宋晉 梁婷 王強(qiáng) 陳繪景

(1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065；2武漢市精神衛(wèi)生中心)

癲癇是一種慢性大腦短暫性功能障礙，患者反復(fù)發(fā)作會(huì)出現(xiàn)抑郁、焦慮等精神問(wèn)題，嚴(yán)重影響患者身心健康及生活質(zhì)量〔1,2〕。目前癲癇治療仍以藥物為主，但仍有20%～30%癲癇患者經(jīng)藥物治療無(wú)效，因此探索安全、無(wú)創(chuàng)的有效抗癲癇手段至關(guān)重要。低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(rTMS)是一種新型無(wú)痛、無(wú)創(chuàng)性抗癲癇技術(shù)，可降低癲癇患者發(fā)作頻率、減輕抑郁樣行為〔3～5〕，但其具體作用機(jī)制尚不完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，異常突出形成可能與癲癇發(fā)生發(fā)展有關(guān)，位于突觸后成分中的樹(shù)突棘形成和降解動(dòng)態(tài)變化是突觸可塑性的標(biāo)志，而微小RNA(miR)-134與樹(shù)突棘的發(fā)育有關(guān)，對(duì)神經(jīng)可塑性起重要作用，可參與癲癇及腦神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展〔6,7〕。環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(CREB)是神經(jīng)可塑性重要調(diào)節(jié)因子，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是CREB經(jīng)典下游靶基因，對(duì)多種神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)、成熟等作用，可促進(jìn)神經(jīng)元的可塑性及神經(jīng)遞質(zhì)的形成，與抑郁、焦慮樣行為及認(rèn)知障礙等密切相關(guān)〔8～10〕，但關(guān)于rTMS抗癲癇作用是否與調(diào)節(jié)miR-134/CREB/BDNF通路有關(guān)鮮有研究。本研究擬探究rTMS對(duì)癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為及miR-134/CREB/BDNF通路的影響，以期揭示其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性清潔級(jí)SD大鼠36只，體重280～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境溫度(23±2)℃、濕度(60±5)%，12 h晝夜節(jié)律控制條件下飼養(yǎng)，自由飲水、采食。

1.2主要試劑及儀器 氯化鋰(貨號(hào)：L4408，純度≥99.0%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；硫酸阿托品(國(guó)藥準(zhǔn)字H20073819)購(gòu)自河南普瑞制藥有限公司；毛果蕓香堿(貨號(hào)：92-13-7)購(gòu)自湖北諾納科技有限公司；Trizol試劑(貨號(hào)：R0016)、蛋白抽提試劑盒(貨號(hào)：P0028)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：P0010S)均購(gòu)自上海碧云天公司；miR定量試劑盒(貨號(hào)：638315)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(貨號(hào)：RR037A)、TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ(貨號(hào)：RR820A)均購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；兔源一抗anti-CREB(貨號(hào)：ab31387)、anti-p-CREB(貨號(hào)：ab220798)、anti-BDNF(貨號(hào)：ab108319)、anti-β-actin(貨號(hào)：ab-179467)、二抗羊抗兔IgG(貨號(hào)：ab6721)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Evolution 220紫外分光光度計(jì)、MODEL550型酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；7500熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司等。

1.3方法

1.3.1分組及癲癇大鼠模型制備 36只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、假刺激組(s-rTMS組)及rTMS組，每組12只。NC組為正常飼養(yǎng)未進(jìn)行任何刺激正常大鼠；rTMS組大鼠行rTMS刺激，刺激參數(shù)：0.75 Hz，75%閾強(qiáng)度，20次/串，5串/d；s-rTMS組給予次數(shù)相同、聲音相似的假性刺激，均連續(xù)7 d。7 d后s-rTMS組及rTMS組腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，16～20 h后注射毛果蕓香堿35 mg/kg，注射毛果蕓香堿前30 min注射阿托品1 mg/kg，根據(jù)Racine分級(jí)〔11〕(0級(jí)：無(wú)任何反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：面部陣攣，包括眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼等；Ⅱ級(jí)：Ⅰ級(jí)反應(yīng)+節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：Ⅱ級(jí)反應(yīng)+前肢陣攣；Ⅳ級(jí)：Ⅲ級(jí)反應(yīng)+后肢站立；Ⅴ級(jí)：Ⅳ級(jí)反應(yīng)+摔倒)觀察大鼠癲癇發(fā)作程度，連續(xù)3次達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作即被認(rèn)為癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)即造模成功，SE點(diǎn)燃1 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg終止發(fā)作。NC組大鼠腹腔注射等量生理鹽水代替毛果蕓香堿，其余處理同s-rTMS組及rTMS組。

