李亞光 鄧同興 宋德志 李曉龍

(1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 漯河 462000；2廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

食管癌(ESCA)是全球第七大常見癌癥，死亡率居第六位〔1〕。ESCA可分為食管鱗癌(ESCC)和腺癌(EAC)〔2〕。ESCC在亞洲較為常見，占ESCA 90%以上，EAC發(fā)生在歐美國家〔3〕。中國是ESCA的高發(fā)國家，主要是ESCC。此外，ESCC在中國大陸的癌癥發(fā)病率排名第五，死亡率排名第四〔4〕。ESCA作為惡性腫瘤的主要組織病理學(xué)表現(xiàn)形式，是一種低生存率的致命性惡性腫瘤〔5〕。盡管有先進(jìn)的診斷和治療方法，但大多數(shù)病例診斷為晚期，由于轉(zhuǎn)移迅速，預(yù)后較差〔6〕。各種研究報道，超過50%的患者在早期診斷時就開始轉(zhuǎn)移。根據(jù)轉(zhuǎn)移的分期，惡性腫瘤可分為局部轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，已確定遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移階段可導(dǎo)致約50%的惡性腫瘤患者死亡〔7〕。ESCA 5年總生存率低于15%〔4，8〕。ESCA患者由于診斷晚、治療反應(yīng)差導(dǎo)致預(yù)后差〔9，10〕。三葉因子家族(TFF)由胃多肽(pS2)/TFF1、解痙肽(SP)/TFF2、腸三葉因子(ITF)/TFF3三種分泌肽組成。TFFs在胃腸道中大量表達(dá)，保護(hù)黏膜上皮細(xì)胞免受各種損傷，促進(jìn)上皮細(xì)胞〔11〕的連續(xù)性；然而，它們根據(jù)表達(dá)〔12〕組織的病理生理狀態(tài)表現(xiàn)出不同的作用。由于TFF1在腫瘤中表達(dá)量和腫瘤發(fā)生環(huán)境不同，其在腫瘤中的作用仍存在爭議。TFF1最初在乳腺癌細(xì)胞〔13〕中被發(fā)現(xiàn)，TFF1被認(rèn)為是一種致癌基因〔14，15〕，是激素治療陽性反應(yīng)的預(yù)測因子〔16，17〕。在不同的腫瘤組織(結(jié)腸癌，胰腺和卵巢)，與正常組織相比，TFF1與刺激細(xì)胞存活、遷移、侵襲性和腫瘤擴(kuò)散相關(guān)〔18～20〕。由于TFF1缺乏的小鼠會發(fā)展成抗幽門腺瘤，30%進(jìn)展為胃癌〔21〕。本研究旨在探討TFF1在ESCA中表達(dá)及其潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 實驗方法

1.1Oncomine數(shù)據(jù)庫分析 在Oncomine4.5數(shù)據(jù)庫中分析ESCA中TFF1的mRNA表達(dá)。Oncomine(www.oncomine.org)是目前世界上最大的致癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和綜合數(shù)據(jù)挖掘平臺，包含715個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集和來自86 733個癌癥組織和正常組織〔22〕的數(shù)據(jù)。本研究從Oncomine數(shù)據(jù)庫中獲得TFF1在不同癌組織及其相鄰正常對照樣本之間的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本分析并借鑒了一系列ESCA研究，包括Kim食管癌、Kimchi食管癌、Hao 食管癌研究。并分析了TFF1在食管癌組織中相對于其在正常組織中表達(dá)情況。采用t檢驗比較轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異。P值的常用值和差異倍數(shù)如下：P<0.01，差異倍數(shù)：1.5，基因排列：10%，數(shù)據(jù)類型：mRNA。

