李玉龍,鮑相渤,李軼平,周遵春,付 杰,高祥剛,陳百靈,李云峰

遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院,遼寧省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大連 116023

水母是一種海洋膠質(zhì)類浮游動(dòng)物,是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,在海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞過程中具有重要作用[1—3]。另一方面,水母是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要捕食者,其食物組成以浮游動(dòng)物為主,也能捕食魚卵、仔稚魚以及各種動(dòng)物的浮游幼體等,水母的過量繁殖或暴發(fā)往往對(duì)海洋漁業(yè)造成巨大負(fù)面影響并破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡[4—6]。隨著全球化進(jìn)程的加快和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,環(huán)境污染、氣候變化及過度捕撈等因素使海洋生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生了有利于水母類的變化,全球多處海域發(fā)生水母暴發(fā)的現(xiàn)象日益增多,引發(fā)一系列的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問題[7—13]；再加上更加頻繁的航運(yùn)、海洋工程建設(shè)的增多等有利于水母的擴(kuò)散和定殖,使水母成為海洋生態(tài)系統(tǒng)中易發(fā)生生物入侵的重要種類,給海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定帶來威脅。

針對(duì)水母暴發(fā)引起的一系列問題,開發(fā)快速、便捷的水母種類調(diào)查和檢測技術(shù)對(duì)查清在自然海域中水母暴發(fā)的種類、監(jiān)測及預(yù)警具有重要意義,也是了解不同海域水母種類生物入侵的前提。然而,水母大多具有世代交替的生活史,水螅體世代營固著生活,水母體世代營浮游生活,由于水母復(fù)雜的生活史以及不同時(shí)期形態(tài)變異較大等原因,再加上很多水母水螅體階段個(gè)體微小以及不同種屬間水螅型及水母型形態(tài)差異大,且樣品保存過程中易碎、易變形致使形態(tài)學(xué)特征容易丟失,依據(jù)傳統(tǒng)方法對(duì)水母進(jìn)行分類鑒定和檢測往往耗時(shí)長、成本高,且較為繁瑣和困難,阻礙了對(duì)其進(jìn)行早期監(jiān)測和預(yù)警。鑒于水母種類鑒定及檢測在水母暴發(fā)及防治中的重要性,已有學(xué)者利用DNA條形碼標(biāo)記如線粒體分子標(biāo)記COI、16S[14—15]和核基因分子標(biāo)記如18S、ITS等開展了水母種類的DNA條形碼分析以及一些災(zāi)害水母種類如白斑水母(Phyllorhizaspp.)、金黃水母(Chrysaorasp.)、海月水母(Aureliasp.)和白色霞水母(Cyaneanozakii)等[16—19]的種類鑒定與檢測工作并取得較好的效果,證明了DNA條形碼技術(shù)在水母種類鑒定中的應(yīng)用潛能。但前期的研究工作大多采用傳統(tǒng)測序技術(shù),受限于當(dāng)時(shí)技術(shù)手段的局限性,往往只能對(duì)單一水母種類進(jìn)行檢測或鑒定,且操作步驟繁瑣、工作量大,限制了分子DNA條形碼技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。

建立針對(duì)水母種類的快速有效的檢測技術(shù),既是對(duì)水母進(jìn)行早期監(jiān)測、預(yù)警的需要,也可為水母類的生物多樣性調(diào)查、生物入侵等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?；诟咄繙y序技術(shù)獲得生物特異性基因識(shí)別DNA條形碼序列的擴(kuò)增子測序方法,稱為DNA宏條形碼技術(shù)。近年新興的環(huán)境DNA宏條形碼(Environmental DNA metabarcoding)技術(shù)能夠通過直接提取環(huán)境樣品(如水、土壤等)中的DNA,利用針對(duì)目標(biāo)類群的通用引物擴(kuò)增后再進(jìn)行高通量測序,進(jìn)而對(duì)取樣環(huán)境中存在的目標(biāo)物種進(jìn)行識(shí)別。整個(gè)過程無需采集目標(biāo)生物,具有簡便、快速、檢測靈敏度高和信息量大等特點(diǎn),彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)監(jiān)測的不足,目前已開始應(yīng)用于生物多樣性評(píng)估及檢測、生物入侵、動(dòng)物食性分析等方面的研究[20—25],并展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛能。

