石佳，劉愛峰，靳博，崔中賞，張聰聰

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種慢性退行性關(guān)節(jié)病，常表現(xiàn)為軟骨下骨質(zhì)增生硬化、滑膜無菌性炎癥、軟骨剝脫等特征，導(dǎo)致患者膝關(guān)節(jié)活動疼痛、僵硬和活動嚴重受限，其病因病機現(xiàn)尚無統(tǒng)一定論。中醫(yī)藥治療KOA，更具簡便效廉之優(yōu)，減輕患者經(jīng)濟負擔，提高生活質(zhì)量，緩解臨床癥狀[1]。

KOA屬“痹證”“骨痹”范疇，肝腎不足則風(fēng)寒濕之邪易于侵入，氣機運行不暢，日久則氣血瘀滯而發(fā)病，故其病為本虛標實之證，肝腎虧虛為本，氣滯血瘀為標，臨證亦以腎虛血瘀最為常見[2]。清代趙竹泉所著《傷科大成》中補腎活血湯（BHD）由熟地黃、當歸尾、沒藥、山茱萸、菟絲子、破故紙、杜仲、枸杞子、肉蓯蓉、紅花和獨活11味藥組成，可達補腎壯筋，活血止痛之效。因其成分較為復(fù)雜，治療KOA機制仍需探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為中醫(yī)藥研究的一個新興領(lǐng)域，通過構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，探討藥物與機體的作用[3]。文章旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘分析BHD治療腎虛血瘀型KOA的具體有效化學(xué)組分和藥效靶點，篩選主要靶點與通路深入探析，并對此方治療KOA作用機制予以進一步明確，以作為臨床用藥的有效參考。

1 材料與方法

1.1 補腎活血湯主要作用靶點和相關(guān)疾病靶點的收集 通過Swiss Target Prediction搜索BHD的中藥，按照以下篩其主要活性成分靶點：一是口服生物利用率高于30%；二是藥物相似性須高于0.18。運用 GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索與KOA基因相關(guān)的數(shù)據(jù)資料。經(jīng)相互分析后，得出BHD與KOA的共同靶點蛋白。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)、藥物-成分-靶點圖的構(gòu)建 根據(jù)得出的結(jié)果，繼而使用Cytoscape3.6.1結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析研究所需的藥物—成分—靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 靶點通路分析 將靶點結(jié)果輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，通過輸入靶基因名稱列表并選定物種為“homo sapiens”，點擊Custom analysis設(shè)置參數(shù)分析，進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）與基因功能（GO）富集分析。

1.4 分子對接 分子對接處理是分析藥方對病癥的具體干預(yù)機制。將藥物靶點化合物按其度值排序，選其度值前10位的化合物，依下流程與腫瘤壞死因子（TNF），蛋白激酶 B1（AKT1），人磷酸肌醇-3-激酶催化亞基G肽（PIK3CG）等相關(guān)的蛋白進行分子對接操作。

1.4.1 對小分子及蛋白處理 單體小分子化合物首先使用Syby12.0軟件進行模擬構(gòu)建和結(jié)構(gòu)的能量優(yōu)化，結(jié)果存儲為mol2格式文件。在蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB）下載TNF，PIK3CG，AKT1蛋白晶體結(jié)構(gòu)，蛋白 ID 為 3KMC，6AUD，6HHI，并在 Syby12.0 中將蛋白分為有配體和無配體兩種類型，其分類結(jié)果分別存儲為PDB格式文件。

1.4.2 進行分子對接操作 該操作涉及LGA遺傳算法，應(yīng)用軟件AutoDock4.2。

首先通過該軟件打開無配體蛋白PDB文件，模擬加入電荷以確定各個蛋白晶體具體結(jié)合域，設(shè)置xyz軸規(guī)格均為40格點的結(jié)合晶格。導(dǎo)入生成的mol2格式文件并生成pdbqt文件，基于該文件在結(jié)合晶格處與蛋白用遺傳算法虛擬對接操作。其運行次數(shù)設(shè)置為30輪次，小分子旋轉(zhuǎn)鍵扭轉(zhuǎn)及四元數(shù)的次數(shù)均為30，其他使用軟件默認設(shè)置。

