周婷婷,胡文革,鐘鎮(zhèn)濤,王月娥,陳 婷,張 雪

石河子大學生命科學學院, 石河子 832000

新疆艾比湖濕地國家自然保護區(qū)位于東經(jīng)82°33′—83°53′,北緯44°37′—45°15′,總面積達到2670.8 km2,是國內(nèi)典型的溫帶干旱區(qū)濕地荒漠生態(tài)系統(tǒng)[1],作為北疆地區(qū)的天然生態(tài)屏障,對于維護區(qū)域生態(tài)平衡、調(diào)節(jié)氣候和保證物種的多樣性等方面都起著極為重要的作用[2]。近年來,艾比湖濕地土壤逐年荒漠化、植被也不斷退化,加大對該地區(qū)的研究迫在眉睫。氮素作為組成地球生命的物質(zhì)之一,也是濕地恢復的限制養(yǎng)分之一。目前,對于艾比湖濕地植物根際與非根際中氮素轉(zhuǎn)化過程中的固氮菌[3—5],硝化作用中的氨氧化細菌和氨氧化古菌[6—7]的群落結構及多樣性已有部分研究,但對于反硝化過程中的反硝化細菌的多樣性情況隨季節(jié)性變化狀況尚未明確。

反硝化作用是氮循環(huán)過程中氮素去除的重要環(huán)節(jié)[8],而亞硝酸鹽還原過程又是其中最關鍵的過程及限速步驟,該過程主要由亞硝酸鹽還原酶推動,編碼該酶的基因為nirK和nirS基因。目前,關于反硝化細菌的研究主要涉及不同的環(huán)境,例如海灣、河口沉積物、活性污泥、人工濕地[9—12],但不同類型的環(huán)境中的反硝化過程存在著明顯的時空差異[13—14]。nirS和nirK兩種基因型的反硝化細菌的分布具有一定的環(huán)境特異性,前者的氧化還原條件較低[15]；目前已知其存在于超過70%的已知反硝化細菌中,在環(huán)境中的分布更為廣泛[16]；nirK基因型反硝化細菌大多不明確分類歸屬[17—18]。

nirS和nirK兩種基因型反硝化細菌群落的多樣性與植被類型、土壤狀況等密切相關[19]。高志強[20]等在對于珠江口表層沉積物中發(fā)現(xiàn),鹽度、氮素水平(總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮)是影響nirS-型反硝化細菌群落分布的重要因素。莫旭華等[21]用RFLP技術對小麥土壤的研究結果表明,無機氮肥含量與nirS-型反硝化細菌的群落結構顯著相關。張文學等[22]利用qPCR技術結合DGGE技術研究氮肥增效劑對水稻土壤的中的反硝化細菌豐度及群落結構的影響,結果表明,氮肥施加與否影響著反硝化細菌的豐度和群落結構。楊揚[23]研究發(fā)現(xiàn),艾比湖濕地植物根際反硝化微生物群落結構與土壤電導率、有機質(zhì)、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮等相關。此外,靳希桐等[4]對于艾比湖濕地土壤的理化性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),濕地中較為廣泛存在的鹽角草植物,其生長的土壤類型為堿性沙壤土,土壤中的有機質(zhì)含量較高,含水量較低。

集中開展?jié)竦厣鷳B(tài)系統(tǒng)中鹽角草植物覆蓋區(qū)各土壤理化因子對反硝化微生物多樣性及群落結構的響應,對濕地生境特征及其演化的深入認識,具有非常重要的作用。本研究采集艾比湖濕地夏、秋、春3個季節(jié)鹽角草植物覆蓋區(qū)的根際與非根際樣本,利用高通量測序技術,分別以nirS和nirK基因作為分子標記比較研究鹽角草根際與非根際樣本中的反硝化細菌的多樣性狀況,了解濕地中不同類型反硝化細菌的分布情況及季節(jié)性變化,旨在為濕地的土壤肥力和土壤功能改善、生態(tài)植被恢復提供及生態(tài)系統(tǒng)保護提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