1.3.2抑郁樣行為學(xué)檢測(cè) 采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠抑郁樣行為。(1)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備圓柱形透明玻璃容器，直徑20 cm，高50 cm，水溫23～25 ℃，水深35 cm，使得大鼠在其中不能靠四肢或尾巴支撐桶底而把頭露出水面呼吸。實(shí)驗(yàn)前1 d進(jìn)行15 min適應(yīng)性訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠置于容器內(nèi)，記錄其在5 min內(nèi)累積不動(dòng)時(shí)間，其中“不動(dòng)”標(biāo)準(zhǔn)為：漂浮在水中不掙扎或僅保持頭部在水面以上或接觸水池底部超過(guò)1 s。(2)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的黑色敞箱中，箱底均勻劃分5 cm×5 cm小格，每次從同一方向放入，記錄大鼠5 min內(nèi)水平站立次數(shù)及垂直站立次數(shù)。

1.3.3焦慮樣行為學(xué)檢測(cè) 分別采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)及新穎環(huán)境抑制攝食測(cè)試檢測(cè)大鼠焦慮樣行為。(1)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)高架迷宮正中央，頭超封閉壁，使大鼠自由探索5 min，記錄大鼠進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)(OE)、封閉臂次數(shù)(CE)及封閉臂停留時(shí)間(CT)、開(kāi)放臂停留時(shí)間(OT)，計(jì)算總穿臂次數(shù)(TE)：OE+CE；進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)的比例(OE%)：OE/(OE+CE)× 100%；開(kāi)放臂停留時(shí)間比例(OT%)：OT/(OT+CT)×100%。(2)新穎環(huán)境抑制攝食測(cè)試：利用大鼠喜歡趨邊特性，檢測(cè)焦慮樣行為。大鼠禁食24 h后，保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜，然后將大鼠放入頂部開(kāi)放、底部劃分為大小均勻的15 cm× 15 cm方格木質(zhì)箱子的角落，中間擺放一顆食物，攝像頭記錄10 min內(nèi)大鼠從放進(jìn)盒子里到準(zhǔn)備進(jìn)食的攝食潛伏期，以此作為評(píng)價(jià)焦慮樣行為的指標(biāo)。

1.3.4海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 各組大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 ml/kg麻醉處死后斷頭取腦，分離海馬組織。采用Trizol試劑提取總RNA，濃度和純度檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-80℃中保存?zhèn)溆?。采用RT-qPCR擴(kuò)增miR-134、CREB及BDNF mRNA片段。引物序列：miR-134：上游：5′-GGGTGTGACTGGTTGAC-3′，下游：5′-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3′；U6：上游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；CREB：上游：5′-CCACTCAGCCGGGTACTACC-3′，下游：5′-CACCAGAGGCAGCTTGAACA-3′；BDNF：上游：5′-GCTGCTGGATGAGGACCAGA-3′，下游：5′-CCAAAA-GGCACTTGACTGCTG-3′;GAPDH：上游：5′-GTCG-ATGGCTAGTCGTAGCATCGAT-3′，下游：5′-TGCTA-GCTGGCATGCCCGATCGATC-3。RT-qPCR采用20 μl反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析miR-134、CREB及BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5海馬CREB、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)量檢測(cè) Western印跡檢測(cè)各組大鼠海馬CREB、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)情況。采用蛋白抽提試劑盒提取海馬總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0 mg蛋白樣品，80 mV電壓下6%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h，250 mA下聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋?zhuān)右豢筧nti-CREB(1∶1 000)、anti-p-CREB(1∶1 000)、anti-BDNF(1∶5 000)、anti-β-actin(1∶5 000)4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次20 min，添加二抗IgG(1∶5 000)37℃孵育1.5 h，顯色，曝片，觀察并分析各蛋白條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1rTMS對(duì)癲癇大鼠抑郁樣行為的影響 與NC組比較，s-rTMS組不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，水平站立次數(shù)及垂直站立次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組不動(dòng)時(shí)間顯著縮短，水平站立次數(shù)及垂直站立次數(shù)顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2rTMS對(duì)癲癇大鼠焦慮樣行為的影響 與NC組比較，s-rTMS組TE、OE%、OT%顯著減少，攝食潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組TE、OE%、OT%顯著增加，攝食潛伏期顯著縮短(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組抑郁樣、焦慮樣行為比較