1.2GEPIA數(shù)據(jù)庫分析 利用GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)研究食管癌腫瘤組織與正常組織間TFF1的表達(dá)情況。GEPIA 是一種基于腫瘤基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(dá)(GTEx)項目的在線mRNA表達(dá)評估工具〔23〕。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了箱形圖和腫瘤分期圖分析，當(dāng)P<0.01時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析 cBioPortal(http：//cbioportal.org)是一個開放獲取的資源，用于探索、可視化和分析多維癌癥基因組數(shù)據(jù)，目前包含225項癌癥研究。我們用cBioPortal分析了TCGA ESCA樣品中TFF1的變化。搜索參數(shù)包括突變和mRNA表達(dá)。OncoPrint選項卡顯示TFF1中每個樣本的遺傳突變概況。并網(wǎng)絡(luò)可視化了來自公共通路數(shù)據(jù)庫的TFF1的生物相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用基于每個基因組改變頻率的顏色編碼和篩選選項。其中包括改變頻率較大的鄰近基因。以Kaplan-Meier圖顯示ESCA患者TFF1基因突變及其與OS的相關(guān)性，并進(jìn)行Log-rank檢驗，判斷生存曲線差異的意義。

1.4Linked Omics數(shù)據(jù)庫分析 Linked Omics數(shù)據(jù)庫(http：//www.linkes.org/ login.php)是一個基于web的平臺，用于分析32個TCGA癌癥相關(guān)多維數(shù)據(jù)集〔24〕。采用Linked Omics的Link Finder模塊研究TCGA ESCA隊列中與TFF1相關(guān)的差異表達(dá)基因，結(jié)果采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有的結(jié)果都在火山圖、熱圖或散點圖中以圖形形式呈現(xiàn)出來。Linked Omics的Link-Interpreter模塊對差異表達(dá)的基因進(jìn)行通路和網(wǎng)絡(luò)分析。應(yīng)用基于Web的Web Gestalt中的綜合功能分類數(shù)據(jù)庫〔25〕，對Link Finder結(jié)果中的數(shù)據(jù)進(jìn)行簽名和排序，使用GSEA對GO〔細(xì)胞組分(CC)、通路分析(BP)、分子功能(MF)〕、KEGG通路進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1TFF1在不同癌癥中的mRNA表達(dá)情況 首先，分析TFF1在不同腫瘤組織中的mRNA表達(dá)情況。Oncomine數(shù)據(jù)庫的主要功能是基因表達(dá)差異分析、基因表達(dá)與臨床相關(guān)性分析及多基因共表達(dá)分析。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫檢測TFF1 mRNA在不同腫瘤和正常臨床標(biāo)本中的表達(dá)。最終，650個數(shù)據(jù)集，包括80 551個樣本被選中，與正常組織相比，TFF1的mRNA在頭與中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌及胰腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，而在結(jié)直腸癌、腎癌及惡性間葉腫瘤中表達(dá)下調(diào)(圖1)。提示TFF1的轉(zhuǎn)錄水平主要取決于腫瘤類型。

2.2TFF1在ESCA中的表達(dá)情況 從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中評估TFF1在多個ESCA研究中的轉(zhuǎn)錄水平。Oncomine4.5 分析食管癌中 TFF1 mRNA水平顯著高于正常組織(P<0.001，圖2A)，差異倍數(shù)均遠(yuǎn)大于2，且TFF1在基于mRNA表達(dá)的前1%的排名中。 其中 Kim 食管癌數(shù)據(jù)集(P<0.001，差異倍數(shù)為173.191)、Kimchi 食管癌數(shù)據(jù)集(P<0.001，差異倍數(shù)為49.848)、食管癌數(shù)據(jù)集(P<0.001，差異倍數(shù)為77.119)。在TCGA中182例ESCA樣本中，在腫瘤及腫瘤等級的亞群分析中，同樣顯示TFF1為高轉(zhuǎn)錄，且TFF1在Ⅰ期中表達(dá)最高(圖2B)。因此，TFF1表達(dá)可能是ESCA的潛在診斷指標(biāo)。

左列代表高表達(dá)，右側(cè)代表低表達(dá)。 以下參數(shù)用作閾值：P<0.000 1，差異倍數(shù) >2 和基因排名前 10%圖1 TFF1在不同癌癥類型中的mRNA表達(dá)

2.3ESCA中TFF1的基因組突變情況 使用cBioPortal根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中ESCA患者的測序數(shù)據(jù)，確定ESCA中TFF1改變的類型和頻率。265例ESCA患者中有10例(4%)TFF1發(fā)生改變。這些改變分別為缺失8例(3%)、擴(kuò)增2例(1%)，因此，缺失是ESCA中最常見的TFF1突變類型。

