陶濤 任承德 陳國俊 強紫陽 楊艷燕

(青海大學附屬醫(yī)院泌尿外科，青海 西寧 810001)

膀胱癌在我國的臨床發(fā)病率為泌尿系統(tǒng)腫瘤首位，且術后的復發(fā)率高達60%以上。常用臨床治療方法有外科手術、化療及放療，膀胱癌的初期這些治療方法結合治療取得相對樂觀的療效，而由于膀胱癌細胞具有增殖凋亡不受控、易發(fā)生轉移的特點，患者在病情嚴重時，臨床治愈率顯著降低且預后不佳〔1～3〕。因此，膀胱癌細胞的惡性增殖遷移及非正常凋亡是影響臨床治療效果的關鍵因素，而在現(xiàn)階段對于癌細胞失控行為的具體機制尚在研究階段，可以明確的是，這是多細胞因子共同調控的結果，圍繞膀胱癌細胞的發(fā)展機制展開深入探究對于臨床治療和患者生存率的提高均具有重大意義〔4〕。miRNA是近年來研究較多的非編碼RNA，其種類眾多且被發(fā)現(xiàn)能夠參與細胞的增殖、發(fā)育、分化 、凋亡、轉移等生物學行為和過程〔5〕。相關研究證明，miR-144-3p能夠對骨肉瘤細胞增殖、侵襲能力進行抑制，且低表達于胰腺癌細胞中，上調其表達能夠有效降低胰腺癌細胞的轉移侵襲效率，此外，miR-144-3p還被證明能夠通過調控絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)8通路發(fā)揮腎細胞癌抑癌基因作用，因此，miR-144-3p在膀胱癌細胞發(fā)展過程的作用也值得探究〔6,7〕。三磷酸腺苷(ATP)結合轉運蛋白G家族成員(ABCG)2被發(fā)現(xiàn)與胃癌、腸癌、食管癌等多種腫瘤臨床預后有關〔8,9〕，呂弢等〔10〕發(fā)現(xiàn)miR-144-3p能夠靶向調控ABCG2通路的表達抑制胃癌細胞的遷移侵襲。本研究旨在探究miR-144-3p通過調控ABCG2通路對膀胱癌細胞增殖、凋亡及遷移作用的影響。

1 材料與方法

1.1試驗材料 人膀胱癌T24細胞株、正常膀胱上皮SV-HUC-1細胞株(南京科佰生物科技有限公司)、DMEM培養(yǎng)基(南京生航生物技術有限公司)、0.05%胰酶溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司)、逆轉錄試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)、CCK-8試劑(北京緣生化科技有限公司)、結晶紫染液(湖北鑫鳴泰化學有限公司)、ABCG2一抗、ABCG2二抗(上海晶抗生物工程有限公司)、明膠酶譜檢測試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)、考馬斯亮藍染液(上海哈靈生物科技有限公司)、Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)、流式細胞儀、高速離心機(美國貝克曼)、倒置顯微鏡(廣州明美光電技術有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將人膀胱癌T24細胞株和正常膀胱上皮SV-HUC-1細胞株分別接種在含有10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基的不同培養(yǎng)瓶中，然后放置在CO2濃度為5%室溫且濕度條件適宜的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，兩種細胞的融合度達到80%以上添加濃度為0.25%的胰酶進行細胞的消化，消化后的細胞傳代培養(yǎng)3代后備用。

1.2.2細胞轉染與分組 將傳代培養(yǎng)結束的T24細胞接種于6孔板(密度為1×104/孔)，并于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，細胞融合度達到50%時按照Lipofectamine 2000說明開始轉染操作，將細胞分為三組：轉染miR-144-3p模擬物的T24細胞為miR-144-3p mimics組；轉染miR-144-3p抑制劑的T24細胞為miR-144-3p inhibitor組；轉染無意義序列的T24細胞為miR-144-3p NC組，轉染操作完成后將細胞培養(yǎng)于不含小牛血清DMEM培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3qPCR法檢測miR-144-3p表達 qPCR法檢測T24和SV-HUC-1細胞中miR-144-3p表達及轉染步驟完成后各組T24細胞中miR-144-3p的表達。首先進行總RNA的提取，再根據(jù)逆轉錄試劑盒的具體操作完成cDNA的合成，U6為內參進行qPCR檢測，反應條件為：95℃ 2 min、95℃ 30 s、70℃ 40 s、70℃ 50 s，共進行35個循環(huán)后70℃ 10 min。以2-△△Ct法進行miR-144-3p相對表達的計算，各組設3個復孔進行3次重復試驗取平均值。

1.2.4CCK-8檢測細胞增殖 按密度為1×104/孔接種各組細胞于96孔板上，并分別于培養(yǎng)的0、24、48、72 h時添加CCK-8試劑進行染色，室溫孵育1 h后對每孔490 nm處OA值進行測定，各組設3個復孔進行3次重復試驗取平均值，并進行細胞增殖曲線的繪制。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 將各組T24細胞進行1 000 r/min轉速離心10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)試劑反復清洗，結合緩沖液進行清洗后1 000 r/min轉速離心10 min，重懸細胞后避光條件下添加5 μl 的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V，作用10 min后添加5 μl 7-氨基放線菌素(AAD)，在1 h之內使用流式細胞儀檢測檢測細胞凋亡率。

1.2.6Transwell檢測細胞遷移 各組T24細胞進行轉染48 h時用胰酶消化，經(jīng)過重懸制單細胞懸液，以5×103/孔T24細胞鋪于Transwell上室，下室培養(yǎng)基中添加20%小牛血清，將小室于培養(yǎng)箱中孵育1 d后取出小室，棉簽擦去上室的細胞和碎片，以0.1%的結晶紫染液對細胞進行染色，PBS洗滌后用倒置顯微鏡觀察下室濾膜上黏附的T24細胞，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)，比較各組細胞的遷移能力。

