楊健，張立喜，史博

（1.滄州市中心醫(yī)院骨科，滄州 061001；2.唐山市豐南區(qū)醫(yī)院骨科，唐山 063300；3.滄州人民醫(yī)院骨科，滄州 061000）

骨肉瘤每年每百萬人中約有4～5人發(fā)病，本身發(fā)病率不高，但多見于10～20歲青少年，惡性程度及病死率高，近幾十年患者生存率并未得到改善，嚴(yán)重危及患病人群生命[1]?；熃Y(jié)合手術(shù)是目前治療骨肉瘤的主要方式，可提高患者生存質(zhì)量，但此治療手段預(yù)后較差，探索安全有效的治療方法有重要意義。隨著臨床對骨肉瘤研究深入，國內(nèi)外學(xué)者均發(fā)現(xiàn)[2-3]免疫療法或可成為骨肉瘤治療新前景。石見穿是華鼠尾草地上部分，具有散結(jié)消腫、清熱利濕之效，被應(yīng)用于癌癥治療中，并顯示出肯定效果[4]，而其有效成分石見穿多糖（PSSC）具有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用[5]，目前已有研究表明，PSSC可通過Wnt/β-catenin 信號通路[6]、增強(qiáng) γδT 細(xì)胞[7]來發(fā)揮骨肉瘤細(xì)胞殺傷作用。此外，另有研究發(fā)現(xiàn)[8]，癌癥患者抗腫瘤免疫與骨髓細(xì)胞中抑癌基因第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN）表達(dá)相關(guān)，但PSSC是否對PTEN表達(dá)有影響，臨床鮮有研究?；诖?，研究建立骨肉瘤小鼠模型，探討PSSC通過PTEN通路對骨肉瘤小鼠的抑瘤作用及對免疫功能的影響，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 取60只BALB/C雄性裸鼠（北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0009），6 周齡，體質(zhì)量 17～22 g，SPF 級環(huán)境獨(dú)立通風(fēng)籠具（IVC）飼養(yǎng)，12 h明-暗交替，23～25℃溫度，50%～60%濕度，自由攝食飲水。

1.1.2 主要儀器與試劑 PSSC（成都彼樣生物科技有限公司）、MG-63人骨肉瘤細(xì)胞（上海北諾生物科技有限公司）、RPMI 1640培養(yǎng)基（上海躍騰生物技術(shù)有限公司）、吖啶橙-溴乙錠染色液（上海麥克林生化科技有限公司）；CD4+、CD3+抗體及 PTEN、磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）抗體（Abcam 公司）；流式細(xì)胞儀（Attune NxT，賽默飛世爾科技公司）、轉(zhuǎn)印電泳儀（DYCZ-40D，武漢純度生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立骨肉瘤小鼠模型 細(xì)胞培養(yǎng)，使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、50 mg/mL鏈霉素、50 U/mL青霉素）培養(yǎng)MG-63人骨肉瘤細(xì)胞，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長情況。

構(gòu)建模型[9]，將小鼠飼養(yǎng)在無菌層流柜中，1周后，乙醇消毒，將對數(shù)生長期MG-63細(xì)胞皮下注射至小鼠右側(cè)臀部，劑量為0.1 mL（1×107個），觀察小鼠成瘤情況，1周后裸鼠長出皮下腫塊（腫瘤直徑約1 cm）為建模成功，剪腳趾標(biāo)記，棄去成瘤失敗小鼠。

1.2.2 分組與干預(yù)方法 60只小鼠，取12只為對照組，另外48只建立骨肉瘤小鼠模型，成功建模42只，隨機(jī)分為模型組（11只）、PSSC低劑量組（11只）、PSSC高劑量組（10只）、順鉑組（10只）。

建模成功第2日開始干預(yù)，PSSC低劑量組、PSSC高劑量組分別每日腹腔注射PSSC10、100mg/kg；順鉑組腹腔注射順鉑2 mg/kg，于開始干預(yù)第1、4、7、10、13天各給藥1次；對照組與模型組每日腹腔注射等體積生理鹽水，各組小鼠均為每日干預(yù)1次，連續(xù)注射2周。

1.2.3 移植瘤體積變化 干預(yù)期間每2 d測量1次小鼠移植瘤最短徑、最長徑，觀察移植瘤生長情況，計(jì)算體積（最短徑2×最長徑/2），繪制小鼠腫瘤生長曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群 末次測量結(jié)束后，摘眼球取血，肝素鈉震蕩抗凝，300×g，離心半徑16 cm，離心5 min取血清，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸調(diào)整細(xì)胞濃度，添加抗體，避光孵育30 min（4℃），加細(xì)胞裂解液，室溫孵育5 min，加PBS終止，同上述條件離心，加流式緩沖液洗滌，再次離心，加細(xì)胞固定液過夜，并進(jìn)行篩濾，使用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例。