利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)水生生物進(jìn)行監(jiān)測已成為目前的研究熱點(diǎn),并在魚類、海洋哺乳類、底棲生物、貝類、浮游動(dòng)、植物等[24—31]生物類群的調(diào)查監(jiān)測中進(jìn)行了應(yīng)用并取得較好的效果,但目前尚無針對(duì)水母類的相關(guān)報(bào)道。營口現(xiàn)代漁業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園海蜇養(yǎng)殖池塘為遼東灣近岸圍海養(yǎng)殖區(qū),其前身為營口鹽業(yè)有限責(zé)任公司為制鹽修建的人工納潮構(gòu)筑物,近似長方形,面積約9000hm2,通過自然納潮進(jìn)行海蜇圍海養(yǎng)殖,是較具代表性的遼東灣典型圍海養(yǎng)殖池塘。其位置位于遼東灣東北近岸大清河入海口附近,由于瀕臨河口區(qū),且離港口、碼頭距離較近,各種水母種類豐富,而且修建的堤壩等人工建筑可以為各種水母的定殖提供良好的棲息環(huán)境,很多水母種類的水螅體可以很好地附著底棲生活,往往能夠引起水母種類的富集,使其成為研究水母種類物種多樣性和檢測的合適材料。因此,本研究首次運(yùn)用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)這一典型圍海養(yǎng)殖池塘水母種類多樣性進(jìn)行調(diào)查評(píng)價(jià),不但能進(jìn)一步加深對(duì)我國北方海域水母種類及暴發(fā)的了解,并且可以驗(yàn)證環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在自然海域水母監(jiān)測應(yīng)用中的可行性,為水母類的物種鑒定、監(jiān)測以及早期預(yù)警等提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 水樣采集

本次采樣于2019年8月28日進(jìn)行,分別選取營口現(xiàn)代科技產(chǎn)業(yè)園圍海養(yǎng)殖池塘沿岸7個(gè)采樣點(diǎn),各采樣點(diǎn)定位見圖1。每個(gè)采樣點(diǎn)使用容量為1L的取水器采集表層及底層水樣,每個(gè)采樣點(diǎn)在同一位置的同一水深進(jìn)行多次采樣,以增加物種的檢出率,然后混合保存至已消毒的5L塑料桶中。為了提高目標(biāo)種的檢出率,所有樣品均在24h內(nèi)使用0.45μm(MCE; Whatman公司)和3μm混合纖維素濾膜進(jìn)行真空抽濾,每個(gè)濾膜濾水量為2.5L。為評(píng)估是否存在外源DNA污染,每次過濾設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照。在每份樣品過濾后,濾膜立即冷凍保存,并對(duì)濾膜接觸面進(jìn)行消毒和沖洗,防止樣品間的交叉污染。冷凍濾膜置低溫保溫箱保存帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

圖1 水樣采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Information of sampling locations

