李亞光 鄧同興 宋德志 李曉龍
(1漯河醫(yī)學高等??茖W?;A醫(yī)學部,河南 漯河 462000;2廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院)
食管癌(ESCA)是全球第七大常見癌癥,死亡率居第六位〔1〕。ESCA可分為食管鱗癌(ESCC)和腺癌(EAC)〔2〕。ESCC在亞洲較為常見,占ESCA 90%以上,EAC發(fā)生在歐美國家〔3〕。中國是ESCA的高發(fā)國家,主要是ESCC。此外,ESCC在中國大陸的癌癥發(fā)病率排名第五,死亡率排名第四〔4〕。ESCA作為惡性腫瘤的主要組織病理學表現形式,是一種低生存率的致命性惡性腫瘤〔5〕。盡管有先進的診斷和治療方法,但大多數病例診斷為晚期,由于轉移迅速,預后較差〔6〕。各種研究報道,超過50%的患者在早期診斷時就開始轉移。根據轉移的分期,惡性腫瘤可分為局部轉移和遠處轉移。此外,已確定遠處轉移階段可導致約50%的惡性腫瘤患者死亡〔7〕。ESCA 5年總生存率低于15%〔4,8〕。ESCA患者由于診斷晚、治療反應差導致預后差〔9,10〕。三葉因子家族(TFF)由胃多肽(pS2)/TFF1、解痙肽(SP)/TFF2、腸三葉因子(ITF)/TFF3三種分泌肽組成。TFFs在胃腸道中大量表達,保護黏膜上皮細胞免受各種損傷,促進上皮細胞〔11〕的連續(xù)性;然而,它們根據表達〔12〕組織的病理生理狀態(tài)表現出不同的作用。由于TFF1在腫瘤中表達量和腫瘤發(fā)生環(huán)境不同,其在腫瘤中的作用仍存在爭議。TFF1最初在乳腺癌細胞〔13〕中被發(fā)現,TFF1被認為是一種致癌基因〔14,15〕,是激素治療陽性反應的預測因子〔16,17〕。在不同的腫瘤組織(結腸癌,胰腺和卵巢),與正常組織相比,TFF1與刺激細胞存活、遷移、侵襲性和腫瘤擴散相關〔18~20〕。由于TFF1缺乏的小鼠會發(fā)展成抗幽門腺瘤,30%進展為胃癌〔21〕。本研究旨在探討TFF1在ESCA中表達及其潛在的基因調控網絡。
1.1Oncomine數據庫分析 在Oncomine4.5數據庫中分析ESCA中TFF1的mRNA表達。Oncomine(www.oncomine.org)是目前世界上最大的致癌基因芯片數據庫和綜合數據挖掘平臺,包含715個基因表達數據集和來自86 733個癌癥組織和正常組織〔22〕的數據。本研究從Oncomine數據庫中獲得TFF1在不同癌組織及其相鄰正常對照樣本之間的轉錄表達。本分析并借鑒了一系列ESCA研究,包括Kim食管癌、Kimchi食管癌、Hao 食管癌研究。并分析了TFF1在食管癌組織中相對于其在正常組織中表達情況。采用t檢驗比較轉錄表達的差異。P值的常用值和差異倍數如下:P<0.01,差異倍數:1.5,基因排列:10%,數據類型:mRNA。
1.2GEPIA數據庫分析 利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)研究食管癌腫瘤組織與正常組織間TFF1的表達情況。GEPIA 是一種基于腫瘤基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(GTEx)項目的在線mRNA表達評估工具〔23〕。在此基礎上進行了箱形圖和腫瘤分期圖分析,當P<0.01時,認為差異有統計學意義。
1.3cBioPortal數據庫分析 cBioPortal(http://cbioportal.org)是一個開放獲取的資源,用于探索、可視化和分析多維癌癥基因組數據,目前包含225項癌癥研究。我們用cBioPortal分析了TCGA ESCA樣品中TFF1的變化。搜索參數包括突變和mRNA表達。OncoPrint選項卡顯示TFF1中每個樣本的遺傳突變概況。并網絡可視化了來自公共通路數據庫的TFF1的生物相互作用網絡,使用基于每個基因組改變頻率的顏色編碼和篩選選項。其中包括改變頻率較大的鄰近基因。以Kaplan-Meier圖顯示ESCA患者TFF1基因突變及其與OS的相關性,并進行Log-rank檢驗,判斷生存曲線差異的意義。