此外，Kaplan-Meier圖顯示，TFF1基因突變與ESCA患者較短的OS有關(guān)(圖3A，P=0.025 8)。這些結(jié)果提示，TFF1基因的突變也可能顯著影響ESCA患者的預(yù)后。接下來想確定TFF1在ESCA中的生物相互作用網(wǎng)絡(luò)。為此，使用cBioPortal中的基因網(wǎng)絡(luò)(Network)，可以進(jìn)一步分析與TFF1相互作用的基因。網(wǎng)絡(luò)包含13個節(jié)點，包括1個查詢基因TFF1和12個TFF1鄰近基因。相互作用類型來源于生物途徑交換(BioPAX)：淺色連接表示第一種蛋白控制了改變第二種蛋白狀態(tài)的反應(yīng)；深色連接表明這些蛋白質(zhì)是同一復(fù)合體的成員。顏色的深淺代表突變的程度。顏色較深節(jié)點結(jié)包括核受體輔助活化因子1，2，3，雌激素受體1及N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶，這些基因在EACA中突變增加(圖3B)。

A:TFF1在ESCA組織和正常組織間的表達(dá)；B：在ESCA不同分期TFF1 mRNA的表達(dá)圖2 TFF1在ESCA中的表達(dá)情況及ESCA不同分病理分期中的表達(dá)情況(GEPIA)

A：TFF1在遺傳改變與較短的OS相關(guān)；B：TFF在ESCA中的生物相互作用網(wǎng)絡(luò)。TFF1是種子基因(用粗邊框表示)圖3 ESCA中TFF1生物相互作用網(wǎng)絡(luò)及其與ESCA患者的OS關(guān)聯(lián)的分析(cBioPortal)

2.4ESCA中與TFF1相關(guān)的共表達(dá)基因分析 利用Linked Omics功能模塊分析TCGA中184例ESCA患者的mRNA測序數(shù)據(jù)。從火山圖(圖4A)可以看出，5 370個基因(暗紅點)與TFF1呈顯著正相關(guān)，896個基因(暗綠點)與TFF1呈顯著負(fù)相關(guān)。圖4B，4C所示為50個與TFF1呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)的重要基因。TFF1顯示強(qiáng)陽性表達(dá)與鈣蛋白酶8(CAPN8，r=0.90，P<0.001)，組織蛋白酶E(CTSE，r=0.89，P<0.001)，再生基因4(REG4，r=0.88，P<0.001)等具有強(qiáng)相關(guān)性。

2.5ESCA中與TFF1相關(guān)的共表達(dá)基因GO和KEGG通路分析 基因集富集分析(GSEA)的GO項分析表明，與TFF1相關(guān)的差異表達(dá)基因主要位于微體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體中，主要參與細(xì)胞運輸、核苷酸-糖代謝過程和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運蛋白等生理過程。它們的分子功能主要有脂酶活性激活、羧酸酯水解酶活性激活及作用于糖基鍵的水解酶活性激活等(圖5A～5C)。KEGG通路分析顯示，TFF1可能通過參與NF-κB信號通路，Hippo信號通路等在ESCA中發(fā)揮作用(圖5D)。

A:TFF1與 ESCA中差異表達(dá)基因之間的相關(guān)性；B、C：熱圖顯示在ESCA 中與TFF1 正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因(前 50 名);紅色表示正相關(guān)，綠色表示負(fù)相關(guān)圖4 ESCA中與TFF1相關(guān)的差異表達(dá)基因(Linked Omics)

