楊慧 劉曉鳳 劉錢 馬聰 廖正根 徐玉玲 劉濤 ,*

(1 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 330004；2 四川天一學(xué)院，德陽 618000；3 成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610106；4 四川省抗病毒中藥產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，成都 610106；5 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 610106)

近年來，由于抗菌藥物的不合理使用和濫用，細(xì)菌耐藥性已經(jīng)為全球所關(guān)注。一方面，細(xì)菌對常規(guī)抗生素的敏感性不斷減弱；另一方面，開發(fā)新的抗菌藥物難度大、周期長[1-2]。因此，從中藥中篩選抗菌藥物進(jìn)行細(xì)菌的非抗生素治療，為解決細(xì)菌耐藥問題提供新的思路與途徑。黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連Coptis teetaWall.的干燥根莖，分別習(xí)稱為“味連”、“雅連”或“云連”，其藥理作用主要與其根莖所含的多種生物堿有關(guān)，抗菌作用廣泛，有“中藥抗生素”的美稱，涉及45種細(xì)菌菌種[3]，中藥黃連對臨床常見的金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌和大腸埃希菌等多種致病微生物均有不同程度的抑制作用[4]，含有多種異喹啉類生物堿，其中鹽酸小檗堿具有明顯的抑菌作用。

黃連花薹是黃連的花序，近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃連花薹含有大量的生物堿、黃酮和酚類活性物質(zhì)，具有降血脂、降血糖、降血壓、抗氧化、促進(jìn)排便及抗菌等作用[5]，根據(jù)已有研究結(jié)果[6-9]及質(zhì)量標(biāo)志物的確定原則，可將鹽酸小檗堿作為黃連花薹的Q-marker(質(zhì)量標(biāo)志物)，黃連花薹作為黃連的非藥用部位，目前還沒有關(guān)于黃連花薹的抗菌機制研究的報道，本文選用大腸埃希菌(Escherichia coli, EC)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)及枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis,BS)為代表的革蘭陰性菌和革蘭陽性菌為實驗菌種，探索黃連花薹的抗菌機制：通過測定黃連花薹對細(xì)菌菌體的胞外可溶性蛋白質(zhì)含量、胞外核酸相對含量和電導(dǎo)率的影響，探究黃連花薹及鹽酸小檗堿對3種細(xì)菌的作用機制。在此基礎(chǔ)上對質(zhì)量標(biāo)志物確定的“五原則”進(jìn)行進(jìn)一步的討論，為質(zhì)量標(biāo)志物理論研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

選用采于四川省樂山市沙灣區(qū)種植的黃連花薹為研究材料，經(jīng)成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院劉濤教授鑒定為毛茛科植物Coptis chinensisFranch.黃連的花薹。SA、EC、BS菌株由成都大學(xué)附屬醫(yī)院提供；鹽酸小檗堿對照品購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度≥98%，考馬斯亮藍(lán)G-250購自成都市科隆化學(xué)品有限公司等。

1.2 試驗器材

TU-1810 型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，DH3006A型電熱恒溫培養(yǎng)箱(西安禾普生物科技有限公司)，HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，TG20G型離心機(天津廣豐科技公司)，DDS-307A電導(dǎo)率儀(上海儀店科學(xué)儀器股份有限公司)，XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)，JJ-CJ-2FD型潔凈工作臺(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司)。

其他儀器包括96孔一次性細(xì)胞培養(yǎng)板、移液槍等。

2 方法

2.1 樣品的制備

2.1.1 黃連花薹藥液的制備

稱取減壓干燥后的黃連花薹藥材50 g加入18倍水，在100℃下提取3次，每次0.5 h，合并濾液進(jìn)行濃縮，減壓干燥后得到黃連花薹提取物18.32 g。精確稱取黃連花薹提取物末9.92 g于錐形瓶中，加入純化水50 mL溶解，紫外滅菌后備用。

2.1.2 鹽酸小檗堿對照品溶液制備

精密鹽酸小檗堿對照品適量，加純化水使溶解并制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的對照品儲備液，經(jīng)紫外滅菌后備用。

2.1.3 菌株活化

按照文獻(xiàn)[10]方法制得菌懸液，備用。

2.2 抗菌活性研究

2.2.1 最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用二倍稀釋法[10]，設(shè)置陽性對照組、陰性對照組、空白對照組。進(jìn)行接種試驗，置于37℃搖床培養(yǎng)24 h后取出觀察。96孔板中澄清小孔所對應(yīng)的藥物濃度為樣品對該菌的最低抑菌濃度。每組設(shè)3個重復(fù)。