1.2 eDNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

采用CTAB法提取濾膜DNA,并使用空白濾膜設(shè)置為陰性對(duì)照。樣品總DNA提取后,使用DNeasy tissue kit (Qiagen, Valencia, CA)純化試劑盒對(duì)DNA樣品進(jìn)行純化,純化后的eDNA樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別使用帶Barcode特異引物的18S V4區(qū)528F- 706R、線粒體COI通用引物mlCOIintF-jgHCO2198對(duì)環(huán)境DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列分別為: 528F:5′-GCCTCCCTCGCGCCATCAGGCGGTAATTCCAGCTCCAA- 3′,706R: 5′-GCCTTGCCAGCCCGATCAGAATCCRAGAATTTCACCTCT- 3′；mlCOIintF:5′- GGWACWGGWTGA ACWGTWTAYCCYCC- 3′,jgHCO2198: 5′-TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA- 3′[20]。反應(yīng)體系25μL,包括：0.2mmol/L每種dNTPs,0.2μmol/L每種引物,1μLDNA模板,1U Taq,2.0mmol/L MgCl2,2.5μL 10×緩沖液,滅菌超純水補(bǔ)足剩余體系。在Bio-rad T100梯度PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性1 min,98℃ 變性10s,50—55℃退火30 s,72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán)；最后72℃保溫5min。每次PCR反應(yīng)使用ddH2O為模板作PCR陰性對(duì)照。每份樣品重復(fù)擴(kuò)增2次,將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后,使用2%的瓊脂凝膠電泳檢測。所有陰性對(duì)照均無目的條帶,表明從采樣、過濾、DNA提取至PCR擴(kuò)增均無外源DNA污染。使用ThermoScientific公司GeneJET純化PCR產(chǎn)物,根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等質(zhì)量混樣操作,充分混勻后用2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物,18S V4區(qū)選擇主帶大小在400—450bp的序列,割膠回收目標(biāo)條帶；線粒體COI片段選擇主帶大小在300—350bp的序列,割膠回收目標(biāo)條帶。使用Illumina公司Truseq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit定量和文庫檢測,每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物單獨(dú)建庫,然后使用Illumina NovaSeq 6000測序平臺(tái)進(jìn)行第二代高通量測序(天津諾禾致源生物信息科技有限公司)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各樣品的原始測序reads用OBITools1.01.22程序包(http://metabarcoding.org/obitools/doc)經(jīng)質(zhì)控、過濾、拼接后得到有效數(shù)據(jù),建立參考數(shù)據(jù)庫、序列比對(duì)及分類等步驟,基于有效數(shù)據(jù)以97%的一致性進(jìn)行OTUs (Operational taxonomic units)聚類和物種分類分析。鑒于當(dāng)某一序列在數(shù)據(jù)庫中最佳匹配序列多于1條時(shí),OBITools程序會(huì)自動(dòng)將物種鑒定結(jié)果標(biāo)記為能夠涵蓋所有匹配物種的最低分類單元,但不能加入研究地物種分布信息的參考[32],因此分別將所得刺胞動(dòng)物門(不包括珊瑚蟲綱)物種18S rDNA和線粒體COI的OTU代表序列經(jīng)BLAST程序再次檢索后在GeneBank上找到對(duì)應(yīng)的物種。由于條形碼分辨率及數(shù)據(jù)庫的局限,不是每條序列的識(shí)別都能達(dá)到物種水平,因此將水母類OTU代表序列作為分子可操作分類單元(MOTU)來對(duì)不同水母類群進(jìn)行區(qū)分。序列的物種鑒定原則如下：

(1) 18S rDNA序列以在相同的基因序列區(qū)域內(nèi),當(dāng)覆蓋度(coverage)不低于95%且一致度達(dá)到99.5%及以上時(shí),判定樣品來自匹配序列對(duì)應(yīng)的物種。若存在不止一種物種的匹配序列,則結(jié)合水母的分布特征及可能的同種異名等綜合判斷排除不符合的物種,并推測可能的近緣物種或認(rèn)為物種鑒定失??；最高一致度<99.5%且≥95%,一致度最高序列僅有1條,且與得分次之的序列一致度差距≥2%時(shí),記為一致度最高序列的上一級(jí)分類單元,最高一致度對(duì)應(yīng)有多個(gè)物種時(shí),則記為能夠涵蓋所有一致度最高的當(dāng)?shù)匚锓N的最低分類單元。

