楊夢霞 蘆殿榮 朱世杰 周 磊

（1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

骨骼是腫瘤細胞轉移最主要的目標器官之一，轉移率僅次于肺和肝[1]。約2/3晚期惡性腫瘤患者會發(fā)生骨轉移[2]，在臨床上主要表現(xiàn)為局部持續(xù)性進行性刺痛和明顯的壓痛、病理性骨折、椎體轉移的脊髓壓迫、高血鈣等，嚴重影響了患者一般機體狀況和生活質量，縮短生存期[3]。目前西醫(yī)多采用放療、手術及藥物治療等姑息療法，但臨床應用局限且存在許多不良事件，如：骨折、低血鈣癥和頜骨壞死等[4]。近年來，中醫(yī)藥在改善腫瘤患者生活質量、緩解臨床癥狀、延長生存期等方面具有顯著優(yōu)勢，且療效明確，不良反應少[5]。歷代中醫(yī)學者認為腫瘤骨轉移多是腎精虧虛、骨失濡養(yǎng)所致。本研究團隊通過總結全國名老中醫(yī)李佩文教授臨床用藥經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，歸腎經(jīng)方——陰陽雙補方對骨轉移防治具有較好的臨床療效，但其作用機制尚未清楚。故本研究擬基于網(wǎng)絡藥理學方法初步探討陰陽雙補方治療骨轉移癌的理論內(nèi)涵，以便為今后臨床用藥提供更多參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 陰陽雙補方主要有效成分篩選 在中藥數(shù)據(jù)庫TCMSP（http：//lsp.Nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中檢索陰陽雙補方（由補骨脂、骨碎補、肉蓯蓉、淫羊藿、透骨草、山茱萸、山藥、熟地黃組成）有效成分，保留OB≥30%且DL≥0.18的成分；同時，借助TCMID（http：//www.mega-bionet.org/tcmid/）及TCM Database@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/）中藥數(shù)據(jù)庫對檢索不到有效成分的藥物進行補充。

1.2 陰陽雙補方潛在靶點預測 在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索陰陽雙補方主要有效成分所對應的化學結構，并在Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中，以“Homo sapiens”為檢索條件，保留“Probability＞0.1”的潛在靶點；最后使用Cytoscape3.8.2中的MCODE（Version1.4.2，Bader Lab，University of Toronto）插件，篩選出重要模塊基因并進行可視化分析。

1.3 骨轉移癌疾病基因篩選 在Drugbank（http：//www.drugbank.ca/）和DisGeNet（http：//www.disgenet.org/）疾病基因數(shù)據(jù)庫中，查詢骨轉移癌疾病基因，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中將基因標準化。

1.4 陰陽雙補方針對骨轉移癌的潛在治療靶點預測 通過韋恩映射篩選出潛在治療靶點，同時使用STRING11.5（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構建基因功能關聯(lián)網(wǎng)絡，并在Cytoscape3.8.2中可視化，同時利用MCODE插件篩選出核心靶點。

1.5 潛在治療靶點功能分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）分別對潛在治療靶點進行GO及KEGG通路富集分析，并將結果可視化（FDR＜0.05）。

2 結果

2.1 陰陽雙補方主要有效成分 在中藥數(shù)據(jù)庫中檢索到陰陽雙補方主要有效成分共88個（補骨脂4個、骨碎補17個、肉蓯蓉6個、淫羊藿23個、透骨草7個、山茱萸肉14個、山藥15個、熟地黃2個），見表1（僅列出每位藥OB值排名前5的有效成分）。

表1 陰陽雙補方主要有效成分

2.2 陰陽雙補方潛在靶點 在Swiss Target Prediction中檢索到陰陽雙補方共包含673個靶點。將這些靶點在Cytoscape3.8.2中使用MCODE插件篩選重要模塊靶點，發(fā)現(xiàn)這些靶點主要位于模塊A（得分為29.568，含36個節(jié)點，547條邊）和B（得分為17.017，含58個節(jié)點，502條邊），見圖1。

