陳冬杰 黃永蓮 彭曉洪 黃亞秀 王 評

[北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院（龍崗），廣東 深圳 518000]

中暑是夏季高發(fā)的危重癥之一，其中重癥中暑的死亡率仍較高，達10%～50%[1]。現(xiàn)階段研究認為血管內(nèi)皮細胞損傷、全身炎癥反應和凝血功能紊亂是導致重癥中暑發(fā)生的主要病理生理機制[2]，而熱打擊后腸道黏膜損傷所致的腸源性毒素血癥則是以上過程的始動因素之一[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)重癥中暑早期，熱打擊致腸道黏膜屏障損傷，通透性改變，腸道菌群失調(diào)，內(nèi)毒素入血，誘導全身炎癥反應進而引起臟器功能損傷[4]。而腸型脂肪酸結合蛋白（I-FABP）、D-乳酸水平在腸黏膜受損時會明顯升高，因此被認為是腸道黏膜受損的標志物，并且可通過其水平反映腸道的受損傷程度。本課題前期組研究發(fā)現(xiàn)大柴胡湯對重癥中暑患者有較好療效，能減輕患者的全身炎癥反應程度，改善預后[5]。因此，本研究觀察大柴胡湯對重癥中暑大鼠血清白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、腸型脂肪酸結合蛋白（I-FABP）及D-乳酸（D-LA）水平的影響，探討大柴胡湯對重癥中暑大鼠腸道黏膜屏障的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠60只，質(zhì)量（200g±30）g，由廣東省動物實驗中心提供。本實驗通過醫(yī)院倫理審查，大鼠實驗前適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器 大柴胡湯，組方：柴胡15 g，黃芩9 g，芍藥9 g，半夏9 g，生姜15 g，枳實9 g，大棗10 g，大黃6 g。藥材由北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院中藥房提供，濃煎成含原生藥1 g/mL，過濾除菌分裝4℃保存?zhèn)溆?。BCA蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天生物技術公司），大鼠IL-1酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒、大鼠DLA ELISA試劑盒、大鼠I-FABP ELISA試劑盒、大鼠TNF-α ELISA試劑盒均購自上海美軒生物科技有限公司。高溫氣候動物培養(yǎng)箱（寧波戴維醫(yī)療器械有限公司）、低溫冷凍離心機（Thermo公司）、MultiSkan3酶標儀（Thermo公司）、超聲波破碎儀（無錫沃信儀器制造有限公司）

1.3 分組與造模 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為4組：空白對照組、模型組、大柴胡湯標準劑量組、大柴胡湯高劑量組，各15只。將大鼠置于高溫氣候動物培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度（40.5±0.5）℃，濕度（65.0±2.0）%，經(jīng)直腸測中心體溫（Tc），造模期間每隔1 h測1次中心體溫，Tc達41℃后每隔15 min測1次體溫。以動物直腸溫度達42℃作為重癥中暑標準。記錄動物達到重癥中暑標準時間，造模成功后，置于常溫環(huán)境（23.0±0.5）℃進行自然降溫。

1.4 給藥方法 造模后6 h開始給藥。大鼠灌胃劑量參照血清藥理學等效劑量換算公式進行換算：Db=Da×Dab，正常大柴胡湯用藥量為1.37 g/（kg·d），成人-大鼠的換算系數(shù)Rab=6.17，則200 g大鼠的等效劑量折算為1.69 g/（kg·d），高劑量組為標準劑量組2倍，即3.38 g/（kg·d），中藥湯劑用生理鹽水稀釋至5 mL，每8小時灌胃1次，連續(xù)2 d?？瞻讓φ战M、模型組同時間以等量生理鹽水灌胃。

1.5 標本采集與檢測 在造模成功后6、24、48 h分別隨機取5只大鼠處死，收集腹主動脈血，離心分離血清后采用ELISA檢測IL-1、TNF-α、IFABP、D-LA水平含量，操作步驟嚴格按照說明書進行

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，進行χ2檢驗、單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-1水平比較 見表1。模型組血清TNF-α、IL-1水平持續(xù)升高，較空白對照組同時間點均明顯升高（P＜0.01）；中藥各組血清TNF-α、IL-1水平48 h后逐漸下降，較空白對照組同時間點均明顯升高（P＜0.01）；大柴胡湯兩組血清TNF-α、IL-1水平在給藥后同時間點均顯著低于模型組（P＜0.05），且高劑量組降低更明顯（P＜0.01）；兩組血清TNF-α、IL-1水平比較，高劑量組上述指標同時間點均較標準劑量組顯著下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點血清TNF-α、IL-1水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠不同時間點血清TNF-α、IL-1水平比較（pg/mL，±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與大柴胡湯標準劑量組比較，△P＜0.05。下同。

TNF-αIL-1組別48h 20.65±7.19 170.20±6.21#119.12±4.57#**84.12±5.08#**△空白對照組模型組大柴胡湯標準劑量組大柴胡湯高劑量組n 5 5 5 5 6h 13.28±2.91 23.39±3.90#22.73±5.07#25.76±3.63#24h 12.54±4.44 76.99±5.02#69.20±4.32#*59.37±4.30#**△48h 15.94±4.75 90.21±3.02#58.46±5.13#**38.98±5.53#**△6h 24.50±10.52 48.12±3.10#54.23±9.70#53.89±5.13#24h 27.43±6.06 146.75±10.12#132.68±4.93#*112.59±9.64#**

2.2 各組大鼠血清I-FABP、D-LA水平比較 見表2。模型組血清IFABP、D-LA水平持續(xù)升高，較空白對照組同時間點均明顯升高（P＜0.01）；大柴胡湯兩組血清I-FABP、D-LA水平48 h后逐漸下降，較空白對照組同時間點均明顯升高（P＜0.01）；大柴胡湯兩組血清IFABP、D-LA水平在給藥后同時間點均顯著低于模型組（P＜0.05），且高劑量組降低更明顯（P＜0.01）；兩組血清I-FABP、D-LA水平比較，高劑量組上述指標同時間點均較標準劑量組顯著下降（PP＜0.05）。