1.2.5 天平測定小鼠移植瘤質(zhì)量 取血結(jié)束后，斷頸處死小鼠，無菌分離出腫瘤組織，使用天平稱質(zhì)量，記錄移植瘤質(zhì)量。

1.2.6 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤病理組織變化 取部分腫瘤組織，4%多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，制作出4 μm厚度切片，將切片脫蠟、水化，常規(guī)HE染色，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察腫瘤病理變化。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)腫瘤細(xì)胞凋亡率 取移植瘤組織，制成單細(xì)胞懸液，吖啶橙-溴乙錠染色，熒光顯微鏡掃描，識別細(xì)胞類型，陽性凋亡細(xì)胞：細(xì)胞核呈棕褐色；正常細(xì)胞：亮綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)均勻，鏡下隨機(jī)選4個視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞，計(jì)算凋亡率。

1.2.8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測移植瘤組織PTEN、PI3K及p-Akt蛋白表達(dá) 于移植瘤組織中加入蛋白裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，離心12000r/min，離心半徑8 cm，10 min，取上清液，取蛋白樣品30 g，與12.5%SDS-PAGE中進(jìn)行蛋白分離，將蛋白轉(zhuǎn)印于聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，并將其放入5%脫脂奶粉中，封閉1 h，TBST洗膜，加入兔抗小鼠PTEN（稀釋1∶500）、PI3K（稀釋1∶800）、p-Akt（稀釋1∶800）、β-actin（稀釋 1∶1 000）抗體孵育，回收一抗，TBST 洗滌，加稀釋（均為1∶2 000）山羊抗兔抗體，孵育洗滌，曝光檢測，分析蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白條帶灰度值與β-actin內(nèi)參條帶灰度值比值為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植瘤體積 生長曲線顯示，隨干預(yù)時(shí)間延長，各組小鼠移植瘤體積逐漸增長，干預(yù)第2、4天4組小鼠移植瘤體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)第 6、8、10、12、14 天 PSSC 低劑量組、PSSC 高劑量組、順鉑組小鼠移植瘤體積低于模型組，且PSSC高劑量組、順鉑組小鼠移植瘤體積低于PSSC低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)第 6、8、10、12、14天PSSC高劑量組、順鉑組兩組小鼠移植瘤體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠移植瘤體積生長曲線Fig.1 Growth curve of transplanted tumor volume of mice in each group

2.2 移植瘤質(zhì)量 4組小鼠移植瘤質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較顯示，PSSC低劑量組、PSSC高劑量組、順鉑組小鼠移植瘤質(zhì)量低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC高劑量組、順鉑組小鼠移植瘤質(zhì)量低于PSSC低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC高劑量組、順鉑組兩組小鼠移植瘤質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠移植瘤質(zhì)量比較（±s）Tab.1 Comparison of transplanted tumor quality of mice in each group（±s）g

表1 各組小鼠移植瘤質(zhì)量比較（±s）Tab.1 Comparison of transplanted tumor quality of mice in each group（±s）g

注：與模型組比較，*P＜0.05；與 PSSC 低劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 移植瘤質(zhì)量模型組 11 0.92±0.21 PSSC低劑量組 11 0.65±0.16*PSSC高劑量組 10 0.34±0.10*#順鉑組 10 0.31±0.09*#

2.3 外周血淋巴細(xì)胞亞群 5組小鼠外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較顯示，模型組外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC低劑量組、PSSC高劑量組外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例高于模型組，順鉑組外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC高劑量組外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例高于PSSC低劑量組，順鉑組外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例低于PSSC低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例比較（±s）Tab.2 Comparison of CD4+and CD3+T cells in peripheral blood of mice in each group（±s）%

表2 各組小鼠外周血CD4+、CD3+T細(xì)胞比例比較（±s）Tab.2 Comparison of CD4+and CD3+T cells in peripheral blood of mice in each group（±s）%

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 PSSC 低劑量組比較，△P＜0.05。

組別 動物數(shù) CD4+T細(xì)胞 CD3+T細(xì)胞對照組 12 44.38±6.22 60.04±7.03模型組 11 26.02±3.87* 38.17±4.68*PSSC 低劑量組 11 29.97±4.15# 45.02±5.01#PSSC 高劑量組 10 35.17±4.46#△ 51.14±5.47#△順鉑組 10 22.69±3.01#△ 31.22±4.95#△