分別于2017年7,10月和2018年4月在艾比湖濕地鹽角草群落區(qū)(82°43′46.35″E,44°51′3.59″N,海拔193.2 m),參照文獻[24]的方法,采集根際和非根際土樣。隨機選擇3個10 m×10 m大小的植物群落樣區(qū),在每個樣區(qū)中隨機選擇5個采樣位點,采集與植物根部表面緊密結合的土壤,共15個土樣,將15個土樣混合即為根際樣本。采集植物非根際樣本時,在采集根際樣本區(qū)域,采集無植物生長5—20 cm土層的土壤即為非根際樣本。將采集土樣裝入無菌袋于4℃手提式冰箱暫時保存運輸回實驗室,保存于-80℃冰箱,用于土壤總DNA的提取。2017年7,10月和2018年4月采集的鹽角草根際土樣分別命名為S7、S10、S4；采集的非根際土樣分別命名為SN7、SN10、SN4。

1.2 樣品理化性質(zhì)指標測定

1.3 土壤總DNA的提取及反硝化細菌基因PCR擴增

土壤預處理：取適量保存于-80℃冰箱的濕潤土壤置于無菌且預冷后的研缽中,迅速研磨至土壤顆粒完全破碎后用于提取總DNA。用DNeasy PowerSoil Kits試劑盒(MoBio公司)提取各樣本總DNA,操作步驟參照試劑盒說明書。每個土壤樣品各提取3個總DNA,混勻后用于反硝化細菌基因序列的擴增。

選用引物nirS-cd3aF：5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG- 3′和nirS-R3cd：5′- GASTTCGGRTGSGTCTTGA- 3′[26],PCR擴增nirS基因序列,擴增片段長度約為425 bp。選用引物nirK-F：5′-TCATGGTGCTGCCGCGY GANGG- 3′和nirK-R：5′-GAACTTGCCGGTKGCCCAGAC- 3′[27],PCR擴增nirK基因序列,擴增片段長度約為326 bp。nirS基因擴增條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s,54℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環(huán)；72℃ 10 min。nirK基因擴增條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,32個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 反應體系(50 μL)：2×PCR Mix 25 μL,上游、下游引物各 1 μL,DNA 模板 3 μL,ddH2O 20 μL。

分別用帶有不同barcode的nirS基因引物和nirK基因引物對各根際和非根際土壤樣品的總DNA進行PCR擴增,用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將有清晰條帶的PCR擴增產(chǎn)物送諾禾致源公司進行高通量測序,測序平臺為Illumina Hiseq PE250。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)進行拼接、過濾,質(zhì)控后得到Effective Tags,利用Uparse 軟件對獲得的Effective Tags 進行聚類分析,基于97%的一致性劃分OTUs(operational taxonomic units,可操作性分類單元),然后對每個OTU中多次出現(xiàn)的序列進行過濾以獲得代表序列,利用Silva132數(shù)據(jù)庫進行物種注釋(閾值為 0.8—1),進而確定基因序列在各分類水平上的物種信息及群落結構組成情況。利用MUSCLE軟件進行多序列比對,并對各樣本數(shù)據(jù)進行均一化處理,用于計算反硝化細菌的多樣性,進而利用Mothur軟件分析Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù),探究不同樣本間群落結構的差異[28]。利用Canoco4.5軟件對反硝化細菌的多樣性及主要類群與環(huán)境因子進行冗余分析(RDA),得到顯著影響反硝化細菌群落多樣性及豐富度的環(huán)境因子。

2 結果與分析

2.1 鹽角草根際與非根際樣本土壤理化性質(zhì)

鹽角草根際與非根際樣本土壤理化性質(zhì)特征：土壤鹽度呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變化,土壤堿解氮、鉀元素的含量在不同季節(jié)存在顯著性差異,土壤硝態(tài)氮、速效磷的含量在根際樣本和非根際樣本間存在差異,土壤整體有機質(zhì)含量較高,水分含量較低。