圖1 陰陽雙補方潛在靶點重要模塊基因

2.3 陰陽雙補方針對骨轉移癌的潛在治療靶點 在疾病基因數(shù)據(jù)庫中檢索到骨轉移癌疾病基因有773個，與673個藥物潛在靶點進行韋恩映射，得到150個潛在治療靶點，見圖2。在STRING11.5數(shù)據(jù)庫中構建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡，并在Cytoscape3.8.2中可視化，包含145個節(jié)點，1 531條邊，見圖3A；并使用MCODE插件篩選核心靶點，取節(jié)點連接度排名前20的靶點做條形圖，見圖3B。

圖2 陰陽雙補方潛在靶點和骨轉移癌疾病基因的韋恩圖

圖3 陰陽雙補方治療骨轉移癌的潛在靶點（A）及核心靶點（B）

2.4 潛在治療靶點的GO功能分析 對150個潛在治療靶點進行GO功能富集分析，根據(jù)“FDR＜0.05”篩選得到BP48個、CC9個和MF30個。分別取BP、MF排名前10的條目及9項CC進行可視化，見圖4。在BP方面，包括蛋白質自磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化及磷脂酰肌醇介導的信號轉導等；在CC中，涉及樹突、磷脂酰肌醇3-激酶復合物及溶酶體等；在MF方面，涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、神經(jīng)遞質受體活性及磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性等。

圖4 陰陽雙補方治療骨轉移癌潛在靶點的GO功能富集分析

2.5 潛在治療靶點的KEGG功能分析 對150個潛在治療靶點進行KEGG通路富集分析，得到97條通路，根據(jù)“FDR＜0.05”篩選得到82條通路，將前30條通路進行可視化，見圖5。相關通路主要有HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信號通路。

圖5 陰陽雙補方治療骨轉移癌潛在靶點的KEGG通路富集分析

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為，腫瘤細胞在趨化作用下可改造骨微環(huán)境，而骨微環(huán)境也在不斷招募腫瘤細胞，進而使腫瘤細胞向骨組織定植[6]。中醫(yī)學認為腎主骨生髓，故骨轉移患者多從腎論治。本研究團隊根據(jù)李老治療骨轉移臨床用藥經(jīng)驗，選取常用補腎類中藥加減化裁組成“陰陽雙補方”，方中補骨脂、骨碎補補腎助陽，肉蓯蓉補腎溫陽，益精血，3藥相輔相成，培補腎中元陽，共為君藥；熟地黃滋補腎精，山茱萸肉、山藥養(yǎng)肝補脾，俱為臣藥；淫羊藿、透骨草益腎強骨，兩藥合用，助君藥溫壯腎陽之功；諸藥合用，補腎之中兼顧養(yǎng)肝益脾，使腎精得充而虛損易復；溫陽之中參以滋陰填精，則陽得陰助而生化無窮，諸藥合用，共奏補腎助陽、益精填髓之效，但作用機制尚未清楚。

本研究通過篩選“陰陽雙補方”主要有效成分，并構建其與相關靶點相互作用網(wǎng)絡圖，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等為其核心化合物。其中β-谷甾醇一方面可通過清除活性氧誘導結腸癌細胞凋亡，另一方面可抑制人結腸癌細胞中β-連環(huán)蛋白和PCNA抗原的表達，進而抑制癌細胞生長[7]。山柰酚可抑制中性粒細胞釋放中性粒細胞胞外陷阱，進而抑制癌細胞轉移，此外也可激活MAPK信號和MMP信號[8]。槲皮素可抑制甲狀旁腺激素受體1活性，阻礙其與甲狀旁腺激素和甲狀旁腺激素相關肽的結合，進而降低人轉移性骨肉瘤細胞的侵襲、黏附、增殖和遷移率[9]。淫羊藿苷具有抑制血管生成和腫瘤轉移的作用，其作用機制主要是通過降低肝癌細胞中VEGF和APRIL的表達水平以抑制內(nèi)皮細胞遷移[10]。