1.4Linked Omics數據庫分析 Linked Omics數據庫(http://www.linkes.org/ login.php)是一個基于web的平臺,用于分析32個TCGA癌癥相關多維數據集〔24〕。采用Linked Omics的Link Finder模塊研究TCGA ESCA隊列中與TFF1相關的差異表達基因,結果采用Pearson相關系數進行統計學分析。所有的結果都在火山圖、熱圖或散點圖中以圖形形式呈現出來。Linked Omics的Link-Interpreter模塊對差異表達的基因進行通路和網絡分析。應用基于Web的Web Gestalt中的綜合功能分類數據庫〔25〕,對Link Finder結果中的數據進行簽名和排序,使用GSEA對GO〔細胞組分(CC)、通路分析(BP)、分子功能(MF)〕、KEGG通路進行分析。
2.1TFF1在不同癌癥中的mRNA表達情況 首先,分析TFF1在不同腫瘤組織中的mRNA表達情況。Oncomine數據庫的主要功能是基因表達差異分析、基因表達與臨床相關性分析及多基因共表達分析。利用Oncomine數據庫檢測TFF1 mRNA在不同腫瘤和正常臨床標本中的表達。最終,650個數據集,包括80 551個樣本被選中,與正常組織相比,TFF1的mRNA在頭與中樞神經系統癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌及胰腺癌中表達顯著上調,而在結直腸癌、腎癌及惡性間葉腫瘤中表達下調(圖1)。提示TFF1的轉錄水平主要取決于腫瘤類型。
2.2TFF1在ESCA中的表達情況 從TCGA和GEO數據庫中評估TFF1在多個ESCA研究中的轉錄水平。Oncomine4.5 分析食管癌中 TFF1 mRNA水平顯著高于正常組織(P<0.001,圖2A),差異倍數均遠大于2,且TFF1在基于mRNA表達的前1%的排名中。 其中 Kim 食管癌數據集(P<0.001,差異倍數為173.191)、Kimchi 食管癌數據集(P<0.001,差異倍數為49.848)、食管癌數據集(P<0.001,差異倍數為77.119)。在TCGA中182例ESCA樣本中,在腫瘤及腫瘤等級的亞群分析中,同樣顯示TFF1為高轉錄,且TFF1在Ⅰ期中表達最高(圖2B)。因此,TFF1表達可能是ESCA的潛在診斷指標。
左列代表高表達,右側代表低表達。 以下參數用作閾值:P<0.000 1,差異倍數 >2 和基因排名前 10%圖1 TFF1在不同癌癥類型中的mRNA表達
2.3ESCA中TFF1的基因組突變情況 使用cBioPortal根據TCGA數據庫中ESCA患者的測序數據,確定ESCA中TFF1改變的類型和頻率。265例ESCA患者中有10例(4%)TFF1發(fā)生改變。這些改變分別為缺失8例(3%)、擴增2例(1%),因此,缺失是ESCA中最常見的TFF1突變類型。
此外,Kaplan-Meier圖顯示,TFF1基因突變與ESCA患者較短的OS有關(圖3A,P=0.025 8)。這些結果提示,TFF1基因的突變也可能顯著影響ESCA患者的預后。接下來想確定TFF1在ESCA中的生物相互作用網絡。為此,使用cBioPortal中的基因網絡(Network),可以進一步分析與TFF1相互作用的基因。網絡包含13個節(jié)點,包括1個查詢基因TFF1和12個TFF1鄰近基因。相互作用類型來源于生物途徑交換(BioPAX):淺色連接表示第一種蛋白控制了改變第二種蛋白狀態(tài)的反應;深色連接表明這些蛋白質是同一復合體的成員。顏色的深淺代表突變的程度。顏色較深節(jié)點結包括核受體輔助活化因子1,2,3,雌激素受體1及N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶,這些基因在EACA中突變增加(圖3B)。
A:TFF1在ESCA組織和正常組織間的表達;B:在ESCA不同分期TFF1 mRNA的表達圖2 TFF1在ESCA中的表達情況及ESCA不同分病理分期中的表達情況(GEPIA)
A:TFF1在遺傳改變與較短的OS相關;B:TFF在ESCA中的生物相互作用網絡。TFF1是種子基因(用粗邊框表示)圖3 ESCA中TFF1生物相互作用網絡及其與ESCA患者的OS關聯的分析(cBioPortal)
2.4ESCA中與TFF1相關的共表達基因分析 利用Linked Omics功能模塊分析TCGA中184例ESCA患者的mRNA測序數據。從火山圖(圖4A)可以看出,5 370個基因(暗紅點)與TFF1呈顯著正相關,896個基因(暗綠點)與TFF1呈顯著負相關。圖4B,4C所示為50個與TFF1呈負相關和正相關的重要基因。TFF1顯示強陽性表達與鈣蛋白酶8(CAPN8,r=0.90,P<0.001),組織蛋白酶E(CTSE,r=0.89,P<0.001),再生基因4(REG4,r=0.88,P<0.001)等具有強相關性。