2.3rTMS對(duì)癲癇大鼠海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響 與NC組比較，s-rTMS組miR-134相對(duì)表達(dá)量顯著降低，CREB及BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組miR-134相對(duì)表達(dá)量顯著增加，CREB及BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4rTMS對(duì)癲癇大鼠海馬CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)量的影響 與NC組比較，s-rTMS組p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與s-rTMS組比較，rTMS組p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表3。

表2 各組海馬miR-134、CREB及BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 Western印跡檢測(cè)海馬CREB、p-CREB及BDNF蛋白表達(dá)

表3 各組海馬p-CREB/CREB及BDNF蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)元壞死和凋亡、特異性突觸重塑、苔蘚纖維出牙等，進(jìn)而可促進(jìn)異常興奮性環(huán)路形成，發(fā)展為難治性癲癇〔12〕。近來(lái)rTMS成為抗癲癇的潛在治療手段，但文獻(xiàn)報(bào)道中rTMS治療癲癇的刺激參數(shù)各不相同，rTMS調(diào)節(jié)皮質(zhì)興奮性效應(yīng)與刺激頻率有關(guān)，通常高頻(>1 Hz)可增強(qiáng)皮質(zhì)興奮性，而低頻(≤1 Hz)可抑制皮質(zhì)興奮性〔13,14〕，Li等〔15〕研究報(bào)道，長(zhǎng)期間歇性低頻率rTMS可有效控制不服藥青少年癲癇患者的癲癇發(fā)作。Wang等〔16〕研究報(bào)道，低頻rTMS治療可改善癲癇大鼠抑郁、焦慮狀態(tài)，但不能減輕其癲癇發(fā)作程度。而有研究報(bào)道對(duì)右頂葉皮層的1 Hz rTMS會(huì)干擾短暫出現(xiàn)刺激的感知〔17〕。本研究結(jié)果提示癲癇大鼠出現(xiàn)抑郁、焦慮樣行為，模型制備成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)；提示rTMS可顯著改善癲癇大鼠抑郁及焦慮樣行為，有一定臨床應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)癲癇伴抑郁、焦慮樣行為障礙的影響及作用機(jī)制尚無(wú)明確定論。

miR-134是一種廣泛分布于腦內(nèi)海馬特殊小RNA，可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的微觀結(jié)構(gòu)及樹(shù)突棘大小，與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。王倩等〔18〕研究報(bào)道，難治性癲癇患者顳葉皮質(zhì)及癲癇動(dòng)物海馬中miR-134表達(dá)下降，CREB、p-CREB表達(dá)升高。Zhu等〔19〕研究報(bào)道，癲癇病大鼠海馬miR-134水平在3 d后明顯低于正常水平，并繼續(xù)維持在較低水平；而CREB和p-CREB水平在3 d后顯著升高，并繼續(xù)保持在較高水平，miR-134可通過(guò)抑制CREB和p-CREB表達(dá)抑制突觸可塑性。而Shen等〔20〕研究報(bào)道，白藜蘆醇對(duì)溫和應(yīng)激誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙神經(jīng)保護(hù)作用可能與下調(diào)miR-134、上調(diào)沉默調(diào)節(jié)蛋白(SIRT)1激活SIRT1/miR-134通路，進(jìn)而上調(diào)其下游海馬區(qū)CREB/BDNF表達(dá)有關(guān)。另Chen等〔21〕研究報(bào)道，單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂通過(guò)上調(diào)SIRT1、p-CREB、BDNF表達(dá)激活發(fā)育中的雄性大鼠海馬中SIRT1/CREB/BDNF通路，改善鉛誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷和腦損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，s-rTMS組miR-134相對(duì)表達(dá)量顯著降低；與s-rTMS組比較，rTMS組miR-134相對(duì)表達(dá)量顯著增加。CREB是核轉(zhuǎn)錄因子，被磷酸化活化后可進(jìn)一步激活其下游靶基因BDNF表達(dá)，影響神經(jīng)元的可塑性及遞質(zhì)合成，CREB/BDNF信號(hào)通路是抑郁樣行為及認(rèn)知功能障礙性疾病中重要相關(guān)通路〔22〕。提示低頻rTMS可抑制癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為可能與調(diào)控miR-134/CREB/BDNF通路有關(guān)，但miR-134是直接靶向CREB/BDNF通路還是通過(guò)靶向SIRT1間接影響CREB/BDNF通路在抑郁、焦慮樣行為中起作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，低頻rTMS可減輕癲癇大鼠抑郁、焦慮樣行為，可能與調(diào)控miR-134/CREB/BDNF通路有關(guān)。