蘇健，杜曉琴，葉娟，張雅楠，邢麗，陳燕，孔曉，劉雪鷗

（1.天津市中心婦產科醫(yī)院，天津 300052；2.天津市醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院，天津 300020）

近年來，隨著排卵障礙引起的不孕癥逐年增多，嚴重影響著廣大女性的生活質量。西醫(yī)在治療排卵障礙成功率上有明顯優(yōu)勢，然而臨床療效不穩(wěn)定，停藥后患者月經周期及卵巢功能不能徹底恢復至正常，且可能伴隨嚴重并發(fā)癥[1-4]。傳統中醫(yī)藥治療排卵障礙有明顯優(yōu)勢，在促進排卵的同時對于機體的整體功能具有明顯促進作用[5]。由本院自主研制的促排合劑近十余年來在本院臨床廣泛應用，可益腎調經，促排卵，調節(jié)內分泌，對于腎虛不孕、月經不調、內分泌功能失調患者的治療取得了顯著的效果，但目前仍無促排合劑改善生殖調控作用機制的相關研究報道。文章以“腎氣-天癸-沖任-胞宮”的平衡協調理論為基礎，探討促排合劑對腎陽虛排卵障礙模型大鼠生殖內分泌功能影響的作用機制，從而為促排合劑的臨床應用提供了實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 動物 雌性SD健康大鼠60只，SPF級，6周齡，體質量（200±10）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0006。常規(guī)飼養(yǎng)于天津南開醫(yī)院動物中心，標準合格環(huán)境中。

1.2 藥物 促排合劑由生地黃、熟地黃、枸杞子、酒山萸肉、麥冬、牡丹皮、附片、肉桂、干益母草、覆盆子、菟絲子、制巴戟天、炙淫羊藿、制何首烏、酒肉蓯蓉15味中藥組成（津藥制字Z20070552號，批號：20200909，由天津市中心婦產科醫(yī)院藥劑科提供）。枸櫞酸氯米芬片（Codal Synto Limited生產，50mg/片，批號L0806）。氫化可的松注射液（天津金耀藥業(yè)公司生產，批號：1911201）。

1.3 主要試劑與儀器 離心機（可成儀器，L3-5KR，離心半徑19 cm），全自動酶標儀（THERMO V.2.3），快速瑞氏-姬姆薩染色試劑盒（天津航瑞成生物科技有限公司，批號E607315）孕酮（P）測定試劑盒（上海嵐派生物科技有限公司，以下此廠家簡稱上海嵐派，批號201910），促性腺激素釋放激素（GnRH）測定試劑盒（上海嵐派，批號201910），卵泡刺激素（FSH）測定試劑盒（上海嵐派，批號201910），黃體生成素（LH）測定試劑盒（上海嵐派，批號201910），血清雌二醇（E2）測定試劑盒（上海嵐派，批號 201910），腎上腺皮質激素（ACTH）測定試劑盒（上海嵐派，批號201910），皮質醇（COR）測定試劑盒（上海嵐派，批號201910），總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒（武漢博士康生物工程有限公司，以下此廠家簡稱武漢博士康，批號20190210），丙二醛（MDA）測定試劑盒（武漢博士康，批號20190302），過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（武漢博士康，批號20190408）。

2 實驗方法

2.1 巴氏染色觀察大鼠動情周期變化 陰道細胞學檢查將蘸取生理鹽水（NaCl，0.9%）的無菌小棉簽輕輕地插入大鼠陰道口緩慢轉動充分粘取陰道黏液，然后將采集的黏液均勻地涂在干凈的玻片上，待涂片自然干燥。干燥后，用95%乙醇固定2～3 min→蒸餾水沖洗2～3 min→在涂片上滴加一核染液染色2 min→自來水沖洗30～60 s→在涂片上滴加試劑二漿染液染色2 min左右→立即在涂片上滴加三增色液增色5 s→再用增色液沖洗涂片1遍→取出后用濾紙吸干→轉移至倒置顯微成像系統下觀察涂片。

2.2 造模 本實驗在之前其他學者研究的基礎上，選擇較為經典且應用最多的肌注氫化可的松的方法[6]復制腎陽虛排卵障礙大鼠模型，以獲得腎陽虛表現穩(wěn)定，排卵障礙明顯的大鼠模型。

