對碎裂電壓及碰撞能量等因素進行優(yōu)化，確定8種MCs質(zhì)譜圖中響應(yīng)最高的離子作為母離子。8種MCs中，MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-WR結(jié)構(gòu)中均有精氨酸，每個精氨酸中均有1個胍基。胍基容易帶1個正電荷，進而決定了整個分子電離后容易形成[M+H]+母離子；但是MC-RR與其他幾種不同，其每個分子中具有2個精氨酸，每個精氨酸均帶1個正電荷，因此其分子的母離子為[M+2H]2+(m/z為519.8)。MC-LA、MC-LY、MC-LF及MC-LW分子中沒有精氨酸，其母離子在Adda基團的甲氧基上帶一個正電荷，形成[M+H]+。所有MCs都具有Adda結(jié)構(gòu)，它與各種藻毒素毒性關(guān)系密切。在試驗中發(fā)現(xiàn)，8種MCs母離子裂解的子離子中均有較強的m/z 135的碎片峰，它是由Adda基團甲氧基發(fā)生α裂解產(chǎn)生的。m/z 213附近的碎片峰也與Adda的α裂解有關(guān)，研究中出現(xiàn)的次數(shù)也較高。MC-LA子離子m/z 776為母離子丟掉甲基-苯乙基醚的產(chǎn)物，MC-LY子離子m/z 985可能是母離子失水的結(jié)果。在MC-RR分子中，質(zhì)子數(shù)等于精氨酸殘基數(shù)，所有質(zhì)子被束縛在氨基酸側(cè)鏈上，導(dǎo)致分子發(fā)生“charge-remote”模式電離，產(chǎn)生m/z 127子離子[20-21]。為增強離子化效率，在使用ESI離子源時，常常需要加入離子化增強劑。試驗使用甲酸作為離子化試劑，并對離子化試劑的用量進行優(yōu)化，不同濃度加酸對靈敏度的影響見圖1。從圖1可知，將流動相中加入一定體積的甲酸后，大部分MCs的靈敏度均有所提高，在添加濃度為0.1%～0.2%時，8種MCs靈敏度變化不明顯。所以試驗最終采用在流動相中添加0.1%甲酸以增強各化合物的靈敏度，優(yōu)化后的總離子流圖見圖2。

圖1 不同甲酸添加濃度對儀器靈敏度的影響

圖2 8種MCs色譜

2.2 固相萃取柱的選擇

根據(jù)MCs的理化性質(zhì)，一般選用C18或HLB固相萃取柱進行樣品的富集和凈化。選擇2種C18小柱和HLB小柱進行回收率試驗，結(jié)果見圖3，ENVI C18小柱對8種MCs的回收率范圍為75%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8%～15%；Sep-Pak C18小柱對8種MCs的回收率范圍為77%～115%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7%～13%；HLB小柱對8種MCs的回收率范圍為85%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5%～11%。2種小柱對8種MCs的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差基本滿足試驗要求，但HLB小柱相較于其他2種C18小柱來說，回收率更高，精密度更好，所以試驗選取HLB小柱作為固相萃取柱。

圖3 不同固相萃取柱對8種MCs的回收率

2.3 方法檢出限

推薦配制8種MCs質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L(可根據(jù)實際樣品濃度進行調(diào)整)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)化合物的響應(yīng)值y與相應(yīng)的質(zhì)量濃度x(μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢出限利用3倍信噪比的方法計算，見表2。由表2可知，在加標(biāo)濃度為0.1～50.0 μg/L范圍內(nèi)，8種MCs的線性關(guān)系良好，定量下限范圍為0.006～0.018 μg/L，滿足WHO及中國地表水、生活飲用水相關(guān)控制標(biāo)準(zhǔn)的要求。

表2 8種MCs的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 方法準(zhǔn)確度與精密度

分別向地表水樣品中加入1 μg/L(低濃度)、10 μg/L(中間濃度)、50 μg/L(高濃度)標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度添加水平設(shè)置5個平行樣品，計算回收率及精密度，試驗結(jié)果見表3。由表3可知，在添加低濃度水平時，8種MCs的回收率范圍為85.3%～107.5%，RSD范圍為3.6%～11.7%；添加中間濃度水平時，8種MCs的回收率范圍為88.9%～103.3%，RSD范圍為3.6%～8.5%；添加高濃度水平時，8種MCs的回收率范圍為90.3%～105.4%，RSD范圍為3.3%～8.5%。

2.5 實際樣品的測定

2021年9月，采集華北某地區(qū)水庫水樣，按照上述方法對水樣中8種MCs進行檢測，結(jié)果見表4。由表4檢測結(jié)果可知，即使不在藍(lán)藻水華高發(fā)的7、8月，華北地區(qū)水庫水體中還是檢出藻毒素的存在，一般以MC-LR和MC-RR較為常見，與中國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限值比較，其未出現(xiàn)微囊藻毒素超標(biāo)情況。

表3 8種MCs回收率及精密度(n=5) %

表4 華北某地區(qū)水庫實際樣品微囊藻毒素測定值 單位：μg/L

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對地表水中8種MCs進行分析，建立了一種固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜同時檢測地表水中8種MCs的分析方法。本研究對8種MCs主要分子離子峰進行了初步解析，使定性更加準(zhǔn)確。該方法線性關(guān)系好，準(zhǔn)確度高，精密度好，樣品前處理簡單，檢出限能夠滿足WHO及中國GB 3838—2002《地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中集中式生活飲用水地表水源地特定項目標(biāo)準(zhǔn)限值和GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中水質(zhì)非常規(guī)指標(biāo)及限值要求。該方法還具有快速和操作簡單等特點，可為中國水體中微囊藻毒素的檢測提供技術(shù)支撐。