張艷杰 侯樹(shù)慧 王彩霞 劉鵬妹

(1包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2包頭市第四醫(yī)院)

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)冠心病患者達(dá)1 100萬(wàn)例，其中以老年患者為主，且患病率和死亡率呈上升趨勢(shì)〔1〕。動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，參與冠心病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程〔2〕。單核細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟，單核細(xì)胞在血管內(nèi)膜表面黏附，之后向主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移，分化成巨噬細(xì)胞，最終形成泡沫細(xì)胞〔3〕。相關(guān)研究顯示，趨化因子調(diào)控單核細(xì)胞的聚集活性，趨化素樣因子超家族成員(CKLFSF)在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔4〕，CKLFSF6基因是成員之一，目前關(guān)于其表達(dá)水平與老年冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究仍未見(jiàn)系統(tǒng)研究報(bào)道。本研究擬分析CKLFSF6與老年冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，并使用人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEcs)和人單核細(xì)胞(THP-1)在體外進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究，探討CKLFSF6在冠心病發(fā)生中的相關(guān)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2019年3月至2020年5月在包頭市第四醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈造影檢查的老年患者158例。其中右冠脈、左前降支、左回旋支及主要分支中1支及以上狹窄程度>50% 88例為研究組，未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)的非冠心病患者70例為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染性疾病、免疫性疾病、惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、甲狀腺疾病者。納入受試者均自愿參與本研究，簽署知情同意書(shū)。

1.2材料與主要試劑 HAEcs和THP-1均購(gòu)于北京諾為生物有限公司。胎牛血清、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于北京沃卡威生物有限公司；Transwells小室購(gòu)于上海玉博生物有限公司；Trizol總RNA抽提試劑盒購(gòu)于上海百研生物有限公司；鼠抗人血管細(xì)胞黏附因子單克隆抗體、鼠抗人E-選擇素蛋白單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及相應(yīng)的二抗購(gòu)于北京沃卡威生物有限公司。

1.3資料收集和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 收集患者的人口學(xué)特征及吸煙史、合并糖尿病、合并高血壓情況。采集兩組清晨空腹外周靜脈血5 ml，取3 ml在室溫條件下3 000 r/min離心10 min，分裝血清和血漿，-80℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平及血漿CKLFSF6 蛋白表達(dá)水平。取剩余的2 ml空腹外周靜脈血，Trizol總RNA抽提試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行熒光定量PCR反應(yīng)，CKLFSF6引物序列由北京中科瑞泰生物有限公司設(shè)計(jì)、合成，CKLFSF6上游引物：5′-GAGTTGACTTAACGCTGAGTGCTGTCTCAAC-3′，下游引物：5′-TGCGTTTAAGCACTTCGAAACGACTGCTTTG-3′。β-actin上游引物：5′-TGGAGCCTGGGACGTGACCTATCGTG-3′，下游引物：5′-CAAGGTATAAACAGCATAGGTGCAC-3′。反應(yīng)條件：94℃ 40 s，60℃ 30 s，95℃ 40 s，60℃ 10 s。取4 μl擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)CKLFSF6 mRNA表達(dá)水平。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) HAEcs和THP-1均接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/瓶，使用含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，在37℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)入離心管中，4℃恒溫2 000 r/min離心10 min，去上清后將細(xì)胞懸液混勻，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 過(guò)表達(dá)和低表達(dá)CKLFSF6腺病毒由武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司包裝。按1×105個(gè)/孔的密度將HAEcs接種至6孔板中，37℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞80%以上融合時(shí)轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率>90%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分為正常對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染，僅常規(guī)培養(yǎng))、過(guò)表達(dá)CKLFSF6組(腺病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)CKLFSF6質(zhì)粒)及低表達(dá)CKLFSF6組(腺病毒轉(zhuǎn)染低表達(dá)CKLFSF6質(zhì)粒)。

1.6細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將3組HAEcs細(xì)胞分別接種于Transwell下室，細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)，加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液至600 μl，培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)。將THP-1接種于Transwell上室，細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)，加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液至200 μl，37℃ 5%CO2培養(yǎng)12 h，取出Transwell上室，10%多聚甲醛溶液固定后染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.7細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 將3組HAEcs接種至6孔板中，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，4℃ 5%CO2培養(yǎng)12 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆?。取THP-1適量，加入離心管中，4℃恒溫2 000 r/min離心10 min，加入含10%胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液和10 mmol/L鈣黃綠素，避光靜置30 min，洗滌后行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將THP-1鋪于含HAEcs的6孔板中，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，避光靜置2 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，洗滌后加入適量RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.8Western印跡檢測(cè)HAEcs中血管細(xì)胞黏附因子和E-選擇素蛋白表達(dá)水平 RIPA裂解液提取3組HAEcs總蛋白，定量后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目標(biāo)蛋白，帶電濕法轉(zhuǎn)膜后封閉，滴加稀釋倍數(shù)為1∶300的鼠抗人血管細(xì)胞黏附因子單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶500的鼠抗人E-選擇素蛋白單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶1 000的鼠抗人β-actin單克隆抗體，4℃過(guò)夜，滴加稀釋倍數(shù)為1∶2 000的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫反應(yīng)2 h，E-Gel Imager凝膠成像分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組人口學(xué)特征和血脂指標(biāo)比較 研究組吸煙史、糖尿病、高血壓比例及總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組男性比例、年齡、體重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2兩組CKLFSF6 mRNA和血漿蛋白表達(dá)比較 研究組CKLFSF6 mRNA表達(dá)、CKLFSF6血漿蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 兩組人口學(xué)特征和臨床指標(biāo)比較