(2)COI基因序列在相同的基因序列區(qū)域內(nèi),當(dāng)覆蓋度不低于95%、與單一物種比對(duì)的一致度≥99%,且符合物種分布記錄,記為該物種；如發(fā)生與單一物種比對(duì)一致度≥99%但該物種非當(dāng)?shù)匚锓N時(shí),則記為該物種在當(dāng)?shù)赜蟹植嫉淖罱壩锓N或認(rèn)為物種鑒定失?。挥捎贑OI基因在不同種間差異較大[14—15],最高一致度<99%且≥85%,一致度最高序列僅有1條,且與得分次之的序列一致度差距≥5%時(shí),記為一致度最高序列的上一級(jí)分類單元,最高一致度對(duì)應(yīng)有多個(gè)物種時(shí),則記為能夠涵蓋所有一致度最高的當(dāng)?shù)匚锓N的最低分類單元。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于18S rDNA宏條形碼的水母種類組成

除1個(gè)采樣點(diǎn)因3μm混合纖維素濾膜丟失未進(jìn)行檢測外其余所有13個(gè)樣品均獲得可檢測的PCR產(chǎn)物。7個(gè)采樣點(diǎn)基于18S rDNA宏條形碼標(biāo)記檢測出的水母物種種類序列信息見表1,物種鑒定信息見表2。7個(gè)采樣點(diǎn)13個(gè)濾膜樣品共檢測出水母種類8種,包括2種缽水母綱大型水母海蜇(Rhopilemaesculentum)、白色霞水母；1種筐水母亞綱水母兩手筐水母(Solmundellabitentaculata),1種未鑒定到種的硬水母亞綱棍手水母科水母,1種花水母亞綱高手水母科鱗莖高手水母(Bougainvilliamuscus)、2種軟水母亞綱水母黑疣真瘤水母(Eutimakrampi)和曲膝藪枝螅(Obeliageniculata),以及1種未鑒定到種的管水母亞綱盛裝水母科水母。其中僅養(yǎng)殖水母種類海蜇在各采樣點(diǎn)展現(xiàn)出相對(duì)較高的序列豐度,其余水母種類序列豐度較低(表1)。

2.2 基于COI宏條形碼的水母種類組成

7個(gè)采樣點(diǎn)基于COI宏條形碼標(biāo)記檢測出的水母物種種類序列信息見表3,物種鑒定信息見表4。雖然COI基因在水母種間的遺傳變異較大,如基于28種水螅水母的線粒體COI遺傳標(biāo)記進(jìn)行的研究表明,同屬不同種間遺傳距離為0.092-0.215(平均0.171),同科不同屬間遺傳距離為0.127-0.351(平均0.189),但其種內(nèi)差異并不大,遺傳距離為0-0.033(平均0.008),COI條形碼標(biāo)記在水母類群中有明顯的條形碼間隔,同屬種間的COI變異速率約是同種個(gè)體間的30倍[15]。因此本研究在進(jìn)行水母物種判別時(shí)參考這一標(biāo)準(zhǔn),按序列一致度≥99%歸為同種,序列一致度< 99%且≥85%歸為同屬或同科。7個(gè)采樣點(diǎn)檢測出至少19種水母種類,其中10種鑒定到種,包括缽水母綱4種海蜇、沙蜇(Nemopilemanomurai)、白色霞水母、海月水母,水螅水母6種,包括軟水母亞綱鐘螅水母科半球美螅水母(Clytiahemisphaerica)、美螅水母(Clytiagracilis)、雙叉藪枝螅(Obeliadichotoma)、和平水母科錫蘭和平水母(Eireneceylonensis)、塔形和平水母(Eirenepyramidalis)和短柄和平水母(Eirenebrevistylus)；9種僅鑒定到屬或科,包括缽水母綱游水母科1種(Pelagiasp.),花水母亞綱棍螅水母科薩氏水母屬1種(Sarsiasp.),軟水母亞綱鐘螅水母科美螅水母屬2種(Clytiasp.)、藪枝螅屬2種(Obeliasp.)、鐘螅水母科1種(Bonneviellasp.),感棒水母科1種(Laodiceasp.)和羽螅水母科1種(Aglaopheniasp.)。此外,由于GeneBank數(shù)據(jù)庫的缺乏還存在一些OUT代表序列僅能鑒定到科及以上分類階元 (<85%且≥80%) 的水母種類,如花水母亞綱棍螅水母科、Ptilocodiidae科、軟水母亞綱鐘螅水母科、高手水母科以及管水母亞綱盛裝水母科、離翼水母科種類等,實(shí)際鑒定出的水母種類數(shù)可能更多(表4)。同18S rDNA結(jié)果一致,海蜇在各采樣點(diǎn)均展現(xiàn)出較高的序列豐度,此外渤海常見小型水母種類如薩氏水母屬、美螅水母屬、藪枝螅等在各采樣點(diǎn)展現(xiàn)出的序列豐度也較為豐富(表3)。