表2 各組大鼠不同時間點血清I-FABP、D-LA比較（μmol/mL，±s）

表2 各組大鼠不同時間點血清I-FABP、D-LA比較（μmol/mL，±s）

I-FABP D-LA組別空白對照組模型組大柴胡湯標準劑量組大柴胡湯高劑量組n 5 5 5 5 6h 140.12±34.75 254.82±38.20#256.60±25.78#264.76±23.81#24h 146.24±27.35 542.58±13.82#504.34±22.23#*453.37±32.38#**△48h 150.57±23.02 618.79±12.31#436.04±27.63#**321.85±22.03#**△6h 41.74±4.50 56.06±4.94#58.14±6.11#57.38±9.12#24h 42.74±4.58 127.87±8.37#114.55±8.51#*90.57±3.09#**48h 20.65±7.19 154.14±10.83#87.35±6.84#**70.38±4.33#**△

3 討論

重癥中暑大鼠在發(fā)病過程中，高熱的環(huán)境直接導致大鼠腸道黏膜受損，通透性增加，導致細菌/毒素更容易經(jīng)過腸道黏膜進入血液，導致腸源性膿毒癥的發(fā)生，進而啟動炎癥風暴，最終造成多器官功能障礙[6-7]。同時，熱打擊下的大鼠腸道也同時出現(xiàn)了缺血、缺血再灌注的損傷過程[8-9]，進一步加重了腸道黏膜屏障的損傷。而當腸道的機械屏障、生物/化學等屏障被破壞后，各種生物標志物會大量釋放入血。腸道黏膜完好的大鼠腸型脂肪酸結合蛋白在外周血液中近微量存在[10]。但一旦腸道缺血，可在15 min內(nèi)血清中濃度急劇上升，基于此，I-FABP被認為可以反映腸道機械屏障的完整性和受損傷的程度[11]。血清D-LA是腸道內(nèi)多種細菌在腸道組織缺血、缺氧條件下葡萄糖無氧代謝的產(chǎn)物，產(chǎn)生的D-LA可在腸道黏膜通透性增加時進入血液，并且由于哺乳動物不產(chǎn)生分解代謝D-LA的酶系統(tǒng)，故臨床上常通過對其水平的檢測來反應機體的缺氧情況以及腸黏膜受損程度和通透性變化[12]。

通過本實驗可以發(fā)現(xiàn)，在造模成功后重癥中暑大鼠的TNF-α、IL-1水平達持續(xù)升高，在觀察期間仍未達到最高水平，且同期I-FABP、D-LA均升高，而空白對照組中，大鼠的TNF-α、IL-1水平并沒有升高，而且同時期I-FABP、D-LA水平也未出現(xiàn)明顯變化，證明了重癥中暑大鼠在熱打擊后出現(xiàn)全身炎癥反應時，大鼠的腸道黏膜會受到抑制并出現(xiàn)損傷，該結果與國內(nèi)相關研究結果相一致。并且通過對比模型組和各劑量中藥組可以發(fā)現(xiàn)，大柴胡湯能夠有效降低TNF-α、IL-1及I-FABP、D-LA水平。

重癥中暑屬于中醫(yī)學“暑厥”“暑風”范疇。傳統(tǒng)認為暑熱傷陰耗氣，氣機逆亂，神明失養(yǎng)為本病主要病機，治以清暑益氣，養(yǎng)陰生津為法。近來有學者認為熱毒、血瘀與中暑的發(fā)生發(fā)展密切相關，并運用清熱解毒，涼血活血及益氣養(yǎng)陰，醒腦開竅的中藥治療中暑患者取得較好療效[13-14]。本課題組長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，中暑的患者多出現(xiàn)胃腸功能障礙，以腹脹，大便難解為主要癥狀?；诖?，我們認為陽明經(jīng)腑邪熱熾盛，少陽樞機不利是本病的主要病機特點之一，理當和解少陽、通腑瀉熱。大柴胡湯出自《金匱要略》，為和解少陽、內(nèi)瀉熱結的代表方，對多種伴隨腸道功能障礙的危重癥具有確切療效。而本研究也確實證明了大柴胡湯對重癥中暑大鼠的胃腸黏膜屏障有極好的保護作用。重癥中暑的啟動器官是腸道，保護腸道功能，西醫(yī)強調(diào)積極降溫，早期腸內(nèi)營養(yǎng)，保持大便通暢，這與中醫(yī)學“保胃氣”“六腑以通為用”的觀點不謀而合。

對于大柴胡湯降低I-FABP、D-LA水平的機制，結合本實驗結果，可以推測是由于大柴胡湯能夠通過抑制炎癥反應，減少炎癥因子的生成，從而直接減少腸道黏膜的損傷。但是具體通過何種內(nèi)在途徑尚未清楚，因此本實驗仍需進一步研究其內(nèi)在機制，為明確大柴胡湯保護腸道黏膜的分子途徑提供證據(jù)。且本研究在觀察期間，模型組的炎癥反應及腸道黏膜屏障受損仍在持續(xù)，中藥治療組已呈現(xiàn)下降趨勢，證明了大柴胡湯不僅僅能有效治療重癥中暑，且能提早干預并減輕炎癥反應，從而起到保護腸道黏膜的作用。

綜上，大柴胡湯能夠有效抑制重癥中暑大鼠的炎癥反應，并且對腸道黏膜保護起到作用，其機制可能與通過抑制炎癥反應，減少炎癥因子生成相關。