2.2.2 最小殺菌濃度(MBC)測定

將上述96孔板中透明澄清液體接種于固體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。以無菌落生長的藥物濃度值為其MBC值。

2.3 抗菌機制研究

2.3.1 胞外可溶性蛋白的測定

按照文獻(xiàn)[10]對細(xì)菌進(jìn)行胞外可溶性蛋白測定，每隔20 min定時取樣，測定藥物濃度為MIC和2×MIC在595 nm處的吸光度值，以上操作重復(fù)3次。

2.3.2 胞外核酸相對量的測定

按照文獻(xiàn)[10]的細(xì)菌胞外核酸相對量的測定，每隔20 min定時取樣，測定藥物濃度為MIC和2×MIC在260 nm處的吸光度值，以上操作重復(fù)3次。

2.3.3 電導(dǎo)率法檢測樣品對細(xì)菌細(xì)胞通透性的影響

按照文獻(xiàn)[11]的電導(dǎo)率法檢測樣品對細(xì)菌細(xì)胞通透性的影響，用電導(dǎo)率儀分別在0、10、20、30、40、60、80和120 min時間點測量其電導(dǎo)率值的變化，每組設(shè)3個重復(fù)。

3 結(jié)果

3.1 黃連花薹的抗菌活性

本研究采用二倍比稀釋法測定了黃連花薹浸膏液及鹽酸小檗堿對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的抗菌活性。圖1可見，黃連花薹浸膏濃度≥0.0125 mg/mL時的金黃色葡萄球菌溶液澄清，揭示黃連花薹浸膏濃度濃度≥0.0125 g/mL時便可對其有抑制生長作用；黃連花薹浸膏濃度≥0.025 g/mL時的大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌溶液澄清，揭示黃連花薹浸膏濃度濃度≥0.025 g/mL便可對這2種菌產(chǎn)生抑制作用。

黃連花薹和鹽酸小檗堿對3種菌的MIC和MBC值如表1所示，均有明顯的抗菌活性，但抗菌效果存在差異。黃連花薹對EC和BS的MIC值相同，說明黃連花薹藥液對這2種細(xì)菌中的抗菌活性相似，而鹽酸小檗堿對EC和SA的MIC值相同，說明鹽酸小檗堿對這2種細(xì)菌中的抗菌活性相似。本實驗通過HPLC法測定黃連花薹中鹽酸小檗堿的含量為4.15%，實驗過程中在鹽酸小檗堿相同濃度下，黃連花薹對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于鹽酸小檗堿，說明黃連花薹中除鹽酸小檗堿外還有其他成分也起著抗菌作用。

表1 3種菌的抑菌MIC和MBC值(mg/mL)Tab.1 MIC and MBC of 3 bacteria (mg/mL)

3.2 黃連花薹與鹽酸小檗堿對3種細(xì)菌的抗菌機制

3.2.1 對細(xì)菌胞外可溶性蛋白的影響

在菌液中加入樣品后，胞外可溶性蛋白質(zhì)含量在0～40 min內(nèi)顯著增加，而后趨于平衡，由表2～3及圖2～3可知，各試驗組的胞外可溶性蛋白濃度均顯著高于空白對照組(P≤0.002)，說明黃連花薹及鹽酸小檗堿在一定質(zhì)量濃度下可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄露，從而達(dá)到抑菌活性。

表2 黃連花薹對3種細(xì)菌胞外可溶性蛋白的影響結(jié)果Tab.2 Effect of Coptis flower extracellular soluble proteins of three bacteria

表3 鹽酸小檗堿對3種細(xì)菌胞外可溶性蛋白的影響結(jié)果Tab.3 Effect of berberine hydrochloride on the extracellular soluble proteins of three bacteria

3.2.2 對細(xì)菌胞外核酸相對含量的影響

當(dāng)藥液作用后，胞外核酸相對含量在0～40 min內(nèi)呈快速增長趨勢，在1 h后總體呈平穩(wěn)狀態(tài)，由表4～5及圖4～5可知，樣品組細(xì)菌胞外核酸相對量明顯高于對照組。各試驗組的核酸濃度均顯著高于空白對照組(P≤0.001)，當(dāng)細(xì)胞受到損害時，可使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏到培養(yǎng)液中，導(dǎo)致培養(yǎng)液在260 nm處的吸光度值增大。這一結(jié)果與前述實驗結(jié)果一致，表明細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性可以被黃連花薹改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露出來，從而達(dá)到抑菌活性。