空白對照組每日肌注等容積生理鹽水，其余5組按上述造模方法每日下肢肌注氫化可的松注射液25 mg/kg，連續(xù)11 d。肌注氫化可的松第6日起每日早晨連續(xù)陰道涂片（1個性周期4～5 d）。每日上午9點進行陰道細胞學檢查，觀察造模期間大鼠動情周期地變化。

2.3 實驗分組及給藥方法 成年雌性SD大鼠60只，隨機分為6組，每組10只。第1組為空白對照組，后5組建立動物模型，分別為模型對照組、氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組?？瞻讓φ战M每日肌注等容積生理鹽水，其余5組按上述造模方法肌注氫化可的松。模型制備成功后，促排合劑組按等效劑量0.5、1、2倍作為低、中、高劑量組劑量標準。按大鼠劑量（g/kg）=成人劑量（g）×0.018/0.2 kg作為大鼠等效劑量。氯米芬陽性組大鼠劑量為4.5 mg/kg，模擬人的月經周期，在15 d的治療期（3個性周期），每個性周期的前2 d給藥，后3 d停藥。模型對照組及空白對照組以l mL/100 g體質量灌服生理鹽水，每日1次，連續(xù)15 d。

2.4 指標檢測

2.4.1 大鼠給藥前后腎陽虛癥狀 腎陽虛癥狀表現：外觀見豎毛、毛無光澤，拱背少動，飲食減少，體質量下降，反應遲鈍，呼吸深遲，肉眼未見外生殖器潮濕、陰道口變大、觸之興奮等動情期反應。

2.4.2 大鼠給藥前后體質量及臟器質量系數測定 分別于造模前和最后1次給藥后，測量大鼠體質量；最后1次給藥后，大鼠饑餓12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥（1 mL/100 g）麻醉，75%乙醇消毒腹部皮膚，開腹，快速摘除大鼠卵巢、子宮、下丘腦、垂體和腎上腺，剔除附著脂肪組織，立即測定卵巢、子宮、下丘腦、垂體和腎上腺質量，計算各臟器質量系數，質量系數=臟器質量/體質量。

2.4.3 大鼠給藥前后下丘腦-垂體-卵巢軸（HPO軸）相關激素分泌水平檢測 最后1次給藥后，大鼠饑餓12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥（1mL/100Lg）麻醉，75%乙醇消毒腹部皮膚，開腹，腹主靜脈取血，3 200 r/min離心15 min，取上層血清，采用酶聯免疫吸附法（Elisa）測定大鼠血清 P、GnRH、FSH、LH、血清E2含量水平。

2.4.4 大鼠給藥前后下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）相關激素水平檢測 最后1次給藥后，大鼠饑餓12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥（1mL/100 g）麻醉，75%乙醇消毒腹部皮膚，開腹，腹主靜脈取血，3 200 r/min離心15 min，取上層血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清ACTH和COR含量水平。

2.4.5 大鼠給藥前后氧化應激相關因子水平檢測 最后1次給藥后，大鼠饑餓12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥（1 mL/100 g）麻醉，75%乙醇消毒腹部皮膚，開腹，腹主靜脈取血，3 200 r/min離心15 min，取上層血清，采用ELISA測定大鼠血清T-SOD、MDA和CAT含量水平。

2.5 統計學方法 本研究采用SPSS 26．0軟件對數據進行統計分析，計量資料采用平均值±標準差（±s）進行描述，多組間數據差異比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊時采用LSD檢驗；若方差不齊時，使用Tamhane’s T2檢驗。所有檢驗均采取雙側檢驗，檢驗水準α=0．05。

3 結果

3.1 陰道分泌物圖片 通過大鼠陰道分泌物涂片，可見大鼠動情周期：動情間期（A）、動情前期（B）及動情后期（C）、動情期（D），見圖1。動情間期：鏡下可見大量白細胞；動情前期：鏡下可見大量有核上皮細胞；動情后期：鏡下可同時見角化上皮細胞、白細胞及有核上皮細胞；動情期：鏡下可見大量角化上皮細胞。