2.2 測序數(shù)據(jù)分析

高通量測序的所有樣本中反硝化細菌nirS基因和nirK基因的有效序列數(shù)均超過50000條,且所有樣本的覆蓋率(表1)均高于99.0%,表明這些樣本的nirS基因和nirK基因的高通量測序數(shù)據(jù)能真實地反映樣本的信息。

表1 艾比湖濕地鹽角草根際與非根際土樣中nirS-型和nirK-型反硝化細菌多樣性

2.3 鹽角草根際與非根際樣本中的反硝化細菌基因多樣性

利用每個樣本的OTU 數(shù)目、覆蓋率、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)評估反硝化細菌基因多樣性及豐富度。

由表1可知,在艾比湖濕地各土樣中,nirS-型反硝化細菌Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)均呈現(xiàn)出S10>SN7>S4>S7>SN4>SN10,nirK-型反硝化細菌Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)均呈現(xiàn)出S10>S7>S4>SN7>SN10>SN4；在艾比湖濕地3個季節(jié)鹽角草中,nirS-型反硝化細菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)呈現(xiàn)出S7>S10>SN7>SN10>S4>SN4,nirK-型反硝化細菌群落ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)呈現(xiàn)出S7>S10>S4>SN7>SN4>SN10。

總體而言,鹽角草根際土樣中的nirS-型和nirK-型反硝化細菌群落多樣性均普遍高于非根際土樣,nirS-型反硝化細菌群落多樣性在季節(jié)上呈現(xiàn)秋季>春季>夏季,nirK-型反硝化細菌群落多樣性在季節(jié)上呈現(xiàn)秋季>夏季>春季,可知兩種類型反硝化細菌群落多樣性最高的均為秋季的根際土樣。

2.4 鹽角草根際與非根際樣本中的反硝化細菌群落結構組成

2.4.1門水平上的群落結構組成

艾比湖濕地鹽角草各樣品中的nirS和nirK基因序列分別與數(shù)據(jù)庫Silva132比對,進行物種注釋后分別統(tǒng)計其在門水平下的物種相對豐度,結果見圖1(Others為未能鑒定出來的序列)。由圖1可知,在門分類水平上,鹽角草根際與非根際各樣本中的nirS-型反硝化細菌主要隸屬于變形菌門(Proteobacteria),厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)。Proteobacteria在各樣本中的相對豐度分別為6.063%、10.692%、27.995%、5.139%、10.539%、16.388%,表明Proteobacteria為每個樣本的絕對優(yōu)勢菌門,Firmicutes在各樣本中的相對豐度分別為0.007%、0%、0.002%、0.007%、0.019%、0%,其普遍存在于根際各樣本中,Actinobacteria僅存在于夏季根際樣本中,相對豐度為0.002%,占比較低。各樣本中的nirK-型反硝化細菌僅隸屬于Proteobacteria和Firmicutes。Proteobacteria在各樣本中的相對豐度分別為0.295%、5.117%、0.523%、2.583%、0.400%、2.983%,為每個樣本的優(yōu)勢菌門,但其在每個樣本中的占比又存在著差異,Firmicutes僅存在于夏季鹽角草根際樣本中,相對豐度為0.195%。

比較兩種類型的反硝化細菌在門分類水平上的差異發(fā)現(xiàn)(表2),在鹽角草根際與非根際兩種類型的反硝化細菌所共有的門為Proteobacteria和Firmicutes,但它們在各樣本中的占比存在差異。相比于nirK-型反硝化細菌,nirS-型反硝化細菌中的這兩個門的占比相對較多。

圖1 艾比湖濕地鹽角草根際與非根際樣本中nirS-型和nirK-型反硝化細菌在門分類水平上的群落結構Fig.1 Community structure of nirS-type and nirK-type denitrifying bacteria at the level of phylum in rhizosphere and non-rhizosphere samples of Salicornia europaea in the Ebinur Lake WetlandS7：7月的鹽角草根際樣品 Salicornia europaea rhizosphere sample in July；S10：10月的鹽角草根際樣品 Salicornia europaea rhizosphere sample in October；S4：4月的鹽角草根際樣品 Salicornia europaea rhizosphere sample in April；SN7：7月的鹽角草非根際樣品 Salicornia europaea non-rhizosphere sample in July；SN10：10月的鹽角草非根際樣品 Salicornia europaea non-rhizosphere sample in October；SN4：4月的鹽角草非根際樣品 Salicornia europaea non-rhizosphere sample in April