表1 基于環(huán)境DNA宏條形碼18S rDNA分子標(biāo)記在營口圍海養(yǎng)殖池塘7個(gè)采樣點(diǎn)的水母物種序列數(shù)

表2 基于18S rDNA序列的水母生物可操作分類單元(MOTU)分子鑒定結(jié)果

3 討論

3.1 基于環(huán)境DNA的水母種類多樣性檢測

水母是刺胞動(dòng)物門在浮游生物中的主要代表,也是海洋浮游生物的主要類群之一,除終生浮游種類(如自育水母綱、管水母亞綱)之外,大多數(shù)水母具有世代交替的生活史[3]。對(duì)大多數(shù)水母而言,由于對(duì)整個(gè)生活史缺乏了解,且其形態(tài)性狀易隨發(fā)育階段或生境的改變而產(chǎn)生較大變化,因此對(duì)水母尤其是小型水母的物種鑒定一直是分類學(xué)工作的難點(diǎn)[15]。常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定步驟繁瑣、專業(yè)性強(qiáng),易造成同種異名或異種同名等錯(cuò)誤,必須由有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員借助顯微鏡才能進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。再加上一些水母種類存在隱種(cryptic species)現(xiàn)象[33—34],形態(tài)多樣性可能無法完全反映其真正的物種多樣性水平。上述因素導(dǎo)致水母尤其是小型水母調(diào)查難以量化和監(jiān)測,與其它海洋生物類群相比水母生態(tài)學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)數(shù)據(jù)缺乏,水母已成為海洋生態(tài)調(diào)查中的“短板”之一。與此同時(shí),近年水母暴發(fā)現(xiàn)象日益增多,由于隱蔽性強(qiáng)、所造成的災(zāi)害易擴(kuò)散、治理手段缺乏等原因,對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的破壞性,正嚴(yán)重威脅著海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定[4—11],因此亟需建立高效、快速、準(zhǔn)確的水母監(jiān)測方法。

表3 基于環(huán)境DNA宏條形碼COI分子標(biāo)記在營口圍海養(yǎng)殖池塘7個(gè)采樣點(diǎn)的水母物種序列數(shù)

表4 基于COI序列的水母生物可操作分類單元(MOTU)分子鑒定結(jié)果

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的新一代DNA條形碼鑒定技術(shù),具有高通量、成本低、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),在水生動(dòng)物的物種鑒定、生物多樣性檢測及外來入侵物種監(jiān)測等方面具有明顯優(yōu)勢。與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比eDNA宏條形碼技術(shù)不僅可以節(jié)省調(diào)查作業(yè)和物種鑒定所需的時(shí)間、費(fèi)用等,而且對(duì)水生生物無附帶傷害、具有更高的檢測成功率,eDNA宏條形碼技術(shù)有望成為集高效、精準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化為一體的新一代生物多樣性監(jiān)測工具,具有對(duì)環(huán)境樣品中生物物種進(jìn)行有效監(jiān)測的潛力[22—25,35—37],這在本文對(duì)水母類進(jìn)行的研究中也得到了佐證。本研究使用兩種DNA宏條形碼標(biāo)記對(duì)遼東灣東北部圍海養(yǎng)殖池塘水母種類進(jìn)行物種鑒定,基于18S rDNA分子標(biāo)記鑒定出2綱8種水母種類,而基于線粒體COI標(biāo)記則鑒定出2綱19種水母種類,所鑒定出的水母種類不僅涵蓋了遼東灣常見水母種類如缽水母綱海蜇、沙蜇、白色霞水母、海月水母,水螅水母總綱半球美螅水母、美螅水母、雙叉藪枝螅、曲膝藪枝螅、錫蘭和平水母、塔形和平水母、短柄和平水母；還包括一些傳統(tǒng)調(diào)查中的少見及偶見水母種類如筐水母亞綱、硬水母亞綱、管水母亞綱、花水母亞綱以及軟水母亞綱種類[38—40],研究結(jié)果表明環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)可以有效應(yīng)用于水母種類的物種監(jiān)測。

