趙婷 郭欣雨 鄭雨林 譚戈 李偲 張若男 吳艷，2 唐俊明，2

(湖北醫(yī)藥學院基礎(chǔ)醫(yī)學院 1研究所，湖北 十堰 442000；2生理學教研室)

骨骼肌是支持身體活動最重要的器官之一，其質(zhì)量和強度隨著年齡的增長而下降，這種現(xiàn)象被稱為骨骼肌減少癥〔1〕，該疾病嚴重影響老年人活動和生活質(zhì)量〔2〕。臨床觀察發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女骨骼肌減少癥與雌激素缺乏有關(guān)〔3〕，進一步動物實驗研究也證實雌激素不足可影響雌性小鼠的肌肉力量和骨骼肌再生，而外源性雌激素的補充可減少肌肉的損失和功能障礙〔4，5〕。骨骼肌細胞是由成肌細胞融合形成的多核細胞。小鼠骨骼肌成肌細胞(C2C12)在形態(tài)和特征上是一致的，可以無限次傳代培養(yǎng)，雌激素對C2C12的分化作用得到部分學者關(guān)注，但目前研究結(jié)論仍存在爭議〔6，7〕。本研究采用連續(xù)單次給予17β-雌二醇(E2)或其受體拮抗劑模擬升高或降低雌激素水平，觀察雌激素對C2C12增殖、遷移及分化的影響，探討雌激素是否通過影響骨骼肌自我更新或修復而參與骨骼肌萎縮過程。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 小鼠C2C12(中科院上海細胞庫)；DMEM培養(yǎng)基、馬血清(HS)和新生胎牛血清(美國Gibco公司)；17β-E2(美國Sigma公司)；anti-ERα、anti-ERβ(北京Bioss公司)；雌激素受體抑制劑ICI 182，780(美國Tocris Cookson Incorporation公司)；anti-肌球蛋白重鏈(MYHC)抗體、anti-肌細胞生成蛋白(MyoG)抗體(英國Abcam公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT，碧云天公司)。

1.2C2C12培養(yǎng)和誘導分化 將凍存的C2C12常規(guī)復蘇，接種于75 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)條件為10%胎牛血清+高糖DMEM培養(yǎng)基即為增殖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液1次，待細胞增殖融合達80%～90%時，按照1∶3的比例傳代。傳代的C2C12按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞融合達70%時，換用含2% HS的高糖DMEM分化培養(yǎng)基進行成肌誘導分化，當細胞分化4 d后，在光學顯微鏡下觀察見已經(jīng)形成典型的肌管，采用免疫熒光法檢測成肌細胞分化標志物MYHC的表達均呈強陽性，表明成肌細胞培養(yǎng)成功。

1.3C2C12雌激素受體表達檢測 Western印跡：取C2C12，經(jīng)放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解、離心收蛋白，行二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。按分組各上樣50 μg蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用TBST配制5%的脫脂奶粉低速搖床封閉40 min，分別放入含有α-Tubulin、ERα、ERβ等不同一抗的封閉袋中，4℃過夜，將條帶放入含有辣根過氧化酶標記的二抗(1∶10 000) 孵育液中2 h。最后用化學發(fā)光法顯色，在BioRad蛋白成像儀成像，并用Image J軟件測灰度值進行半定量分析。

1.4雌激素對C2C12增殖的影響 C2C12傳代后，在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至50%融合時，分為對照組、10-9mol/L E2組、10-8mol/L E2組、10-7mol/L E2組、10-6mol/L E2組及10-8mol/L E2+ICI182，780組，分別加入雌激素0 mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L及10-8mol/L +ICI182，780，每隔1日換液1次，培養(yǎng)5 d。采用MTT比色法檢測細胞增殖：取各組細胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，每孔加入10 μl MTT，孵育4 h。在全自動酶標儀上檢測570 nm光密度值(OD值)，評價C2C12增殖情況。

1.5雌激素對C2C12遷移的影響 細胞分組及干預方法同1.4，培養(yǎng)48 h。Transwell小室放置于預先準備好的 24孔板中，按上述條件培養(yǎng)箱中過夜，向Transwell小室下室中加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM高糖干細胞培養(yǎng)基。用無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸各組細胞，取200 μl細胞懸液(細胞總數(shù)約1×105個)加至Transwell上室。48 h后去除下室中的培養(yǎng)液，將小室置于4%多聚甲醛中固定15 min，擦去小室內(nèi)室膜上的細胞，結(jié)晶紫溶液(0.1%)染色 10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，顯微鏡下觀察，每孔隨機選取5個視野拍照，計數(shù)統(tǒng)計并分析。

1.6雌激素對C2C12分化的影響 2% HS誘導分化培養(yǎng)條件下，細胞分組方法同1.4。每隔1 d換液1次，培養(yǎng)4 d。①免疫熒光化學染色法：隨機選取5個視野，在MYHC熒光染色背景下計數(shù)核融合≥3的肌管形成數(shù)目。②Western印跡：取 C2C12，經(jīng)RIPA裂解、離心收蛋白，行BCA法進行蛋白定量。按分組各上50 μg蛋白，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)PVDF膜。用TBST配制的5%的脫脂奶粉低速搖床封閉40 min，分別放入含有α-Tubulin、MYHC、MyoG等不同一抗的封閉袋中，4℃過夜，將條帶放入含有辣根過氧化酶標記的二抗孵育液中2 h。最后用化學發(fā)光法顯色，在BioRad蛋白成像儀成像，并用Image J軟件測灰度值進行半定量分析。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1E2受體表達 對照組及不同濃度E2組均有ERα和ERβ表達，見圖1。進一步半定量分析顯示隨著E2濃度升高ERα表達也隨之升高，當E2濃度為10-6mol/L時，其表達量達最高值(P<0.05)，且10-7、10-6mol/L E2組與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而隨著E2濃度升高，ERβ在C2C12表達量呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢，在E2濃度為10-8mol/L時表達量最高(P<0.05)，與對照組差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