表2 鹽角草根際和非根際樣本中nirS-型與nirK-型反硝化細菌在門水平上的群落結構

2.4.2屬水平上的群落結構組成

圖2 艾比湖濕地鹽角草根際與非根際樣本中nirS-型和nirK-型反硝化細菌在屬分類水平上的群落結構Fig.2 Community structure of nirS-type and nirK-type denitrifying bacteria at the level of genus in rhizosphere and non-rhizosphere samples of Salicornia europaea in the Ebinur Lake Wetland

根據(jù)物種注釋結果,統(tǒng)計各樣本在屬水平上的分布情況,每個樣本在屬水平上豐富度排名前10的物種的統(tǒng)計結果見圖2(Others為未能鑒定到種屬的序列)。nirS-型反硝化細菌在屬水平上排名前10的物種包括鏈球菌屬(Streptococcus)、海桿菌屬(Marinobacter)、磁螺菌屬(Magnetospirillum)、副球菌屬(Paracoccus)、含銅菌屬(Cupriavidus)、固氮螺旋菌屬(Azospirillum)、紅長命菌屬(Rubrivivax)、短枝單胞菌屬(Brachymonas)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)。其中,Pseudomonas和Halomonas是各土壤樣本中nirS-型反硝化細菌所共有的絕對優(yōu)勢屬,其余8個屬在各樣本中的占比相對較低。在樣本S7中nirS-型反硝化細菌的優(yōu)勢屬為Pseudomonas(1.13%)、Halomonas(2.50%)、Rubrivivax(0.99%)和Paracoccus(0.64%),展現(xiàn)出較為豐富且分布均衡的群落結構。在樣本S10中nirS-型反硝化細菌的優(yōu)勢屬為Pseudomonas(1.33%)和Halomonas(25.61%)。樣本S4中所包含的屬的種類同S10相似,區(qū)別在于缺少了Rubrivivax以及優(yōu)勢菌屬的相對豐度不同。在樣本SN7中nirS-型反硝化細菌優(yōu)勢屬為Pseudomonas(1.12%)、Halomonas(8.78%),其他5個屬的相對豐度均較低。在樣本SN10中nirS-型反硝化細菌的優(yōu)勢屬為Pseudomonas(3.54%)和Halomonas(1.15%),其余各屬的分布較少且均勻。樣本SN4主要包括了Pseudomonas(1.13%)、Halomonas(2.50%)、Azospirillum(0.02%)、Paracoccus(0.08%)和Magnetospirillum(0.002%)。鹽角草非根際土樣中nirS-型反硝化細菌的多樣性相對較低。

nirK-型反硝化細菌在屬水平上排名前10的物種包括Chelativorans、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、巴西氏菌屬(Bosea)、副球菌屬(Paracoccus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、卡斯特蘭尼氏菌屬(Castellaniella)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、無色桿菌屬(Achromobacter)。Castellaniella和Rhizobium是各土樣中所共有的nirK-型反硝化細菌屬。根際各樣本中nirK-型反硝化細菌的各個屬的分布較為均勻。Pseudomonas和Chelativorans在樣本SN7中的相對豐度較高,分別為1.20%和3.24%；Rhizobium在樣本SN10中占比最高,為0.16%；Castellaniella在樣本SN4中占比最高,為1.03%,遠高于在其他樣本中的占比。