圖5 ESCA中TFF1的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

3 討 論

TFF1是三種TFF之一，是一種抗蛋白酶肽，其中包含一個保守的三環(huán)結(jié)構(gòu)域，稱為TFF結(jié)構(gòu)域〔26～28〕，其主要功能是維持胃腸黏膜的完整性，保護(hù)和修復(fù)受損的上皮細(xì)胞〔11〕。TFF3過表達(dá)常見于胰腺〔29〕、肝細(xì)胞〔30〕、結(jié)腸〔31〕、胃癌〔32〕，與腫瘤分級及預(yù)后不良有關(guān)〔33，34〕。胃癌通常表現(xiàn)為TFF1表達(dá)水平降低，TFF1敲除小鼠更容易發(fā)生胃癌〔35〕。TFF1在 結(jié)腸、胰腺和卵巢腫瘤組織中表達(dá)水平較高，與正常腫瘤組織相比，且與刺激細(xì)胞存活、遷移、侵襲性和腫瘤擴(kuò)散相關(guān)。表明TFF1是一種潛在的腫瘤標(biāo)記物〔18～20〕。

本研究結(jié)果顯示，在ESCA患者中，TFF1過表達(dá)，且其mRNA表達(dá)與患者的個體癌癥分期顯著相關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)ESCA患者TFF1的突變率為4%，且缺失是ESCA中最常見的TFF1突變類型，TFF1基因的突變也可能顯著影響ESCA患者的預(yù)后。功能網(wǎng)絡(luò)分析表明，TFF1可能通過參與NF-κB信號通路，Hippo信號通路等在ESCA中發(fā)揮作用。本研究數(shù)據(jù)表明TFF1的在ESCC的早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。TFF1損傷后上調(diào)，參與黏膜完整性的維持，參與胃的個體發(fā)生〔36〕。在胃癌中，TFF1的表達(dá)減少可以有助于促炎和抗凋亡基因的誘導(dǎo)激活NF-κB途徑〔37〕。TFF1在胃中被分為抑癌基因，在其他腫瘤類型中可能也有類似的作用〔38，39〕。例如，在體內(nèi)和體外，TFF1的缺失增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞系MCF7的致瘤能力。同樣，TFF1-KO也通過7，12-二甲基苯蒽(DMBA)誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生模型〔39〕，增強(qiáng)卵巢和肺的腫瘤形成。之前的研究表明TFF1在Barrett食管中上調(diào)，這是一種癌前狀態(tài)，會增加食管腺癌發(fā)生的風(fēng)險。我們的結(jié)果證實了之前的觀察〔40，41〕。這表明TFF1的表達(dá)可能是由酸反流引起的損傷引起的，而酸反流與Barrett食管有關(guān)。

最近的研究表明，EAC在分子改變方面與胃腺癌相似，而ESCC更接近于頭頸部的鱗癌〔42〕。然而，值得注意的是EAC與染色體不穩(wěn)定性胃癌密切相關(guān)，這兩種腫瘤明顯不同于埃巴病毒感染、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性相關(guān)的胃腺癌。由于針對胃癌中TFF1負(fù)調(diào)控的研究沒有考慮到這些分子亞群，因此很難確定TFF1缺失是該類型胃癌的共同特征還是亞群特異性的。研究發(fā)現(xiàn)〔43〕，在頭頸部癌癥患者中，上呼吸消化道的鱗狀上皮細(xì)胞發(fā)生改變。在這種情況下，TFF1在早期食管黏膜中作為生物標(biāo)志物的表達(dá)的改變，與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者有最大的相關(guān)性，不僅可以用作早期診斷，也能顯示患者更有可能產(chǎn)生食管第二原發(fā)腫瘤(SPTE)。在唾液腺腫瘤中，相對于健康組織〔44〕，TFF1、TFF2、TFF3表達(dá)水平較高，而口腔鱗狀細(xì)胞癌中，TFF2、TFF3表達(dá)水平較低，而TFF1表達(dá)水平較高。功能網(wǎng)絡(luò)分析表明，TFF1可能通過參與NF-κB信號通路，Hippo信號通路等在ESCA中發(fā)揮作用。具體通過哪個主要途徑發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步證實。

綜上，ESCA患者TFF1高表達(dá)與臨床癌癥階段等級有關(guān)，在腫瘤Ⅰ期表達(dá)最高。此外，ESCA患者TFF1的突變以缺失為主及TFF1的基因突變與較短的OS有關(guān)。這些結(jié)果表明TFF1可能是一種新的腫瘤標(biāo)志物，為ESCA的診斷和治療提供新的靶點和策略。