2.5ESCA中與TFF1相關的共表達基因GO和KEGG通路分析 基因集富集分析(GSEA)的GO項分析表明,與TFF1相關的差異表達基因主要位于微體、內質網膜和高爾基體中,主要參與細胞運輸、核苷酸-糖代謝過程和內質網轉運蛋白等生理過程。它們的分子功能主要有脂酶活性激活、羧酸酯水解酶活性激活及作用于糖基鍵的水解酶活性激活等(圖5A~5C)。KEGG通路分析顯示,TFF1可能通過參與NF-κB信號通路,Hippo信號通路等在ESCA中發(fā)揮作用(圖5D)。
A:TFF1與 ESCA中差異表達基因之間的相關性;B、C:熱圖顯示在ESCA 中與TFF1 正相關和負相關的基因(前 50 名);紅色表示正相關,綠色表示負相關圖4 ESCA中與TFF1相關的差異表達基因(Linked Omics)
圖5 ESCA中TFF1的GO功能注釋和KEGG通路富集分析
TFF1是三種TFF之一,是一種抗蛋白酶肽,其中包含一個保守的三環(huán)結構域,稱為TFF結構域〔26~28〕,其主要功能是維持胃腸黏膜的完整性,保護和修復受損的上皮細胞〔11〕。TFF3過表達常見于胰腺〔29〕、肝細胞〔30〕、結腸〔31〕、胃癌〔32〕,與腫瘤分級及預后不良有關〔33,34〕。胃癌通常表現為TFF1表達水平降低,TFF1敲除小鼠更容易發(fā)生胃癌〔35〕。TFF1在 結腸、胰腺和卵巢腫瘤組織中表達水平較高,與正常腫瘤組織相比,且與刺激細胞存活、遷移、侵襲性和腫瘤擴散相關。表明TFF1是一種潛在的腫瘤標記物〔18~20〕。
本研究結果顯示,在ESCA患者中,TFF1過表達,且其mRNA表達與患者的個體癌癥分期顯著相關。并且發(fā)現ESCA患者TFF1的突變率為4%,且缺失是ESCA中最常見的TFF1突變類型,TFF1基因的突變也可能顯著影響ESCA患者的預后。功能網絡分析表明,TFF1可能通過參與NF-κB信號通路,Hippo信號通路等在ESCA中發(fā)揮作用。本研究數據表明TFF1的在ESCC的早期診斷中具有潛在的應用價值。TFF1損傷后上調,參與黏膜完整性的維持,參與胃的個體發(fā)生〔36〕。在胃癌中,TFF1的表達減少可以有助于促炎和抗凋亡基因的誘導激活NF-κB途徑〔37〕。TFF1在胃中被分為抑癌基因,在其他腫瘤類型中可能也有類似的作用〔38,39〕。例如,在體內和體外,TFF1的缺失增強了乳腺癌細胞系MCF7的致瘤能力。同樣,TFF1-KO也通過7,12-二甲基苯蒽(DMBA)誘導的腫瘤發(fā)生模型〔39〕,增強卵巢和肺的腫瘤形成。之前的研究表明TFF1在Barrett食管中上調,這是一種癌前狀態(tài),會增加食管腺癌發(fā)生的風險。我們的結果證實了之前的觀察〔40,41〕。這表明TFF1的表達可能是由酸反流引起的損傷引起的,而酸反流與Barrett食管有關。
最近的研究表明,EAC在分子改變方面與胃腺癌相似,而ESCC更接近于頭頸部的鱗癌〔42〕。然而,值得注意的是EAC與染色體不穩(wěn)定性胃癌密切相關,這兩種腫瘤明顯不同于埃巴病毒感染、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性相關的胃腺癌。由于針對胃癌中TFF1負調控的研究沒有考慮到這些分子亞群,因此很難確定TFF1缺失是該類型胃癌的共同特征還是亞群特異性的。研究發(fā)現〔43〕,在頭頸部癌癥患者中,上呼吸消化道的鱗狀上皮細胞發(fā)生改變。在這種情況下,TFF1在早期食管黏膜中作為生物標志物的表達的改變,與頭頸部鱗狀細胞癌患者有最大的相關性,不僅可以用作早期診斷,也能顯示患者更有可能產生食管第二原發(fā)腫瘤(SPTE)。在唾液腺腫瘤中,相對于健康組織〔44〕,TFF1、TFF2、TFF3表達水平較高,而口腔鱗狀細胞癌中,TFF2、TFF3表達水平較低,而TFF1表達水平較高。功能網絡分析表明,TFF1可能通過參與NF-κB信號通路,Hippo信號通路等在ESCA中發(fā)揮作用。具體通過哪個主要途徑發(fā)揮作用,有待進一步證實。
綜上,ESCA患者TFF1高表達與臨床癌癥階段等級有關,在腫瘤Ⅰ期表達最高。此外,ESCA患者TFF1的突變以缺失為主及TFF1的基因突變與較短的OS有關。這些結果表明TFF1可能是一種新的腫瘤標志物,為ESCA的診斷和治療提供新的靶點和策略。