比較兩種類型的反硝化細菌在屬分類水平上的分布情況(表3和表4),在所有土壤樣本中共有的反硝化細菌的屬為Pseudomonas和Paracoccus,但二者在各樣本中的相對豐度存在差異。nirK-型反硝化細菌中的Paracoccus僅存在于樣本SN10中,相對豐度僅為1.22%,較低；nirS-型反硝化細菌中的Pseudomonas在各樣本中的相對豐度明顯高于nirK-型反硝化細菌。植物根際與非根際各樣本中兩種類型的反硝化細菌分別存在一定比例的獨有屬。nirS-型反硝化細菌中,在各樣本中較為廣泛存在的獨有屬是Halomonas、Azospirillum和Magnetospirillum,在nirK-型反硝化細菌中相對豐度較高的獨有屬是Rhizobium和Castellaniella。

表3 鹽角草根際和非根際樣本中的nirS-型與nirK-型反硝化細菌共有屬

2.5 鹽角草根際與非根際樣本中反硝化細菌的多樣性及群落結構影響因子分析

2.5.1nirS-型反硝化細菌的多樣性影響因子分析

表4 鹽角草根際與非根際樣本中的nirS-型和nirK-型反硝化細菌的獨有屬

2.5.2nirK-型反硝化細菌的多樣性影響因子分析

圖3 不同季節(jié)鹽角草根際和非根際土壤中nirS-型反硝化細菌多樣性、群落結構環(huán)境因子的冗余分析Fig.3 RDA analysis between the diversity, community structure of nirS-type denitrifying bacteria and environmental factors in rhizosphere and non-rhizosphere soils of Salicornia europaea in different seasonEC：土壤電導率 Electric Conductivity；SM：土壤有機質(zhì) Organic Matter；SOM：土壤含水量 Soil Moisture Content；AN：土壤速效氮 Available Nitrogen；AP：土壤速效磷 Available Phosphorus；AK：土壤速效鉀 Available Potassium；TN：土壤全氮 Total Nitrogen；TP：土壤全磷 Total Phosphorus；TK：土壤全鉀 Total 土壤硝態(tài)氮 Nitrate 土壤銨態(tài)氮 Ammonium Nitrogen

圖4 不同季節(jié)鹽角草根際和非根際土壤中nirK-型反硝化細菌多樣性、群落結構與環(huán)境因子的冗余分析Fig.4 RDA analysis between the diversity, community structure of nirK-type denitrifying bacteria and environmental factors in rhizosphere and non-rhizosphere soils of Salicornia europaea in different season

3 討論

3.1 鹽角草根際與非根際樣本中的反硝化細菌多樣性及群落結構

多樣性結果表明,艾比湖濕地鹽角草各樣品都含有較高的nirS和nirK基因多樣性,且nirK基因多樣性普遍高于nirS基因。秋季根際樣本中的nirS和nirK基因多樣性最高。鹽角草根際各樣本中的反硝化細菌多樣性普遍高于非根際,這主要是植物的根系環(huán)境造成的,植物的根系能夠產(chǎn)生有機酸、氨基酸、胞外酶等多種物質(zhì),這些物質(zhì)在植物根際形成了植物根際效應[29]。

