張和平 謝榮 劉佳麗 李沁云 楊琨 馮江超

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，四川 南充 637000)

高血糖是引發(fā)糖尿病微血管并發(fā)癥的主要原因，而腎臟是糖尿病血管并發(fā)癥中常累及的器官，多數(shù)研究表明，糖尿病的發(fā)生，會使機(jī)體長期處于高血糖狀態(tài)，不僅經(jīng)多種方式損傷腎小球，還會損傷腎小管間質(zhì)，最終影響腎功能〔1〕。腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)的主要構(gòu)建細(xì)胞，與腎小管腎血管相互連接，當(dāng)其被活化后其細(xì)胞膜表面會出現(xiàn)較多活性物質(zhì)，產(chǎn)生多種作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化〔2〕。P2X7受體(R)是三磷酸腺苷(ATP)門控陽離子通道受體，屬于嘌呤受體P2X家族受體亞型之一，P2X7R由595個氨基酸殘基組成，由羥基端、氨基端、胞內(nèi)域、保守胞外環(huán)的兩次擴(kuò)膜蛋白所組成，在正常生理條件下，P2X7R在生長腎臟中極低表達(dá)，但在腎臟處于病理狀態(tài)下時，P2X7R表現(xiàn)為顯著升高現(xiàn)象〔3〕。近年來隨著臨床上對糖尿病腎病的深入研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路形成正負(fù)反饋機(jī)制參與此病的發(fā)展〔4～6〕。本文探討抑制P2X7R表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β1/p38MAPK信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料 腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞源于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科正常端腎臟組織。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：P2X7R序列設(shè)計、合成及慢病毒懸液制備(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；小鼠抗大鼠TGF-β1抗體(上海一基實業(yè)有限公司)；兔抗人p38MAPK抗體(武漢博歐特生物科技有限公司)；兔抗大鼠Caspase-3抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司)。

1.2P2X7R序列設(shè)計、合成及慢病毒懸液制備 根據(jù)siRNA設(shè)計原則，使用基因序列數(shù)據(jù)庫GenBank查找序列病獲得P2X7R基因序列，使用Ambion公司的在線設(shè)計軟件在P2X7R的序列中獲取特異序列作為干擾靶序列，之后利用基于局部比對算法的搜索工具(BLAST)分析設(shè)計序列的特異性，確定siRNA干擾靶序列及無同源性的陰性對照序列(siNC)，siRNA干擾靶序列及無同源性的陰性對照序列、慢病毒懸液均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。siRNA干擾靶序列：5′-GCCACAACTATACCACHAGAA-3′；siNC序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；慢病毒懸液規(guī)格均為1.0×10e11pfu/ml。

1.3腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞分離、鑒定 取川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科行腎腫瘤切除的正常端腎臟組織，將腎盂組織、腎白膜去除后分離髓質(zhì)、皮質(zhì)，將腎髓質(zhì)組織制備為1 mm3大小的組織塊，使用0.1%膠原酶溶液在溫度為37℃下消化后，過70、150目篩網(wǎng)，采用DMEM-F12培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清)收集細(xì)胞懸液，之后做腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞鑒定，使用倒置相差顯微鏡觀察所收集的細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)為梭形，采用免疫組化方法鑒定，細(xì)胞抗波形蛋白單抗為陽性、抗細(xì)胞角蛋白、抗desmin單抗為陰性即為人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞。