1.4.3 對接結(jié)果分析 將對接結(jié)果按照結(jié)合能絕對值的大小由高到低排序，選擇其中絕對值最高的構(gòu)相，使用Pymol軟件模擬可視分析其具體的結(jié)合位點并保存操作結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò) 將上述分析得出的82種主要活性化合物使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測其主要活性成分調(diào)控靶點，將其重復(fù)部分去除，最終篩選出靶點數(shù)量為615個。續(xù)用Cytoscape生成“藥物—成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)，具體結(jié)果如圖1所示，該網(wǎng)絡(luò)有1 993條邊及669個節(jié)點。

圖1 補腎活血湯藥物-成分-靶點圖Fig.1 Bushen Huoxue Decoction drugs-composition-target diagram

表1列舉了對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析的參數(shù)設(shè)置，其目的是為了明確各個活性成分調(diào)控的作用程度，對應(yīng)的靶點邊數(shù)越多則調(diào)控程度越高。其排名前10的成分為蛇床子素、川白芷素、二氫山芹醇醋酸酯、傘形酮等為BHD的主要活性成分。

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析參數(shù)表Tab.1 PPI network topology analysis parameter table

2.2 預(yù)測補腎活血湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的靶點 根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫對KOA的治療靶點檢索，設(shè)置相關(guān)性大于5的條件進行篩選，得到564個相關(guān)靶點數(shù)量，再用Venn平臺將KOA靶點與BHD靶點進行交集篩選，最終得出總數(shù)為82的靶點集合，見圖2。

圖2 補腎活血湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎靶點Venn圖Fig.2 Venn figure of the target of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of knee osteoarthritis

2.3 補腎活血湯與膝骨性關(guān)節(jié)炎蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述82個靶點在STRING平臺上進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，核心網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）包含918條邊，節(jié)點數(shù)為82個，其中節(jié)點表示蛋白，每條邊即代表兩個蛋白之間存在相互作用，關(guān)聯(lián)度與線條數(shù)量成正比；該網(wǎng)絡(luò)中靶蛋白節(jié)點度均值22.4，其中有36個靶蛋白節(jié)點度均超過均值，這些靶蛋白可視為關(guān)鍵靶點，也是BHD的調(diào)節(jié)作用來源。表2中將排名前20的關(guān)鍵靶點進行排序，其中TNF、轉(zhuǎn)錄激活因子 3（STAT3）、絲裂原激活的蛋白激酶 1（MAPK1）等多個靶點均與炎癥性疾病有高度關(guān)聯(lián)。

圖3 補腎活血湯與膝骨性關(guān)節(jié)炎蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（PPI）圖Fig.3 Core network（PPI）diagram of protein interaction between Bushen Huoxue Decoction and knee osteoarthritis

表2 補腎活血湯PPI網(wǎng)絡(luò)中大于平均度值的前20靶標蛋白Tab.2 Top 20 target proteins in the PPI network of Bushen Huoxue Decoction were higher than the average value