反硝化細菌群落結構分析表明,各樣本中的nirS-型反硝化細菌在門分類水平上主要包括了：Proteobacteria,Firmicutes和Actinobacteria,這與楊揚[23]的研究結果,濕地植物根際中的nirS基因序列在門水平僅有Proteobacteria,其余均為unidentified的研究結果存在一定的差異；本研究測得的各樣本的Coverage均高于0.995,這與她測得的0.61的覆蓋度形成了鮮明的對比；本研究測得的多樣性及豐富度指數(shù)也均高于其測定結果,這些都展現(xiàn)了高通量測序技術研究反硝化過程的優(yōu)勢。各土壤樣本中的nirK-型反硝化細菌在門分類水平上僅包括了Proteobacteria和Firmicutes,且在各樣本中存在的others的比例明顯高于nirS-型反硝化細菌,這表明鹽角草各土壤樣本中存在著較多的未知的nirK-型反硝化細菌類群。Proteobacteria作為各土壤樣本中所共有的兩種類型反硝化細菌優(yōu)勢門,是鹽角草各樣本中起主導作用的反硝化細菌門類。這與楊文煥等[30]對于包頭市南海湖表層沉積物中的nirS-型反硝化細菌的群落特征的研究結果是相符的,也與李博超[31]對遼寧河口沉積物中的反硝化細菌多樣性的研究結論是較為一致的,這可能是由于Proteobacteria中包含了各種營養(yǎng)類型的細菌,且其在艾比湖濕地土壤中的分布較為廣泛[32—34]。Gamma-Proteobacteria的Halomonas和Pseudomonas作為各土壤樣本中所共有的、分布較為廣泛的nirS-型反硝化細菌優(yōu)勢屬,是鹽角草各樣本中起主導作用的nirS-型反硝化細菌屬,這與鮑林林等[35]在北運河沉積物中發(fā)現(xiàn)主要的反硝化細菌類群為Halomonas和Pseudomonas的結果是一致的,表明了這兩個屬在沉積物與土壤樣本之間的廣泛存在。Pseudomonas是各土壤樣本中共同存在的nirS-型和nirK-型反硝化細菌,主要是因為Pseudomonas具有著豐富的代謝多樣性,能夠適應不同的環(huán)境狀況,可以普遍存在于不同的環(huán)境中。前人的研究已經(jīng)證實了這一點,黃鑫等[36]在對珠江水體研究中發(fā)現(xiàn)nirK-型和nosZ-型反硝化細菌的優(yōu)勢屬均為Pseudomonas,楊文煥等[30]就在包頭南海湖高原湖泊沉積物中發(fā)現(xiàn)nirS-型反硝化細菌的優(yōu)勢屬主要為Pseudomonas。Halomonas的菌株屬于中度嗜鹽菌,主要分布在高鹽堿環(huán)境中[37],而鹽角草植物附近鹽漬化的土壤環(huán)境適合該類菌株的生長。Azospirillum是在各樣本中少量存在的nirS-型反硝化細菌,這可能與典型的反硝化菌屬Azospirillum可以促進反硝化作用,加快脫氮過程相關[26]。Alpha-Proteobacteria的Rhizobium為各土壤樣本中所共有的、分布較為廣泛的nirK-型反硝化細菌優(yōu)勢屬,是鹽角草各樣本中起主導作用的nirK-型反硝化細菌屬,部分樣本中少量存在的Bradyrhizobium和Sinorhizobium的菌株,已有研究表明根瘤菌不僅可以與豆科植物共生固氮,其中的許多菌株都具有反硝化能力[38]。鄒艷艷等[39]就曾研究發(fā)現(xiàn)了一株隸屬于Rhizobium的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細菌,方芳等[40]對活性污泥反應器中的反硝化細菌進行研究,結果發(fā)現(xiàn),所有樣本中的大部分nirK-型反硝化菌株均隸屬于根瘤菌目。本研究發(fā)現(xiàn)Castellaniella也存在于各土壤樣本中,陳寒玉等[41]從鹽漬化土壤中分離獲得一株高效好氧反硝化菌隸屬于Castellaniella,它可以高效地還原硝酸鹽為一氧化氮、氮氣、一氧化二氮。Chelativorans是存在于鹽角草根際與非根際這一鹽堿環(huán)境中的nirK-型反硝化細菌,戴九蘭[42]等曾在黃河三角洲的鹽堿農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)了少量的Chelativorans的菌株。

3.2 鹽角草根際與非根際樣本中的反硝化細菌多樣性及群落結構對環(huán)境因子響應分析

RDA分析結果表明,在鹽角草根際與非根際中,nirS-型反硝化細菌的多樣性及群落結構呈現(xiàn)季節(jié)性差異,夏秋兩季中的nirK-型反硝化細菌的多樣性差別較小,且nirK-型反硝化細菌的群落結構在各個季節(jié)上存在較小的差異。而根際與非根際各樣本中的nirS-型和nirK-型反硝化細菌的多樣性及群落結構存在著一定的差異性。