1.4高糖誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞 培養(yǎng)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，取對數(shù)生長期的培第3代細(xì)胞做細(xì)胞消化處理〔胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)〕，以1×104/ml的密度將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞處于亞融合狀態(tài)時使用無血清培養(yǎng)液孵育1 d，當(dāng)細(xì)胞處于相對靜止期后做分組處理。將細(xì)胞分為空白組、高糖組、過表達(dá)組、沉默組，其中空白組細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)液+5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)；高糖組使用DMEM完全培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)；過表達(dá)組細(xì)胞使用2 ml按照1∶1比例所混合的siNC P2X7R慢病毒懸液和DMEM培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)；沉默組細(xì)胞使用2 ml按照1∶1比例所混合的siRNA P2X7R慢病毒懸液和DMEM培養(yǎng)液+25 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞增殖能力檢測 采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖情況，使用含有10% 胎牛血清培養(yǎng)液配單個細(xì)胞懸液，細(xì)胞按7×103個/孔接種于96孔板，每孔體積200 μl，培養(yǎng)2～4 d后，每孔加入MTT繼續(xù)孵育4 h后停止。孔內(nèi)培養(yǎng)清液直接吸棄，懸浮細(xì)胞上的培養(yǎng)清液需離心后再吸棄，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩12 min，選擇570 nm波長，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測儀測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。最后根據(jù)細(xì)胞增殖率計算公式，細(xì)胞增殖率=(細(xì)胞組OD值/參照值-1)×100%，對各組細(xì)胞增殖率進(jìn)行計算。

1.6細(xì)胞凋亡能力檢測 使用DxFLEX流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司)檢測各組細(xì)胞凋亡情況，將細(xì)胞傳代至5孔板中，在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，加入0.25%胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心處理5 min，收集離心處理后的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復(fù)洗滌2次，每次洗滌3 min，再次離心收集細(xì)胞，加入1 ml碘化丙啶(PI)染液，在避光常溫下放置1 h，使用特異熒光標(biāo)記，標(biāo)記后在鞘液包裹下高速流動，流動期間發(fā)射光子，利用發(fā)光信號測量儀檢測光子數(shù)值，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.7各組細(xì)胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測 采用硫代巴比妥酸比色法檢測各組細(xì)胞MDA含量，采用均相競爭抑制原理放免法檢測各組細(xì)胞SOD含量。

1.8各組細(xì)胞TGF-β1/p38MAPK信號通路因子表達(dá)量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法測定各組細(xì)胞中TGF-β1/p38MAPK信號通路因子表達(dá)量，使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，以2 μg RNA作為初始模板，配制20 μl的總反應(yīng)體系，應(yīng)用Gene Amp PCR System 9700核酸擴(kuò)增儀做cDNA反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，之后4℃保持，以所合成的cDNA為模板，以β-actin作為內(nèi)參，配制20 μl反應(yīng)體系，使用美國ABI 7300實時熒光定量PCR系統(tǒng)做擴(kuò)增熒光定量，PCR條件：95℃預(yù)變性60 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。采用2-△△Ct方法計算TGF-β1/p38MAPK信號通路因子TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表達(dá)量。引物序列：TGF-β1上游：5′-ATTCCTGGC GTTACCTTGG-3′，下游：5′-ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3′；p38MAPK：上游：5′-CAGCCCACGGACCAAATA-3′，下游：5′-AACGAGCATCTTCTCCAGTA-3′；β-actin：上游：5′-CTGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游：5′-CGCAACTAAGTCATAGTCCGCC-3′。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗、獨(dú)立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞增殖及凋亡情況比較 高糖組、過表達(dá)組、沉默組細(xì)胞增殖率及凋亡率明顯高于空白組(P<0.05)；過表達(dá)組細(xì)胞增殖率明顯高于高糖組，凋亡率明顯低于高糖組(P<0.05)；沉默組細(xì)胞增殖率明顯低于高糖組，凋亡率明顯高于高糖組(P<0.05)；沉默組細(xì)胞增殖率明顯低于過表達(dá)組，凋亡率明顯高于過表達(dá)組(P<0.05)。見表1、圖1。

2.2各組細(xì)胞MDA、SOD水平比較 高糖組、過表達(dá)組、沉默組MDA水平明顯高于空白組，SOD水平明顯低于空白組(P<0.05)；過表達(dá)組MDA水平明顯高于高糖組，SOD水平明顯低于高糖組(P<0.05)；沉默組MDA水平明顯低于高糖組，SOD水平明顯高于高糖組(P<0.05)；沉默組MDA水平明顯低于過表達(dá)組，SOD水平明顯高于過表達(dá)組(P<0.05)。見表2。