圖1 大鼠陰道分泌物涂片（×200）Fig.1 Vaginal secretions smear of rats（×200）

3.2 各組動情周期紊亂率 正常飼養(yǎng)的大鼠動情周期呈現“B-D-C-A”的連續(xù)變化且穩(wěn)定。造模階段除空白對照組以外各組均出現不同數量大鼠動情周期紊亂并伴有動情間期消失現象，然而，在給藥期間，大部分動情周期紊亂的大鼠仍未恢復到正常階段。見表1。

表1 各組大鼠動情周期紊亂率Tab.1 Disordered rate of estrous cycle of rats in each group %

3.3 各組大鼠造模前后體質量比較 造模前，各組間大鼠體質量差異均無統計學意義（P＞0．05）；給藥15 d后，模型對照組、氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組大鼠體質量均低于空白對照組水平，而氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組大鼠體質量均高于模型對照組水平，差異具有統計學意義（P＜0．05），各組大鼠造模前后體質量比較結果詳見表2。

表2 各組大鼠造模前后體質量比較Tab.2 Comparison of body weight of rats before and after modeling

3.4 各組大鼠給藥后各臟器質量系數比較 給藥15 d后，模型對照組、氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組大鼠卵巢、子宮、下丘腦、垂體和腎上腺等臟器質量系數均低于空白對照組水平，而氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組大鼠各臟器質量系數均高于模型對照組水平，差異具有統計學意義（P＜0．05），各組大鼠給藥后各臟器質量系數比較結果詳見表3。

表3 各組大鼠給藥后各臟器質量系數比較Tab.3 Comparison of weight coefficients of each organ in each group after drug administration mg/100 g

3.5 各組大鼠HPO軸相關激素分泌水平比較 模型對照組大鼠血清P、GnRH、FSH、LH和E2含量水平均低于空白對照組水平，雖然氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組大鼠血清P、GnRH、FSH、LH和E2含量水平均低于空白對照組水平，然而均高于模型對照組水平，差異具有統計學意義（P＜0．05），各組大鼠HPO軸相關激素分泌水平比較結果詳見表4。

表4 各組大鼠HPO軸相關激素分泌水平比較Tab.4 Comparison of HPO axis-related hormone secretion levels in each group mU/mL

3.6 各組大鼠HPA軸相關激素分泌水平比較 模型對照組大鼠血清ACTH和COR含量水平均低于空白對照組水平，雖然氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組大鼠血清ACTH和COR含量水平均低于空白對照組水平，然而均高于模型對照組水平，差異具有統計學意義（P<0.05），各組大鼠HPA軸相關激素分泌水平比較結果詳見表5。

表5 各組大鼠HPA軸相關激素分泌水平比較Tab.5 Comparison of HPA axis-related hormone secretion levels in each group

3.7 各組大鼠氧化應激相關因子分泌水平比較 模型對照組大鼠血清T-SOD和CAT含量水平均低于空白對照組水平，而MDA含量水平顯著高于空白對照組水平；雖然氯米芬陽性組、促排合劑低、中、高劑量組大鼠血清T-SOD和CAT含量水平均低于空白對照組水平，MDA含量水平高于空白對照組水平，然而T-SOD和CAT含量水平均高于模型對照組水平，且MDA含量水平高于模型對照組水平，差異具有統計學意義（P<0.05），各組大鼠氧化應激相關因子分泌水平比較結果詳見表6。

表6 各組大鼠氧化應激相關因子分泌水平比較Tab.6 Comparison of the secretion levels of oxidative stress related factors in each group

4 討論

不孕癥通常由于卵巢功能減退導致排卵功能障礙所致，且誘發(fā)不孕的危險因素不斷增多，困擾著廣大育齡女性[7]。在傳統中醫(yī)領域，“腎-天癸-沖任-胞宮”是闡述女性生殖功能的重要理論基礎，該理論認為腎氣陰陽平衡是維持女性月經周期、生殖功能的重要保障，對女性生殖激素分泌水平、下游靶器官激素受體數目及受體對于激素作用的敏感性均產生重要影響[8-10]。若腎陽虛損，則可導致虛寒衰弱諸癥及生殖機能的減退，因此，通過溫補腎陽，恢復腎氣陰陽平衡，改善生殖激素內分泌功能，是臨床治療不孕癥的重要途徑[11-16]。促排合劑作為本院自主研發(fā)的現代中成制劑，已有近十余年臨床應用實踐經驗，在治療女性不孕癥方面，臨床療效和用藥安全性方面得到了廣大患者的認可，方中主要成分熟地黃、酒肉蓯蓉發(fā)揮補血養(yǎng)陰、填精益髓、溫補腎陽之功效，枸杞子、制何首烏發(fā)揮滋補肝腎、益精明目之功效，與其他諸藥共奏，共同發(fā)揮溫補腎陽、填精益髓、活血通經之功效。雖然，促排合劑于本院具有較為豐富臨床應用經驗，然而目前缺乏改善生殖功能的藥理學機制研究，不利于該中成方劑在不孕癥治療領域的推廣。