反硝化微生物的群落多樣性在不同理化性質(zhì)的土壤之間存在差異差異,主要的原因有植被類型、植物殘體和植物根系分泌物等[19]。前人研究發(fā)現(xiàn)鹽度、氮素各水平(總氮、銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮)、有機質(zhì)等均會影響反硝化細菌群落多樣性及結構[20, 23]。楊文煥等[30]在對于包頭市南海湖的表層沉積物中反硝化細菌多樣性研究中發(fā)現(xiàn),反硝化菌的優(yōu)勢屬Pseudomonas與硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和總磷密切相關。本研究發(fā)現(xiàn),EC、AP、TN、AN、SM、SOM和銨態(tài)氮等對于nirS-型反硝化細菌的多樣性影響較大。影響nirK-型反硝化細菌多樣性的主要因素包括SOM、TP、SM、TN、AN和銨態(tài)氮。溫慧洋等[43]研究了不同程度的鹽堿土壤中的反硝化細菌功能基因豐度的關系,結果發(fā)現(xiàn)在一定的鹽分條件下,鹽度與反硝化細菌基因豐度存在正相關關系。EC與反硝化細菌之間的相關性,主要是EC會影響硝酸鹽還原過程中的酶活性,進而影響后續(xù)的反硝化過程。而艾比湖濕地土壤中硝態(tài)氮的含量并非反硝化細菌多樣性的主要影響因素,這與前人的研究結果是一致的,李剛[44]等利用DGGE技術對沙地土壤中的nirK基因型的反硝化細菌進行研究,結果表明nirK-型反硝化細菌的多樣性與硝態(tài)氮之間無相關關系,AlexanderMergel[45]等利用基因探針技術對酸性森林土壤中的反硝化細菌進行研究,結果也表明了兩者之間的相關性很低。對于鹽角草各樣本中反硝化細菌屬水平的Top10的菌屬與環(huán)境因子之間的冗余分析發(fā)現(xiàn)：AP、TP和硝態(tài)氮的含量等與共有屬Pseudomonas的相對豐度密切相關,表明Pseudomonas的群落結構與磷元素之間存在較強的響應關系[46],這和Wang Chun-Chin等[47]的研究結果是一致的,研究發(fā)現(xiàn)太湖流域沉積物中的優(yōu)勢菌屬Pseudomonas的相對豐度與總磷含量相關,而其他的優(yōu)勢菌屬與環(huán)境因子的相關性較低。Azospirillum的相對豐度和氮素水平密切相關,相對豐度和堿解氮含量均是植物根際樣本中較高。土壤EC含量整體呈現(xiàn)根際高于非根際,而Halomonas的相對豐度并沒有呈現(xiàn)此趨勢,表明,Halomonas的相對豐度雖然受到EC的影響,但并非僅由該因素決定。本研究中反硝化細菌中top10的菌屬相對豐度高低并非單一土壤理化因子驅(qū)動,兩種類型的反硝化菌群落結構差異受到不同土壤理化因子影響。EC、TN、TK、TP和AN在屬水平協(xié)同影響nirS-型反硝化細菌的生長；SM、AK、pH、AP和硝態(tài)氮共同影響著nirK-型反硝化細菌。艾比湖濕地鹽角草根際與非根際中反硝化細菌的群落結構組成是由多種土壤理化因子共同起作用的,這和WOLSING M[48]等的研究結果具有一定的相似性。

4 結論

在艾比湖濕地,隨著季節(jié)的變化,鹽角草根際與非根際中的nirS-型和nirK-型反硝化細菌多樣性及群落結構發(fā)生著變化,且兩種基因型的反硝化細菌在多樣性及群落結構方面存在著差異。鹽角草根際各樣本中的反硝化細菌基因多樣性普遍高于非根際,且根際與非根際中的反硝化細菌的群落結構并不相同。濕地土壤各理化因子對于兩種基因型的反硝化細菌的多樣性及群落結構的影響不盡相同。艾比湖濕地反硝化細菌呈現(xiàn)季節(jié)性變化,nirS-型和nirK-型反硝化細菌以不同的主要菌屬,共同推進濕地反硝化作用。對于濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護,需要進行長期而廣泛的土壤狀態(tài)評估和土壤反硝化微生物菌群的動態(tài)監(jiān)測。