1.2.7Western印跡檢測ABCG2蛋白表達 提取總蛋白后二喹淋甲酸(BCA)法定量后以40 μg樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行蛋白分離，經(jīng)轉膜后添加5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，添加ABCG2一抗后低溫孵育過夜后添加ABCG2二抗孵育1 h，進行顯色曝光、采集圖像，以GAPDH為內參運用Gel-Pro32軟件分析T24細胞中ABCG2相對表達。

1.2.8明膠酶譜檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性 通過明膠酶譜檢測試劑盒檢測MMP-2及MMP-9的活性。將各組T24細胞進行轉染48 h時的培養(yǎng)上清液與SDS上樣緩沖液進行混合，進行凝膠電泳的條件為電壓70 V電泳時長2 h，電泳結束后用3.0%的Tritonx洗膠。然后于分析液中孵育過夜，考馬斯亮藍染色2 h后于脫色液中進行0.5 h的脫色，再以濃度為0.8%的乙酸脫色，最后明膠酶活性于藍色背景出現(xiàn)光亮區(qū)域。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、F檢驗。

2 結 果

2.1不同細胞中miR-144-3p、ABCG2的表達 miR-144-3p在人膀胱癌T24細胞中的表達較正常膀胱上皮SV-HUC-1細胞顯著降低(0.51±0.05 vs 1.31±0.07；t=6.347，P<0.05)；ABCG2在人膀胱癌T24細胞中的表達較正常膀胱上皮SV-HUC-1細胞顯著升高(3.12±0.34 vs 0.99±0.10；t=6.836，P<0.05)。

2.2轉染后各組miR-144-3p的表達 經(jīng)檢驗，轉染后miR-144-3p mimics組膀胱癌T24細胞中miR-144-3p的表達(1.36±0.05)較miR-144-3p NC組顯著升高(0.52±0.04，P<0.05)；miR-144-3p inhibitor組膀胱癌T24細胞中miR-144-3p的表達(0.37±0.03)較miR-144-3p NC組顯著降低(P<0.05)。

2.3各組T24細胞增殖能力比較 在轉染后的24、48、72 h時，各組膀胱癌T24細胞的增殖能力有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)，與miR-144-3p NC組比較，miR-144-3p mimics組細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，miR-144-3p inhibitor組細胞的增殖能力顯著上升(P<0.05)。見表1。

2.4各組T24細胞凋亡率比較 miR-144-3p mimics組T24細胞凋亡率〔(49.11±9.29)%〕較miR-144-3p NC組顯著升高〔(16.28±3.77)%,P<0.05〕；miR-144-3p inhibitor組T24細胞凋亡率〔(5.21±0.63)%〕較miR-144-3p NC組顯著降低(P<0.05)。見圖1。

表1 各組轉染不同時間A值比較

2.5各組T24細胞遷移能力比較 miR-144-3p mimics組T24細胞遷移個數(shù)〔(64.12±5.28)個〕較miR-144-3p NC組顯著降低〔(105.48±12.16)個，P<0.05〕；miR-144-3p inhibitor組T24細胞遷移能力〔(204.39±20.19)個〕較miR-144-3p NC組顯著上升(P<0.05)。見圖2。

圖1 各組T24細胞的流式細胞凋亡圖

圖2 細胞遷移能力顯微鏡下觀察(結晶紫染色，×100)

2.6各組ABCG2信號通路蛋白的表達 miR-144-3p mimics組T24細胞中ABCG2、MMP-2、MMP-9的表達較miR-144-3p NC組顯著降低(P<0.05)；miR-144-3p inhibitor組T24細胞ABCG2、MMP-2、MMP-9的表達較miR-144-3p NC組顯著上升(P<0.05)。見表2、圖3、4。

表2 各組ABCG2信號通路蛋白的相對表達比較

1～3：miR-144-3p inhibitor組、miR-144-3p NC組、miR-144-3p mimics組，下圖同圖3 Western印跡檢測T24細胞中ABCG2蛋白表達

圖4 明膠譜試驗檢測T24細胞中MMP-9、MMP-2的表達

3 討 論

近年來，miRNA被研究證實其在機體的多種病理及生理過程中起到關鍵調控作用，不同種類的miRNA對腫瘤惡性疾病發(fā)揮的作用不一，并與相關調節(jié)蛋白相互作用正向或負向調控著腫瘤細胞的代謝、增殖、轉移〔11～15〕。miR-144-3p是miRNA眾多種類中的一種，經(jīng)過對其深入和廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其在癌癥發(fā)生、成骨分化、生長發(fā)育及機體免疫反應等過程中均有一定的調控作用，高表達的miR-144-3p能夠抑制胃癌、惡性膠質瘤病、宮頸癌在內的多種癌細胞的增殖及遷移侵襲行為〔16～18〕。ABCG2作為多種腫瘤的臨床檢測標志物，被發(fā)現(xiàn)其在胃癌和膠質瘤干細胞中的表達顯著升高，并且與食管癌的病程發(fā)展和腫瘤分期關系密切，其下游MMP-2、MMP-9是MMP家族的成員，其促進癌細胞轉移侵襲能力已得到多項研究的證實〔19，20〕。

本研究說明miR-144-3p的低表達可能是膀胱癌的致病因素之一。ABCG2的高表達對于該病有促進作用。膀胱癌細胞中miR-144-3p的高表達能夠抑制細胞的增殖、促進腫瘤細胞的凋亡、抑制細胞的遷移能力。miR-144-3p對于膀胱癌細胞的一系列調控作用與其高表達抑制ABCG2通路表達有關。