2.3各組細(xì)胞TGF-β1/p38MAPK信號通路因子表達(dá)量比較 高糖組、過表達(dá)組、沉默組TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表達(dá)量均明顯高于空白組(P<0.05)；過表達(dá)組TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表達(dá)量均明顯高于高糖組(P<0.05)；沉默組TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表達(dá)量均明顯低于高糖組(P<0.05)；沉默組TGF-β1、p38MAPK、Caspase-3 mRNA表達(dá)量均明顯低于過表達(dá)組(P<0.05)。見表2。

表1 各組細(xì)胞增殖和凋亡情況比較

圖1 72 h時各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

表2 各組細(xì)胞MDA、SOD水平及TGF-β1/p38MAPK信號通路因子表達(dá)量比較

3 討 論

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因之一，其病變早期主要表現(xiàn)為高血糖所致的腎臟肥大、腎臟血流動力學(xué)紊亂、氧化應(yīng)激等，隨著病程的增加可引發(fā)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，當(dāng)上述病變發(fā)生后往往不可逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致此病的治療較為棘手，嚴(yán)重威脅著患者的生命安全〔7〕。因此尋找早期診治糖尿病腎病的靶點，對患者預(yù)后具有重要的意義。

P2X7R廣泛分布于腦、腎、肺、肝、肌肉、脾等多種組織中，主要在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上表達(dá)〔8,9〕。研究發(fā)現(xiàn)〔10〕，P2X7R參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，包括高血糖所致的腎功能損傷、腎毒性、腎血管梗阻所致的腎功能損傷、高血壓所致的腎損傷等。臨床研究發(fā)現(xiàn)〔11～13〕，糖尿病腎病發(fā)生后，P2X7R表達(dá)顯著升高，參與高血糖所致的腎功能損傷過程。基于前期研究，本文結(jié)果提示，抑制P2X7R表達(dá)可能經(jīng)抑制高血糖所誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，抑制增殖，促進(jìn)凋亡，進(jìn)而減輕腎損傷。

TGF-β1具有較為廣泛的生物學(xué)作用，可促進(jìn)機(jī)體微環(huán)境中的胞外基質(zhì)纖維生成、誘導(dǎo)局部血管增生，參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程，TGF-β1在促進(jìn)胞外基質(zhì)纖維生成與多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，其中MAPK通路為較為重要的一條通路，在機(jī)體處于高糖狀態(tài)時，此通路被激活，可將細(xì)胞外刺激信號傳遞至細(xì)胞核，與細(xì)胞損傷應(yīng)激、再生相關(guān)，可在一定程度上促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)展〔14～16〕。p38MAPK屬于MAPK通路成員之一，在被胞外刺激后，會被磷酸化，其磷酸化后會移位至細(xì)胞核，參與細(xì)胞生物學(xué)行為過程，調(diào)節(jié)TGF-β1表達(dá)〔17〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)〔18,19〕，高糖可激活p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)TGF-β1表達(dá)，而TGF-β1可增強(qiáng)p38MAPK活性，兩者相互作用參與腎小管間質(zhì)、腎小球損傷。另外有研究顯示〔20～22〕，TGF-β1/p38MAPK信號可引起機(jī)體氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激的發(fā)生可增加氧自由基，表現(xiàn)為MDA含量升高，SOD含量降低。本文結(jié)果提示，P2X7R表達(dá)可能經(jīng)作用于TGF-β1/p38MAPK信號通路來抑制高血糖所誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，抑制氧化應(yīng)激，抑制增殖，促進(jìn)凋亡，進(jìn)而減輕腎損傷。

綜上，抑制P2X7受體表達(dá)可經(jīng)影響高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞TGF-β1/p38MAPK信號通路，抑制氧化應(yīng)激，抑制增殖，促進(jìn)凋亡，進(jìn)而減輕腎損傷，但目前臨床上并未有研究認(rèn)為兩者作用與高糖誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞相關(guān)，且本文并未深入研究其具體作用機(jī)制，還需后續(xù)試驗進(jìn)一步加以證實。