孫瑞芳，劉石柱，李瑞東，許雙朝

（1.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，邢臺(tái) 054000；2.邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院放化療科，邢臺(tái) 054000）

肝纖維化是肝炎、脂肪肝等多種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的常見(jiàn)機(jī)制[1]。研究結(jié)果表明，受到氧化應(yīng)激刺激的肝形狀細(xì)胞和肝細(xì)胞會(huì)分泌炎性因子，從而誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，并最終加速肝纖維化進(jìn)程[2]。然而，目前尚無(wú)治療肝纖維化的特效方法?；瘽峥估w保肝湯（HZKXD）是基于“濁毒”原理擬定的具有解毒化濁、行氣活血功效的中藥湯。最新臨床研究發(fā)現(xiàn)化濁抗纖保肝湯與恩替卡韋聯(lián)合使用可提高治療肝纖維化的效果[3]，但是單獨(dú)使用是否具有抗纖維化作用，以及其治療機(jī)制仍不清楚。磷脂肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路是肝纖維化過(guò)程的關(guān)鍵通路之一，體內(nèi)研究結(jié)果顯示肝纖維組織中PI3K/AKT/mTOR通路表達(dá)水平顯著升高[4]。研究已經(jīng)證實(shí)了PI3K/AKT/mTOR通路不但會(huì)促進(jìn)肝星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活化，還會(huì)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的積累，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程[5]。此外，也有研究顯示與HZKXD具有類似功能的抗纖抑癌方也具有抑制PI3K/AKT/mTOR通路的作用[6]。因此，文章主要分析HZKXD對(duì)肝纖維化的治療作用，并分析其對(duì)炎性反應(yīng)和PI3K/AKT/mTOR通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠（SPF級(jí)，雄性，6周齡，體質(zhì)量210～230 g，北京維通利華動(dòng)物公司，中國(guó)）。四氯化碳（Sigma公司，美國(guó)），酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色試劑盒（碧云天公司，中國(guó)），酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-Rad，美國(guó)），RNAspin Mini（GEHealthcare公司，美國(guó)），Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國(guó)），PI3K（##4255，Cell Signaling Technology公司，美國(guó)），AKT（ab8805）、mTOR（ab32028）、GAPDH（ab181602）的一抗和山羊抗免疫球蛋白G二抗（Abcam公司，美國(guó)），硝酸纖維素膜（EMD Millipore公司，美國(guó)），電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國(guó)），顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國(guó)）等。

1.2 大鼠分組、建模和干預(yù)方法 80只大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、低劑量HZKXD組和高劑量HZKXD組（n=20）。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]的方法構(gòu)建肝炎后肝纖維化模型。將四氯化碳溶解于橄欖油中，濃度為10%，腹腔注射，每次1 mL/kg，每周2次，連續(xù)8周。通過(guò)穿刺收集肝組織，利用HE染色和Masson染色在病理學(xué)的角度上分析建模成功率。本次研究無(wú)大鼠死亡，模型組、低劑量HZKXD組和高劑量HZKXD組建模成功率分別為90%（18/20），95%（19/20）和 95%（19/20），在對(duì)照組、低劑量HZKXD組和高劑量HZKXD組中隨機(jī)選擇18只進(jìn)行后續(xù)研究。對(duì)照組注射等量生理鹽水作為對(duì)照。低劑量HZKXD組和高劑量HZKXD組使用化濁抗纖保肝湯灌胃，劑量為5 mL/kg和10 mL/kg，每日1次，連續(xù)8周。對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水。HZKXD的制作方法如下：黃芩15 g，黃連 12 g，鱉甲 15 g，三棱 12 g，紅景天 12 g，田基黃15 g，絞股藍(lán) 15 g，茵陳 15 g，虎杖 15 g，1 000 mL 水制成水煎劑，然后濃縮至20 mL。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 ELISA 取大鼠尾靜脈血，在3 000 r/min的轉(zhuǎn)速下，離心半徑8 cm，離心15 min收集上清液，分別加入抗體和顯色劑，終止顯色反應(yīng)后15 min內(nèi)檢測(cè)吸光度（450 nm），然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的濃度。

1.3.2 HE染色檢測(cè)肝組織損傷 大鼠經(jīng)過(guò)斷頭處死，收集肝組織并放置進(jìn)入多聚甲醛固定48 h。將固定好的組織樣本利用不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水，然后加入二甲苯進(jìn)行透明處理并包埋至石蠟中，使用切片機(jī)切成4 μm厚的切片。切片水化后制成玻片標(biāo)本，加入蘇木精孵育5 min，然后加入0.5%的伊紅染色5 min，洗滌后透化。固定，在顯微鏡下觀察。