3.2 DNA條形碼標(biāo)記的選擇及其對(duì)水母物種識(shí)別能力的比較

目前很多學(xué)者采用基于DNA條形碼的分子生物學(xué)分類方法作為水母類物種鑒定的必要補(bǔ)充[14—15,33—34,41]。如程方平等[14]對(duì)中國北方海域習(xí)見水母種類DNA條形碼進(jìn)行了分析,Laakmann和Holst[41]在大西洋北海水螅水母鑒定以及張鐺妮等[15]對(duì)中國南海北部灣海域水螅水母DNA條形碼進(jìn)行的分析工作均證實(shí)了DNA條形碼標(biāo)記在疑難水母種類鑒定中的作用。一般而言,不同分子標(biāo)記基因的適用范圍并不完全一致,不同的分子標(biāo)記對(duì)不同物種的識(shí)別能力不同從而影響物種鑒定的準(zhǔn)確性,因此需根據(jù)待檢測生物類群以及研究目的綜合選擇合適的分子標(biāo)記[24—25,42]。核糖體18S rRNA基因和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (COI)基因是應(yīng)用最廣泛的兩種真核生物分子標(biāo)記基因,18S rDNA 序列是適用于進(jìn)化較慢物種的種類鑒定和系統(tǒng)分析的合適分子標(biāo)記,但由于其基因序列較為保守,在解決較小分類階元如屬的種間關(guān)系尤其是在進(jìn)行某些近緣種的物種鑒定時(shí)具有較大的局限性,適用于研究親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的生物[43]。與之相反,COI基因具有進(jìn)化速度快和功能保守性強(qiáng)的特點(diǎn),具有較高的物種識(shí)別能力,常用來分析浮游動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、微型后生動(dòng)物等[20,44—46]。

本研究中,基于18S V4區(qū)分子標(biāo)記的宏條形碼僅鑒定出2綱8種水母種類,而以COI為標(biāo)記的宏條形碼鑒定出2綱19種水母種類,表明基于COI宏條形碼的eDNA技術(shù)的水母檢出率明顯高于基于18S rDNA宏條形碼的eDNA技術(shù)。這與Fernández等[47]將室內(nèi)群落模擬實(shí)驗(yàn)、基于eDNA技術(shù)和基于傳統(tǒng)監(jiān)測方法的野外實(shí)驗(yàn)對(duì)河流內(nèi)大型無脊椎動(dòng)物監(jiān)測進(jìn)行的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,其結(jié)果也表明基于COI宏條形碼的eDNA技術(shù)的物種檢出率明顯高于傳統(tǒng)監(jiān)測方法和基于18S rDNA宏條形碼的eDNA技術(shù)。因此在監(jiān)測不同的生物類群時(shí),標(biāo)記基因的恰當(dāng)選擇對(duì)eDNA技術(shù)在生物多樣性監(jiān)測中的應(yīng)用具有重要作用,對(duì)水母這一生物類群而言,COI宏條形碼標(biāo)記可能具有更高的物種識(shí)別能力。此外,利用兩種分子標(biāo)記對(duì)水母物種的識(shí)別結(jié)果并不完全一致,兩者共同檢測出的水母種類僅有3種,這一方面可能歸因于兩種分子標(biāo)記的識(shí)別能力不一致所導(dǎo)致,另一方面水母DNA尤其是低豐度種類在水體中具有復(fù)雜的存在機(jī)制,其產(chǎn)生、降解及移動(dòng)過程受多種環(huán)境因素的影響,不同的采樣方案和引物選擇也可導(dǎo)致不同的檢測結(jié)果[48—49]。因此,在利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)水母類進(jìn)行物種鑒定時(shí),聯(lián)合采用多個(gè)分子標(biāo)記可能得出更為全面準(zhǔn)確的結(jié)論。