2.4 補腎活血湯靶點通路分析 在DAVID數(shù)據(jù)庫中使用以上分析得出的82個靶點進行GO富集分析與KEGG通路注釋，得出分子功能、生物過程和細胞成分的GO條目與富集通路數(shù)量分別為119個和95條，根據(jù)以上結(jié)果得出圖4中所示的TOP10富集柱狀圖，為GO富集到藥物所調(diào)節(jié)的相關(guān)生物功能。GO功能富集主要涉及凋亡信號途徑、外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等。KEGG通路分析按照P值排列前20通路分析后發(fā)現(xiàn)，KEGG通路主要參與調(diào)控TNF信號通路，缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，破骨細胞分化，PI3K-Akt信號通路等。見圖5。其中主要通路涉及的相關(guān)靶點為 TNF，AKT1，MAPK1，MAPK14，PI3KCG 等。BHD的成分靶點與KEGG通路交互網(wǎng)絡(luò)尋找主要的蛋白靶點，見圖6，KEGG通路中與KOA相關(guān)的通路主要涉及TNF，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，破骨細胞分化，PI3KAkt信號通路，對通路中靶點進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，見圖7，按照P值排列，TNF信號通路排第一位，通路中涉及的靶點主要如表3所示。通過STRING分析平臺，將TNF信號通路中的靶點進行PPI交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，見圖8，得到通路中的TNF，PIK3CG，AKT1的相關(guān)性較好，因此將進一步選取前10個主要成分對炎癥靶點進行分子對接驗證。

圖4 補腎活血湯靶點的GO富集分析圖Fig.4 Go enrichment analysis diagram of Bushen Huoxue Decoction target

圖5 補腎活血湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的KEGG富集分析圖Fig.5 KEGG enrichment analysis of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of knee osteoarthritis

圖6 補腎活血湯成分-靶點-通路圖Fig.6 Ingredients-target-pathway chart of Bushen Huoxue Decoction

圖7 補腎活血湯與膝骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Related proteins network map of Bushen Huoxue Decoction and knee osteoarthritis

圖8 補腎活血湯參與TNF信號通路的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 PPI network diagram of Bushen Huoxue Decoction and TNF signaling pathway

表3 涉及TNF信號通路的靶點Tab.3 Targets involved in the TNF signaling pathway

2.5 分子對接 分子對接驗證中，結(jié)合能數(shù)值如表4所示，藥物的主要成分中：蛇床子素，川白芷素，藁本內(nèi)酯，傘形酮及阿魏酸等，與AKT，TNF，PI3KCG的對接效果較好。顯示BHD的主要成分具有潛在調(diào)節(jié)炎癥靶點的作用，起到抗炎作用。主要成分與AKT，TNF，PI3KCG的對接3D圖譜如圖9～11所示。

表4 主要藥物成分與蛋白受體的結(jié)合能表Tab.4 Binding energy table of major drug ingredients and protein receptors

圖9 藥物主要活性成分與AKT1（PDB：6HHI）的分子對接；用PyMOL軟件顯示3D圖譜Fig.9 Main active ingredients were docked with AKT1（PDB：6HHI）molecules；Display 3D atlas with PyMOL software

圖10 藥物主要活性成分與PIK3CG（PDB：6AUD）的分子對接；用PyMOL軟件顯示3D圖譜Fig.10 Main active ingredients were docked with PIK3CG（PDB：6AUD）；Display 3D atlas with PyMOL software

圖11 藥物主要活性成分與TNF（PDB：3KMC）的分子對接；用PyMOL軟件顯示3D圖譜Fig.11 Main active ingredients of the drug were docked with TNF（PDB：3KMC）；Display 3D atlas with PyMOL software

3 討論

KOA應(yīng)用中醫(yī)藥治療研究取得了一些重要進展，對指導(dǎo)與改善中醫(yī)藥臨床應(yīng)用有著積極的作用。KOA核心病機以肝腎虧虛為本，氣滯血瘀為標，腎虛血瘀為主貫穿始終，BHD以補腎壯筋，活血止痛為主，對腎虛血瘀型頗具良效。《靈樞·刺節(jié)真邪》言：“虛邪之中人也……其入深，內(nèi)搏于骨，則為骨痹……留而不去，則痹?！标U明腎主骨生髓，為先天之本；若先天稟賦不足，或后天耗損太過，則精不足，精不足則無以化生氣血，腎虧髓少，則氣虛血瘀，筋脈淤阻，內(nèi)博于骨，則發(fā)骨痹。腎主藏精，在體合骨，故腎精虧虛，骨失所養(yǎng)，可致腰膝酸痛?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“氣行則血行，氣滯則血瘀?！睔鈾C運行不暢則脈道不利，不通則痛，言膝痹之標在于血瘀，故治療腎虛血瘀型KOA當以補腎活血為大法。據(jù)此提出使用《傷科大成》補腎活血湯治療，直指根本。多項研究表明，補腎活血的中藥具有明確的降低血清、關(guān)節(jié)軟骨及滑膜部位的NO含量，以及減少脂質(zhì)過氧化的程度，從而達到縮短病程、保護軟骨細胞和降低退行性病變速度的作用。