1.3.3 Masson染色檢測(cè)纖維化 將1.3.2中的玻片標(biāo)本加入Masson三色染料進(jìn)行染色，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法操作，最后在顯微鏡下觀察并拍照，利用圖IPP 6.0像分析系統(tǒng)計(jì)算膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)。

1.3.4 免疫組化染色 通過(guò)檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）評(píng)估肝組織中成纖維細(xì)胞水平。將1.3.2的樣本用不同濃度的乙醇脫水。經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)后，向切片中加入3%的過(guò)氧化氫溶液以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后，將切片在5%牛血清白蛋白中孵育以封閉非特異性蛋白。然后將1∶50稀釋的anti-α-SMA添加到切片中，并在4℃下孵育12 h。然后將切片與特異性二抗和過(guò)氧化物酶底物試劑盒在室溫下一起孵育1 h。使用光學(xué)顯微鏡觀察anti-α-SMA染色陽(yáng)性區(qū)域。

1.3.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR） 使用RNeasy Mini試劑盒取肝組織中的總RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃/15 min；98℃/5 min。然后使用BestarTMqPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95 ℃/2 min，94 ℃/20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃/20 s，40 個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸4min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算PI3K、AKT和mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)水平。PI3K上游引物：5’-GGTGAGGAACGAAGAATGGC-3’，下游引物：5’-TCCGAGGCAAGACAGGGATA-3’；AKT 上游引物：5’-AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3’，下游引物：5’-TCGAGCTCATCCTAATGGAG-3’；mTOR上游引物：5’-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3’，下游引物：5’-GATGAAGGGATGCTTTACA-3’；GAPDH上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

1.3.6 蛋白免疫印跡（Western Blot） 將肝組織裂解后收集總蛋白。通過(guò)8%的SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后將5%脫脂牛奶完全浸沒(méi)硝酸纖維素膜來(lái)封閉非特異性抗原（室溫下2 h）隨后，將膜與分別與 PI3K、AKT、mTOR、GAPDH 的一抗（1∶800稀釋）在4°C下孵育過(guò)夜，然后將山羊抗免IgG二抗按照1∶2 000的比例稀釋并在室溫下孵育1 h來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算PI3K、AKT和mTOR蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 26.0軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝功能指標(biāo)的影響 4組大鼠肝功能指標(biāo)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組的ALT和AST高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低劑量HZKXD組和高劑量HZKXD組的肝功能指標(biāo)均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且高劑量HZKXD組的ALT和AST水平低于低劑量HZKXD組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝功能指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on liver function indexes of liver fibrosis model rats

2.2 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠病理學(xué)損傷的影響 對(duì)照組大鼠組肝組織染色均勻，細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞排列有序，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰。模型組可觀察到肝細(xì)胞膨大，肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，并出現(xiàn)嚴(yán)重的出血和炎性浸潤(rùn)。低劑量HZKXD組和高劑量HZKXD組的損傷情況均較模型組有所緩解，其中高劑量HZKXD組損傷輕于低劑量HZKXD組。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色檢測(cè)HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠病理學(xué)損傷的影響Fig.1 HE staining to detect the effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on the pathological damage of liver fibrosis model rats

2.3 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝纖維化的影響如圖2所示，粉紅色提示正常肝組織，藍(lán)灰色為模型組織。4組大鼠肝纖維化情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高劑量HZKXD組的膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)低于低劑量HZKXD組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且兩者均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

圖2 Masson染色檢測(cè)HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝纖維化的影響Fig.2 Masson staining to detect the effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on liver fibrosis in rats with liver fibrosis

表2 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)的影響Tab.2 Effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on the volume fraction of liver tissue collagen in liver fibrosis model rats

2.4 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠成纖維細(xì)胞的影響 如圖3所示，藍(lán)色為細(xì)胞核，棕黃色為被染色的α-SMA蛋白。結(jié)果顯示模型組的α-SMA蛋白高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3。高劑量HZKXD組的膠原蛋白的體積分?jǐn)?shù)、α-SMA蛋白低于低劑量HZKXD組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且兩者均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 免疫組化染色檢測(cè)α-SMA蛋白評(píng)估HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠成纖維細(xì)胞的影響（×400）Fig.3 Immunohistochemical staining to detect α-SMA protein to evaluate the effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on fibroblasts in rat liver fibrosis（×400）

表3 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR mRNA的影響Tab.3 Effects of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on PI3K，AKT and mTOR mRNA in liver tissues of liver fibrosis model rats

2.5 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR mRNA的影響 4組大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR轉(zhuǎn)錄水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組的PI3K、AKT和mTOR mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。低劑量HZKXD組的PI3K、AKT和mTOR mRNA表達(dá)量低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。高劑量HZKXD組的PI3K、AKT和mTOR mRNA表達(dá)量低于模型組和低劑量HZKXD組，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白的影響Tab.4 The effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on PI3K，AKT and mTOR protein in liver tissue of rats with liver fibrosis