通過Cytoscape3.8.2軟件構建“陰陽雙補方”治療骨轉移癌的功能關聯(lián)網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9。其中EGFR在促進多種腫瘤的發(fā)生和轉移中有重要作用，研究認為可溶性因子可通過旁分泌機制激活鄰近成骨細胞中的EGFR通路，并下調OPG表達，RANKL和OPG比例增加有利于破骨細胞的生成，并導致溶骨性骨轉移的惡性循環(huán)[11]。CASP3通常被認為是細胞凋亡的標志，其活性增加可促進應激誘導的癌細胞生長、細胞遷移、侵襲性和腫瘤血管生成[12]。STAT3是一種轉錄因子，通過JAK-STAT3信號通路在腫瘤細胞增殖、存活、侵襲和免疫抑制中有重要作用，還可通過炎癥、干細胞和轉移前生態(tài)位促進癌癥發(fā)生[13]。ERBB2可在癌癥干細胞中選擇性表達，并且在脛骨中的表達水平更高，這可能是通過RANKL激活RANK受體介導的[14]。AKT1基因是原癌基因，其相應的蛋白質可調節(jié)PI3K信號轉導途徑下游的事件，并在抑制細胞活力、增殖、分化和凋亡中起重要作用[15]。MMP2/9均為癌相關性內(nèi)肽酶，在調節(jié)細胞生長、侵襲、遷移、血管生成和炎癥的一些關鍵信號通路中發(fā)揮關鍵作用[16]。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫富集分析發(fā)現(xiàn)，陰陽雙補方治療骨轉移癌的作用機制主要涉及抑制癌細胞轉移、促細胞凋亡及調節(jié)骨微環(huán)境等多個環(huán)節(jié)。其中HIF信號通路是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，當局部缺氧和成骨細胞中缺氧時HIF-1α可被激活，這對維持骨骼內(nèi)環(huán)境平衡至關重要[17]。研究發(fā)現(xiàn)骨祖細胞位于骨髓中的低氧環(huán)境中，當骨祖細胞中HIF信號激活可增加趨化因子CXCL12的血液水平，進而直接激活CXCR4受體導致乳腺癌細胞增殖和擴散的系統(tǒng)性增加[18]。Rap1信號傳導涉及不同癌癥細胞增殖和遷移的調節(jié)，研究顯示Rap1GAP的逆轉錄病毒沉默可極大程度增強ERK/MAPK的磷酸化和活化，誘導廣泛的細胞骨架重組和EMT特征的表達，并增強乳腺導管原位癌細胞的侵襲[19]。VEGF可通過結合內(nèi)皮細胞上的VEGFR1/2影響腫瘤微環(huán)境，其旁分泌機制大大增加了腫瘤血管的數(shù)量和大小，以提供充足的血液供應[20]。研究發(fā)現(xiàn)在各種腫瘤組織中，VEGF通過自分泌作用與分泌VEGF的腫瘤細胞上的VEGF受體結合，這種分泌反應導致不同信號轉導途徑的激活，并最終支持腫瘤的生長和增殖[21]。PI3K/Akt通路中相關蛋白表達可影響胃癌細胞轉移及侵襲能力，可能用于預測患者術后骨轉移的發(fā)生[22]。mTOR是PI3K/Akt通路下游的一個蛋白，在該通路活化后可增加磷酸化產(chǎn)物水平，進而介導下游重要信號分子，促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲過程，抑制凋亡[23]。

綜上所述，從網(wǎng)絡藥理學角度分析可發(fā)現(xiàn)，陰陽雙補方主要有效成分如：β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素及淫羊藿苷等可通過EGFR、CASP3、STAT3、AKT1、ERBB2及MMP2/9等靶點調控HIF-1、Rap1、VEGF、PI3K-Akt及mTOR等信號通路，進而發(fā)揮抑制癌細胞轉移、促凋亡及調節(jié)骨微環(huán)境等作用，這對未來臨床用藥及本團隊后期基礎研究方向都有一定參考價值。