2.4 腫瘤病理組織變化 模型組腫瘤細(xì)胞核大而深染，核漿比值高，細(xì)胞膜完整，整體排列緊密；干預(yù)后，PSSC低劑量組、PSSC高劑量組、順鉑組出現(xiàn)不同程度改變，PSSC低劑量組細(xì)胞核染色稍淺，細(xì)胞膜輪廓不清，部分細(xì)胞核分裂，腫瘤細(xì)胞密度降低，而PSSC高劑量組、順鉑組上述變化程度進(jìn)一步加重，細(xì)胞核固縮，核分裂明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯不完整，壞死區(qū)域增大。見圖2。

圖2 各組小鼠HE染色腫瘤病理變化（×200）Fig.2 Pathological changes of tumor stained with HE in mice of each group(×200)

2.5 腫瘤細(xì)胞凋亡率 4組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較顯示，PSSC低劑量組、PSSC高劑量組、順鉑組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC高劑量組、順鉑組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率高于PSSC低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC高劑量組與順鉑組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of tumor cell apoptosis rate of mice in each group（±s）%

表3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較（±s）Tab.3 Comparison of tumor cell apoptosis rate of mice in each group（±s）%

注：與模型組比較，*P＜0.05；與 PSSC 低劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) 凋亡率模型組 11 3.01±1.14 PSSC低劑量組 11 12.03±3.95*PSSC高劑量組 10 29.45±4.01*#順鉑組 10 30.07±4.34*#

2.6 移植瘤PTEN、PI3K及p-Akt蛋白表達(dá) 4組小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩兩比較顯示，PSSC低劑量組、PSSC高劑量組、順鉑組移植瘤PTEN蛋白表達(dá)高于模型組，移植瘤PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC高劑量組、順鉑組移植瘤PTEN蛋白表達(dá)高于PSSC低劑量組，移植瘤PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)低于PSSC低劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PSSC高劑量組、順鉑組兩組移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 各組小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of PTEN，PI3K and p-Akt proteins in transplanted tumors of mice in each group

表4 各組小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt1蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，PI3K and p-Akt1 protein expression in transplanted tumors of mice in each group（±s）

表4 各組小鼠移植瘤PTEN、PI3K、p-Akt1蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，PI3K and p-Akt1 protein expression in transplanted tumors of mice in each group（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與 PSSC 低劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù) PTEN PI3K p-Akt模型組 11 0.14±0.30 0.93±0.13 0.89±0.10 PSSC 低劑量組 11 0.50±0.06* 0.81±0.11* 0.75±0.09*PSSC 高劑量組 10 0.83±0.09*# 0.50±0.08*# 0.46±0.07*#順鉑組 10 0.86±0.10*# 0.47±0.09*# 0.45±0.08*#

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥提取物逐漸被應(yīng)用于骨肉瘤新靶點(diǎn)治療中，在阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[10-11]。周文靜等[10]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，石見穿治療肺癌的機(jī)制與抗炎、抑制腫瘤血管新生等有關(guān)；而另有學(xué)者總結(jié)發(fā)現(xiàn)[11-12]石見穿提取物中的多糖、三萜、多酚等有效成分能抑制腫瘤細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)凋亡，而PSSC是石見穿主要活性成分，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、線粒體損傷，可通過阻礙Wnt/β-catenin信號通路來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲。本研究建立骨肉瘤小鼠模型，予以不同方式干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSSC可阻滯腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞無法無限制復(fù)制繁殖，降低移植瘤體積與質(zhì)量，減輕小鼠腫瘤病理變化程度，以抑制腫瘤進(jìn)展。

目前證實(shí)PTEN作為抑癌基因，PTEN缺失可使機(jī)體不同程度失去抵抗腫瘤的能力[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[14-15]，通過靶向PTEN，可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖或凋亡，臨床或可通過直接靶向骨肉瘤PTEN來研發(fā)相關(guān)藥物，以發(fā)揮更為安全有效的用藥價(jià)值。本研究進(jìn)一步分析PSSC在骨肉瘤小鼠T淋巴細(xì)胞群與PTEN相關(guān)蛋白表達(dá)中的作用發(fā)現(xiàn)PSSC在提高小鼠免疫能力與促進(jìn)PTEN表達(dá)方面有肯定效果，且PSSC高劑量組效果優(yōu)于低劑量組，另外PSSC高劑量組蛋白表達(dá)水平與順鉑組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但順鉑組出現(xiàn)明顯免疫抑制，從而表明PSSC可通過激活PTEN、抑制PI3K/p-Akt表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可提高小鼠免疫活性，多靶點(diǎn)整體提高抑癌效果。

綜上，PSSC可增強(qiáng)骨肉瘤小鼠免疫活性，降低移植瘤體積、質(zhì)量，提高腫瘤細(xì)胞凋亡率，其機(jī)制可能是PSSC可激活PTEN通路，促進(jìn)PTEN蛋白表達(dá)，降低PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)以發(fā)揮抑癌作用，為臨床骨肉瘤藥物研發(fā)提供新思路及理論支持。