1～5：對照組、10-9 mol/L E2組、10-8 mol/L E2組、10-7 mol/L E2組、10-6 mol/L E2組圖1 Western印跡檢測不同濃度E2條件下C2C12雌激素受體表達

表1 Western印跡檢測ERα及ERβ表達相對值

2.2細胞增殖情況 第3天開始10-8mol/L E2組細胞增殖顯著高于對照組，且10-8mol/L E2+ ICI182,178組細胞增殖顯著低于10-8mol/L E2組(P<0.05)。見表2。

2.3各組細胞分化情況 與對照組相比，不同濃度E2組肌管形成數(shù)均顯著升高(P<0.05)，以10-8mol/L E2組促進C2C12肌管形成最為明顯，即在E2濃度≤10-8mol/L時MYHC表達及肌管形成數(shù)目均隨著E2濃度升高而增多，但當E2濃度>10-8mol/L時，卻呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，給予E2受體拮抗劑ICI182，780處理后，肌管形成數(shù)目均顯著低于10-8mol/L E2組(P<0.05)。見圖2，表3。

2.4各組細胞遷移情況 不同濃度E2組細胞遷移數(shù)雖然均高于對照組，但并非隨著E2濃度升高出現(xiàn)持續(xù)升高，而呈現(xiàn)出先升高后下降的變化趨勢。E2濃度≤10-8mol/L時，細胞遷移隨著E2濃度升高而增多；E2濃度>10-8mol/L時，隨著E2濃度升高，細胞遷移數(shù)逐漸下降，即10-8mol/L濃度的E2對C2C12細胞遷移促進作用最明顯,而給予E2受體拮抗劑ICI182，780處理后，遷移細胞數(shù)再次升高，但仍顯著高于對照組且顯著低于10-8mol/L E2組(P<0.05)。見表3、圖3。

表2 不同濃度E2對C2C12細胞增殖的影響

紅色代表MYHC染色陽性，藍色代表DAPI染色細胞核圖2 不同濃度E2對分化條件下C2C12細胞MYHC的表達(免疫熒光，×200)

表3 不同濃度雌激素組C2C12細胞遷移數(shù)、肌管形成數(shù)及MYHC和MyoG水平比較

圖3 不同濃度E2對C2C12遷移的影響(Transwell法結(jié)合結(jié)晶紫染色，×100)

2.5分化狀態(tài)C2C12 MYHC和MyoG表達 C2C12中MyoG的表達變化與MYHC變化規(guī)律一致，在E2濃度≤10-8mol/L時MYHC和MyoG表達均隨著E2濃度升高而增多，但當E2濃度>10-8mol/L時，卻均出現(xiàn)逐漸下降的趨勢，即10-8mol/L組MYHC及MyoG表達量最高(P<0.05)。半定量分析也呈現(xiàn)出同樣的結(jié)果，且統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)10-8mol/L組MYHC和MyoG的表達量與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。給予E2受體拮抗劑ICI182，780處理后，MyoG及MYHC水平均顯著低于10-8mol/L E2組(P<0.05)。見表3，圖4。

1～6：對照組、10-9 mol/L E2組、10-8 mol/L E2組、10-7 mol/L E2組、10-6 mol/L E2組、10-8 mol/L E2+ICI182,780組圖4 Western印跡檢測E2對分化狀態(tài)下C2C12 MYHC和MyoG表達的影響

3 討 論

骨骼肌分化是一個高度有組織的過程，涉及到多種基因的調(diào)節(jié)〔8，9〕，特別是在成肌細胞形成肌管的過程中，多種激素和細胞因子參與其中〔10～12〕。雌激素受體是雌激素發(fā)揮生物學效應的必要因素，本研究結(jié)果表明雌激素促進C2C12細胞增殖是通過與雌激素受體結(jié)合發(fā)揮作用的，且其濃度依賴性效應與雌激素受體α數(shù)量上調(diào)有關(guān)，這一結(jié)論與Ihionkhan等〔13〕報道內(nèi)皮細胞ERα的激活依賴于雌激素，其表達水平受雌激素的調(diào)控相一致。本研究結(jié)果表明，雌激素對C2C12細胞的分化效應是通過與雌激素受體結(jié)合后促進MyoG表達來實現(xiàn)的。這一研究結(jié)果與Scully等〔14〕研究相吻合。

本研究發(fā)現(xiàn)雌激素抑制了C2C12細胞的遷移，且隨著雌激素濃度升高，抑制作用增強。結(jié)合Deng等〔15〕的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素抑制了肝衛(wèi)星細胞的遷移，且這一效應與雌激素受體β的表達下降相關(guān)，本研究結(jié)果表明雌激素濃度依賴性抑制C2C12細胞遷移與ERβ下降有關(guān)。