2.6 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白的影響 4組大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。模型組的PI3K、AKT和mTOR蛋白>表達(dá)量高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低劑量HZKXD組的PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)量低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。高劑量HZKXD組的PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)量低于模型組和低劑量HZKXD組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖4和表5。

圖4 Western-Blot檢測(cè)HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白表達(dá)量的影響Fig.4 Western blot detection of the effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on the expression of PI3K，AKT and mTOR protein in liver tissue of liver fibrosis model rats

表5 HZKXD對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白的影響Tab.5 The effect of Huazhuo Kangxian Baogan Decoction on PI3K,AKT and mTOR protein in liver tissue of rats with liver fibrosis

3 討論

肝纖維化是持續(xù)性和慢性肝損傷的結(jié)果，在肝纖維化過(guò)程中，肝細(xì)胞受損、炎癥細(xì)胞被募集、肝星狀細(xì)胞被激活、成纖維細(xì)胞大量繁殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失調(diào)，最終可能導(dǎo)致肝功能衰竭甚至肝癌[8]。研究治療肝纖維化的新方法具有重要的臨床意義。

近年來(lái)，中醫(yī)中藥在治療肝纖維化中取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，在中醫(yī)理論中，肝纖維化屬于“正虛血瘀”以及“濁毒”，其表現(xiàn)為肝腎陰虛與脾腎陽(yáng)虛以及肝絡(luò)瘀阻[9]。HZKXD是以黃芩、黃連、鱉甲、三棱、紅景天、田基黃、絞股藍(lán)、茵陳、虎杖組成，其從肝纖維化相關(guān)的“濁毒”理論出發(fā)，兼以行氣活血、滋陰柔肝的中心思想而擬成[10]。在本次研究中，通過(guò)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型，并以不同劑量的HZKXD干預(yù)，結(jié)果顯示模型組的AST和ALT顯著升高，肝組織出現(xiàn)損傷和大量的膠原蛋白累積，而HZKXD可劑量依賴性的降低AST和ALT水平，緩解肝組織損傷和纖維化程度。黃芩和黃連均具有“瀉火解毒”之功效，兩者可緩解“濁毒”抑制肝纖維化[11-12]。鱉甲、三棱、紅景天分別具有“滋陰潛陽(yáng)”“消積止痛”“益氣活血”之功效，可解除肝纖維化患者“正虛”。田基黃、絞股藍(lán)均具有“清熱解毒”之功效，從而進(jìn)一步幫助“清毒化濁”。茵陳和虎杖“清利濕熱”“活血散瘀”，并緩解肝纖維化患者“血瘀”之證。本此研究結(jié)果表明單獨(dú)使用HZKXD可顯著緩解肝纖維化大鼠的纖維化，并保護(hù)肝功能。

成纖維細(xì)胞大量繁殖是肝纖維化的重要基礎(chǔ)，其會(huì)分泌大量的膠原蛋白累積在肝細(xì)胞周圍[13]。α-SMA是肝成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白之一，研究已經(jīng)證實(shí)了纖維化過(guò)程中，α-SMA顯著升高，而抑制α-SMA可有效緩解肝纖維化[14]。成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的累積受到細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)控，其中PI3K/AKT/mTOR通路是最主要的通路之一，它不但可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，還可以促進(jìn)膠原蛋白和細(xì)胞外蛋白的累積，導(dǎo)致纖維化[15-16]。本此研究結(jié)果顯示，有四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠肝組織中α-SMA蛋白表達(dá)量顯著升高，PI3K/AKT/mTOR通路轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)量也顯著升高，而HZKXD可顯著的抑制α-SMA蛋白表達(dá)，下調(diào)PI3K/AKT/mTOR通路。研究顯示HZKXD中的黃芩可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制人軟骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。黃連是HZKXD的主要成分，其中的活性成分黃連素可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路抑制IL-21/IL-21R介導(dǎo)的成纖維樣滑膜細(xì)胞的炎性增殖，這提示HZKXD中的活性成分可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并減少細(xì)胞外膠原蛋白的累積，降低炎性反應(yīng)，從而緩解纖維化。

綜上所述，HZKXD可緩解肝纖維化模型大鼠肝組織中膠原蛋白累積，還可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路減少成纖維細(xì)胞，從而緩解肝纖維化。關(guān)于HZKXD調(diào)控PI3K/AKT/mTOR通路緩解纖維化的作用仍需要臨床研究證實(shí)，其調(diào)控機(jī)制也需要進(jìn)一步研究。