通過應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，提取出BHD中482種疾病基因和533個藥物靶點，將其與KOA疾病靶點數(shù)據(jù)庫進行交集從而得出82個有效靶點，使用PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)合STRING平臺進行分析并得出關(guān)鍵靶蛋白共36種，靶蛋白平均節(jié)點度值為22.4，包括 TNF、AKT1、MMP9、IL1B、PTGS2、CASP3、MMP2、MAPK8等。再對以上關(guān)鍵靶點構(gòu)建分析網(wǎng)絡(luò)，以蛇床子素、川白芷素、二氫山芹醇醋酸酯、傘形酮、阿魏酸松柏酯、東莨菪亭、洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸、佛手苷內(nèi)酯、藁本內(nèi)酯為度值排名前10成分。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)以上化合物抗菌、抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎活性、抗老化、舒張血管及抗微生物活性等作用明顯[4]。蛇床子素是抗炎鎮(zhèn)痛主要成分，能夠有效地改善骨代謝水平[5-7]，通過抑制IL-1β等炎癥介質(zhì)的釋放發(fā)揮保護KOA軟骨組織的作用，可作為下游靶點的調(diào)控分子調(diào)控機體的炎性反應(yīng)，降低PI3KCG/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白PI3KCG、AKT蛋白的表達[8]；通過抑制MAPK的磷酸化和MMP活性，從而抑制TNF基因的表達，達到治療KOA的作用[9]。川白芷素對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的巨噬細胞有一定阻斷作用，從而發(fā)揮一定的抗炎功效。Ouyang等[10]研究表明，傘形酮治療OA療效顯著，通過抑制MAPK信號通路可能是其治療OA的潛在靶點。東莨菪亭可通過MAPK信號通路抑制IL-6的產(chǎn)生而達到改善軟骨降解、軟骨細胞存活、軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)和軟骨下骨結(jié)構(gòu)的完整性，從而減輕KOA的進展和關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)。佛手苷內(nèi)酯可通過減輕磷酸三鈣磨損顆粒誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及PERK通路活化而阻止骨細胞凋亡[11]。研究表明，洋川芎內(nèi)酯A、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯、阿魏酸等化合物與抗血小板聚集活性相關(guān)性大，有效促進新血管形成有效物質(zhì)，舒張血管。藁本內(nèi)酯還可通過抑制癌細胞生長、血管平滑肌細胞過度生長達到鎮(zhèn)痛消炎作用[12]。以上表明BHD可能通過本次篩選的主要藥物成分作用于AKT、TNF、PI3KCG等靶點達到治療KOA，分子對接結(jié)果亦顯示上述化合物潛在調(diào)節(jié)炎癥靶點的作用，保護軟骨及其環(huán)境，改善骨代謝，改善血流動力，改善微循環(huán)，從而達到補腎活血之效。