本研究探索了促排合劑對腎陽虛排卵障礙模型大鼠生殖內分泌功能影響的作用機制，研究結果顯示，大部分腎陽虛模型大鼠的動情周期出現紊亂現象，個別鼠動情間期消失，且在給藥期間許多周期紊亂大鼠仍未恢復。模型大鼠的體質量和卵巢、子宮、下丘腦、垂體和腎上腺等生殖功能相關臟器質量系數均低于正常大鼠水平，說明腎陽虛病理狀況對大鼠生殖器官和機體生長發(fā)育均產生阻礙作用，而氯米芬陽性組大鼠和促排合劑不同給藥劑量大鼠體質量的卵巢、子宮、下丘腦、垂體和腎上腺等生殖功能相關臟器質量系數均較腎陽虛模型大鼠顯著改善，說明促排合劑可有助于促進腎陽虛大鼠的生殖器官的生長發(fā)育。現代病理學研究顯示，“腎-天癸-沖任-胞宮”與下丘腦-垂體-靶腺軸（卵巢、腎上腺等）的調控機制密切相關[17-19]。通過研究腎陽虛大鼠性激素分泌水平（HPO軸）變化發(fā)現，腎陽虛模型大鼠血清P、GnRH、FSH、LH和E2含量水平均低于正常大鼠水平，說明腎陽虛病理狀況導致大鼠生殖內分泌功能下降，而氯米芬陽性組大鼠和促排合劑不同給藥劑量大鼠性激素分泌水平較腎陽虛模型大鼠改善，說明促排合劑可有效調節(jié)腎陽虛大鼠生殖內分泌功能，提高性激素分泌水平；通過研究腎陽虛大鼠HPA軸相關激素分泌水平變化發(fā)現，腎陽虛模型大鼠血清ACTH和COR含量均低于正常大鼠水平，而氯米芬陽性組大鼠和促排合劑不同給藥劑量大鼠ACTH和COR分泌水平均較腎陽虛模型大鼠提高，說明促排合劑在發(fā)揮性激素分泌功能調節(jié)作用的同時，可有效改善HPA軸的調節(jié)作用，從而對大鼠生殖功能的改善起到協同促進作用。臨床研究顯示，在女性生殖過程中存在氧化應激反應，且腎陽虛癥狀的加劇與氧化應激反應導致臟器損傷密切相關，也是導致機體器官發(fā)育遲緩的重要機制[20-23]。通過觀察腎陽虛大鼠氧化應激狀況發(fā)現，較正常大鼠，腎陽虛模型大鼠血清氧化應激抑制因子T-SOD和CAT含量水平下調，而氧化應激促進因子MDA含量水平上調，說明腎陽虛大鼠出現氧化應激反應加劇的狀況，而氯米芬陽性組大鼠和促排合劑不同給藥劑量大鼠氧化應激相關因子水平均得到有效改善，說明促排合劑具有緩解腎陽虛大鼠氧化應激反應的作用，從而有利于促進生殖及腺體器官發(fā)育，對生殖功能的改善起到積極作用。

綜上所述，促排合劑可通過改善下丘腦-垂體-靶腺軸調節(jié)功能和緩解氧化應激反應的相關機制，促進腎陽虛大鼠生殖功能的改善和生殖器官的發(fā)育，為該制劑的臨床推廣提供了一定的藥理學依據。然而，由于本研究納入的樣本數量有限，研究周期較短，且僅以大鼠模型為研究對象，存在一定的局限性，后續(xù)有待通過進一步研究，對促排合劑治療不孕癥的藥理學機制進行更加深入和充分的剖析。