3.3 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的優(yōu)勢與不足及其在水母監(jiān)測中的應(yīng)用潛力

關(guān)于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的優(yōu)勢與不足,目前已有多篇文獻(xiàn)進(jìn)行了論述[22—25],如相比傳統(tǒng)監(jiān)測方法,環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)具有非破壞性采樣；便捷高效、耗時(shí)少、成本低；靈敏度高、快速和高效檢測群落多樣性等優(yōu)勢；但也存在一些不足,如針對(duì)不同生物類群尚無通用的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；時(shí)間和空間的不一致性；種類鑒定高度依賴分子數(shù)據(jù)庫的完整性；只能進(jìn)行定性分析無法進(jìn)行定量分析以及可能存在的污染問題等,此處不再進(jìn)行詳細(xì)贅述。雖然本研究未利用傳統(tǒng)調(diào)查方法對(duì)圍海養(yǎng)殖池塘的水母種類進(jìn)行調(diào)查,但基于傳統(tǒng)監(jiān)測[38—40]結(jié)果顯示,大型水母種類如海月水母、海蜇、沙蜇、白色霞水母以及小型水母種類如和平水母屬、藪枝螅水母、美螅水母屬等為遼東灣及渤海海域常見水母種類。本研究基于2種DNA宏條形碼標(biāo)記共鑒定出2綱22種水母種類,不僅包括海蜇、沙蜇、白色霞水母、海月水母和小型水母種類如美螅水母屬、和平水母屬等常見種類,而且還檢測出已報(bào)道的多種黃渤海常見水母種類如藪枝螅水母、黑疣真瘤水母、鱗莖高手水母、兩手筐水母等[39—40]。此外,由于數(shù)據(jù)庫中水母種類的局限性,還存在一些僅能鑒定到科及以上分類階元的水母種類,實(shí)際鑒定出的水母種類數(shù)量可能更多,證實(shí)了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在水母種類物種鑒定和監(jiān)測中的優(yōu)勢及可行性。

與此同時(shí),本研究利用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)水母進(jìn)行的分析也存在上述不足,如由于分子數(shù)據(jù)庫的缺乏導(dǎo)致一些水母種類無法鑒定；同一采樣點(diǎn)的樣品利用不同濾膜進(jìn)行擴(kuò)增的種類鑒定結(jié)果不一致；只能進(jìn)行定性分析無法進(jìn)行定量分析等。此外,目前的環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)還存在一些技術(shù)層面無法解決的問題,如引物選擇、PCR擴(kuò)增偏向性、測序誤差等。但結(jié)合了新一代高通量測序技術(shù)的eDNA宏條形碼方法可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)水環(huán)境樣品中的水母物種進(jìn)行識(shí)別和檢測,避免了傳統(tǒng)方法受樣品條件、操作者實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)知識(shí)等限制的不利影響,具有快速和高效檢測水母多樣性的潛力,可以作為一種重要的補(bǔ)充工具用于水母的快速調(diào)查、監(jiān)測及預(yù)警。

由此可見,環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高分辨率的技術(shù)優(yōu)勢,在解決包括水母類在內(nèi)的水生生物種類鑒定和生物群落多樣性監(jiān)測等方面尚有較大的應(yīng)用潛能,隨著物種分子數(shù)據(jù)庫的不斷完善和測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,在解決了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)定量分析準(zhǔn)確性方面的短板之后,環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)有望成為物種識(shí)別和多樣性分析、生物入侵以及生態(tài)環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的常規(guī)分析手段。