表4 黃連花薹對三種細(xì)菌胞外核酸相對含量的影響結(jié)果Tab.4 Effect of Coptis flower on the relative content of extracellular nucleic acid in three

表5 鹽酸小檗堿對3種細(xì)菌胞外核酸相對含量的影響結(jié)果Tab.5 Effect of berberine hydrochloride on the relative content of extracellular nucleic acids in three bacteria

3.2.3 對細(xì)菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

當(dāng)細(xì)胞膜沒有受到損傷時，細(xì)胞內(nèi)的帶電離子不能自由通過細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子大量外流，從而菌液的電導(dǎo)率會升高。由圖6和表6可知，在實驗組中，測得各組電導(dǎo)率在10 min內(nèi)有明顯的增長趨勢，且各樣品組的電導(dǎo)率與空白對照組相比，有較大差距(P≤0.001)，且黃連花薹比鹽酸小檗堿檢測到的電導(dǎo)率值較高，這說明黃連花薹中還有其他成分協(xié)同發(fā)揮抗菌作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子大量外流，從而菌液的電導(dǎo)率會升高，達(dá)到抑菌活性。

表6 黃連花薹及鹽酸小檗堿對細(xì)菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響結(jié)果(ms/cm)Tab.6 Effect of Coptis flower and berberine hydrochloride on the electrical conductivity of bacterial medium(ms/cm)

4 討論

黃連類中藥因資源豐富、安全性高、毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥性越來越受關(guān)注，抗生素抗菌研究的基礎(chǔ)需要通過抗菌機制的研究來提供應(yīng)用的科學(xué)依據(jù)。文獻(xiàn)[9]發(fā)現(xiàn)槲皮素和鹽酸小檗堿對于抗菌所涉及的通路和基因都有很高的契合度。但本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對3種細(xì)菌的抑制作用不明顯，黃連花薹及鹽酸小檗堿有對細(xì)菌有明顯的抑制作用，黃連花薹對常見的致病菌具有較好的抗菌效果和一定的殺菌能力，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸埃希菌及枯草芽胞桿菌，其MIC和MBC分別為12.5和25 mg/mL。鹽酸小檗堿對枯草芽胞桿菌的抑制作用強于大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌，其MIC和MBC分別為0.25和2.0 mg/mL；對大腸埃希菌的最小抑菌濃度為1.0 g/mL，與文獻(xiàn)[12]報道一致，研究結(jié)果表明可以將鹽酸小檗堿作為黃連花薹的質(zhì)量標(biāo)志物。

“質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)”核心是基于有效、特有、傳遞與溯源、可測和處方配伍的“五要素”界定和解析中藥Q-marker，但Q-marker僅為中藥中眾多成分的一種或幾種，它們和其他未知的成分與之一起發(fā)揮拮抗或協(xié)同作用表征中藥整體藥效?；赒-marker的基本概念以及確定Q-marker的原則，從理論上推導(dǎo)，中藥質(zhì)量標(biāo)志物應(yīng)該與藥物整體的作用機制相同，本文研究表明鹽酸小檗堿與黃連花薹在抑菌作用中作用機制相同。能否將其質(zhì)量標(biāo)志物的作用機制與藥物整體作用機制的相關(guān)性作為Q-marker確定的依據(jù)之一，有待學(xué)術(shù)界進(jìn)一步探討。

天然藥物組分復(fù)雜，藥理學(xué)機制難以明確，導(dǎo)致天然藥物在抗感染方面的研究和治療未被重視[13-14]。不過隨著中藥質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測的不斷發(fā)展，中藥材粗提取物的組分得以明晰，抗菌作用的研究方法也越來越多，在此基礎(chǔ)上逐步闡明其抗菌機制為中藥及天然藥物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了可能。文獻(xiàn)表明黃連花薹中成分復(fù)雜，對細(xì)菌具有促進(jìn)生長和抑制作用，這也是使黃連花薹和鹽酸小檗堿的抗菌結(jié)果有所差異的原因之一。在黃連花薹抗菌過程中是否還存在其他抗菌機制，如干擾細(xì)菌生長代謝、抑制細(xì)菌生物膜形成、抑制β-內(nèi)酰胺酶活性及抑制抗菌藥物主動外排系統(tǒng)等，還需要進(jìn)一步深入研究。