KOA的發(fā)病機制是由于關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，存在過多的炎癥因子而誘發(fā)，其治療思路在于調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥因子濃度[13]。根據(jù)GO富集分析生成的119個GO條目的結(jié)果，證明BHD中的活性成分可以在人體細胞質(zhì)、細胞液、微絨毛等多處細胞部位對炎癥反應(yīng)起到調(diào)控作用，其涉及過程包括細菌防御反應(yīng)、信號通路刺激或阻斷等。據(jù)KEGG富集分析的結(jié)果，BHD治療KOA的關(guān)鍵靶點數(shù)量為36，其涉及到的信號通路主要包括TNF和HIF-1信號通路，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，破骨細胞分化，PI3K-Akt信號通路等信號通路。Sandra等[14]研究發(fā)現(xiàn)TNF因子過量可激活胰蛋白酶原，繼而對軟骨細胞形成過度刺激從而導(dǎo)致軟骨部位發(fā)炎壞死，可刺激滑膜周圍血管導(dǎo)致滑膜腺體萎縮而導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹間接影響KOA的發(fā)生。Wang等[15]研究使用IL-1Ra和可溶性的TNF受體，可協(xié)同抑制TNF-α從而延緩關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。HIF信號通路是低氧反應(yīng)信號之一，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生HIF-1α并激活下游相關(guān)的基因，刺激破骨細胞分化而引起KOA；PI3K-AKT信號通路亦可促進HIF-1的表達及其穩(wěn)定[16]。Li等[17]研究表明MAPK信號通路的激活與OA中軟骨細胞凋亡、炎癥及膠原蛋白降解過程相關(guān)；亦可通過介導(dǎo)調(diào)控骨性關(guān)節(jié)炎軟骨病變的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其相關(guān)信號通路的激活可改變基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，誘導(dǎo)MMP-13的表達，導(dǎo)致軟骨特性的Ⅱ型膠原進行性降解，從而調(diào)控軟骨細胞的細胞凋亡及骨破壞等一系列反應(yīng)，影響KOA的發(fā)生與發(fā)展，并調(diào)節(jié)細胞的炎性反應(yīng)[18-19]。PI3K-AKT信號通路由多種因素激活，并參與多種下游細胞因子、炎癥介質(zhì)如TNF-α等的基因轉(zhuǎn)錄[20]，對于關(guān)節(jié)炎癥有激發(fā)和加重的作用。在大量軟骨細胞發(fā)生損傷時，PI3K激活并令A(yù)KT磷酸化，阻止軟骨細胞的凋亡過程，達到對KOA的治療作用[21]。由此推測，BHD可能通過活性成分作用于TNF，AKT1，MAPK等關(guān)鍵靶點，激活或抑制TNF，破骨細胞分化，PI3K-Akt等多條信號通路，通過調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖與凋亡和促進血管生成等過程，達到提高免疫力、逐步改善關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境和抑制炎癥的目標，達到治療效果。

綜上所述，文章通過研究，將大量的數(shù)據(jù)使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法整合與分析，應(yīng)用分子對接技術(shù)對其靶點進行驗證，構(gòu)建BHD治療KOA的靶點交互作用的網(wǎng)路圖，將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法與中醫(yī)整體觀契合，為中醫(yī)藥的發(fā)展研究開辟新思維。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為近幾年來中醫(yī)藥研究的一個新興領(lǐng)域，將傳統(tǒng)中醫(yī)復(fù)方通過多學(xué)科交叉研究，構(gòu)建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，探索藥物與機體相互作用的途徑。微觀水平闡明BHD通過多靶點、多通路從抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細胞增生、細胞凋亡及新血管生成等方面發(fā)揮治療KOA的潛在機制，為BHD的臨證提供微觀依據(jù)。后續(xù)可深入研究BHD中藥的化學(xué)成分復(fù)雜性，應(yīng)用具有高分離、高分辨的高效液相色譜儀，并對中藥的提取物成分進行定性鑒定，為復(fù)方中藥中所含化學(xué)成分進行鑒別。應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用定性分析方法，可進一步驗證復(fù)方中的活性成分和全定性分析思想實際的可行性，為闡明中草藥的物質(zhì)基礎(chǔ)提供有力支持，可更深層次驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中所篩選出的藥效靶點成分[22-23]。