表2 兩組CKLFSF6 mRNA和血漿蛋白表達(dá)比較

2.3老年冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析 以老年人群中是否發(fā)生冠心病為因變量，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析顯示，吸煙史、糖尿病、高血壓、CKLFSF6基因表達(dá)是冠心病發(fā)生的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4各組細(xì)胞遷移和黏附能力比較 過(guò)表達(dá)CKLFSF6組THP-1細(xì)胞遷移數(shù)量和黏附數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組，低表達(dá)CKLFSF6組明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表3 老年冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析

表4 各組THP-1細(xì)胞遷移數(shù)量及HAEcs中血管細(xì)胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達(dá)水平比較

2.5各組HAEcs中血管細(xì)胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達(dá)比較 過(guò)表達(dá)CKLFSF6組血管細(xì)胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，低表達(dá)CKLFSF6組明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表4，圖1。

1～3：正常對(duì)照組、過(guò)表達(dá)CKLFSF6組、低表達(dá)CKLFSF6組圖1 Western印跡檢測(cè)各組HAEcs中血管細(xì)胞黏附因子、E-選擇素蛋白表達(dá)水平

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，動(dòng)脈血管管壁的慢性炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，早期表現(xiàn)為血管內(nèi)皮損傷、血小板聚集、血管壁單核細(xì)胞黏附聚集〔5〕。近年來(lái)研究顯示，冠心病的發(fā)生與發(fā)展是遺傳、環(huán)境、基礎(chǔ)疾病等多種因素共同作用的結(jié)果，老年人是冠心病高發(fā)群體〔6〕。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程領(lǐng)域的快速發(fā)展，在基因?qū)用嫔详U述冠心病、糖尿病、高血壓、腫瘤等慢性病的發(fā)病機(jī)制已成為目前研究熱點(diǎn)〔7,8〕。CKLFSF的研究最早出現(xiàn)在腫瘤領(lǐng)域，已得出其作為抑癌基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等過(guò)程的結(jié)論〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，CKLFSF2B基因多態(tài)性與冠心病發(fā)展密切相關(guān)〔10〕；CKLFSF5基因表達(dá)與冠心病患者介入治療后心血管事件和血小板高反應(yīng)性相關(guān)〔11〕。但目前關(guān)于CKLFSF6基因表達(dá)對(duì)冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響及相關(guān)機(jī)制研究仍十分少見(jiàn)。

本研究結(jié)果顯示，吸煙史、糖尿病、高血壓、CKLFSF6基因表達(dá)是冠心病發(fā)生的獨(dú)立影響因素。煙草中含有一氧化碳、焦油、尼古丁等多種化學(xué)物質(zhì)和致癌成分，對(duì)血管的刺激較大，易造成血管損傷，引發(fā)冠心病〔12〕。糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)會(huì)危害人體多個(gè)臟器的正常功能，其中對(duì)心、腦、腎臟的危害最明顯〔13〕。長(zhǎng)期高血壓狀態(tài)也會(huì)加速心腦血管病變，臨床研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者中冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較血壓正常者升高約4倍〔14〕。CKLFSF6基因表達(dá)是冠心病發(fā)生的獨(dú)立影響因素，提示CKLFSF6基因可能參與調(diào)控冠心病的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果提示CKLFSF6基因過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與進(jìn)展。

血管細(xì)胞黏附因子定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，內(nèi)毒素、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)其表達(dá)〔15〕；配體與α4β1整聯(lián)蛋白結(jié)合后可促使白細(xì)胞穿過(guò)血管壁到達(dá)炎癥部位，與B細(xì)胞、T細(xì)胞發(fā)生相互作用〔16〕。E-選擇素主要表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面，能夠介導(dǎo)白細(xì)胞透過(guò)血管壁進(jìn)入全身炎癥區(qū)域，與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、凝血過(guò)程、多發(fā)性硬化等病理過(guò)程密切相關(guān)〔17〕。本研究結(jié)果顯示，CKLFSF6基因高表達(dá)可通過(guò)上調(diào)血管細(xì)胞黏附因子和E-選擇素表達(dá)，促進(jìn)THP-1的遷移、黏附，誘導(dǎo)HAEcs增殖，促進(jìn)冠心病的發(fā)生與發(fā)展。本研究為CKLFSF6基因與老年冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的研究提供了新的參考依據(jù)。