劉洪美，鄭夢(mèng)瑤，袁華山，王平東，趙 皖，肖理文，葉 金，王松雪?

（1. 國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院 糧油質(zhì)量安全研究所，北京 102629；2. 南京中儲(chǔ)糧糧油質(zhì)監(jiān)中心有限公司，江蘇 南京 211151；3. 南京微測(cè)生物科技有限公司，江蘇 南京 210031）

伏馬毒素（Fumonisin，簡(jiǎn)寫為FB），又稱煙曲霉毒素，是由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme Sheld）、黑曲霉（Aspergillus nigri）、鏈格孢霉菌（Alternaria alternata）產(chǎn)生的水溶性有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，廣泛存在于玉米、小麥、大麥、大米、燕麥等糧食作物及其制品中[1-3]。目前，已鑒定出的伏馬毒素約有28種，根據(jù)R基基團(tuán)的不同，可分為伏馬毒素A（FA1）、伏馬毒素B（FB1和FB2）、伏馬毒素C（FC）和伏馬毒素P（FP）四大類，其中FB1毒性最強(qiáng)[4-5]，已被國(guó)際癌癥研究中心列為2B級(jí)致癌物[6]，可引發(fā)人的食道癌、馬科動(dòng)物的神經(jīng)功能紊亂、豬的肺水腫，以及嚙齒類動(dòng)物的腎毒性和肝毒性等[4,7-10]。為此，國(guó)際食品法典委員會(huì)規(guī)定未處理的玉米中伏馬毒素B1和B2含量不得超過400 μg/kg[11]。我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定豬、兔、馬的配合飼料中伏馬毒素（B1+B2）的限量值不超過5 mg/kg。

目前，我國(guó)市場(chǎng)上伏馬毒素的檢測(cè)主要有以下幾種方法：（1）精密儀器檢測(cè)法包括高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[12-18]，該方法檢測(cè)準(zhǔn)確度高、精密度高、重現(xiàn)性好，但對(duì)操作人員和實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高，前處理過程復(fù)雜，且儀器使用和維護(hù)成本高，很難應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[19-25]。（2）酶聯(lián)免疫吸附法為早期的快檢方法，因其檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，儀器使用成本低，在早期應(yīng)用中較為廣泛[22]。但是，每次檢測(cè)前，酶聯(lián)免疫吸附法都需要根據(jù)不同的檢測(cè)環(huán)境現(xiàn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作要求高，檢測(cè)時(shí)間也長(zhǎng)，而且需要額外的試劑來(lái)穩(wěn)定抗體[23]。近年來(lái)，隨著測(cè)流層析技術(shù)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附法正逐步被替代，甚至是淘汰[24]。（3）膠體金免疫層析法雖然前處理步驟簡(jiǎn)便，使用快捷，無(wú)需使用大型且昂貴的儀器和專業(yè)的操作人員，可直接肉眼觀察是否超標(biāo)，但是受溫濕度的影響較大，存在假陰性和假陽(yáng)性、靈敏度低的缺點(diǎn)[24,26]。熒光納米材料憑借高靈敏度和良好的選擇性而具有很好的應(yīng)用前景。

時(shí)間分辨熒光納米微球（Time Resolved Fluorescent nanospheres）通常將Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+等長(zhǎng)效熒光的鑭系稀土離子包裹在聚苯乙烯材料或螯合負(fù)載在氧化硅納米粒子中，以提高鑭系配合物的熒光強(qiáng)度，避免熒光猝滅。其中，Eu3+應(yīng)用較多，具有斯托克位移大（276 nm），熒光壽命長(zhǎng)（ns級(jí)）的優(yōu)點(diǎn)，可有效避免激發(fā)光和被檢物中非特異熒光干擾。本研究以時(shí)間分辨熒光納米微球（Eu3+）為標(biāo)記物，制備了一種基于時(shí)間分辨熒光納米微球的FB1熒光快速定量檢測(cè)卡，該檢測(cè)卡結(jié)合了時(shí)間分辨熒光微球技術(shù)、測(cè)流層析技術(shù)以及免疫分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，適用于FB1現(xiàn)場(chǎng)快速便攜式定量檢測(cè)，具有靈敏度高、線性范圍寬、試劑的穩(wěn)定性良好、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)效率高，產(chǎn)品便于儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：ROMER國(guó)際貿(mào)易（北京）有限公司；伏馬毒素B1完全抗原（FB1-BSA）、鼠源FB1單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG（H+L）、200 nm羧基修飾的時(shí)間分辨熒光納米微球（Eu，激發(fā)波長(zhǎng)365 nm、發(fā)射波長(zhǎng)615 nm）：上海飛測(cè)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜（Sartorius CN140）：賽多利斯（上海）貿(mào)易有限公司；樣品墊（SB08）、聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC，SMA31-40）底板、A-9塑料卡和吸收墊（CH37K）：上海金標(biāo)生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、碳二亞胺（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；所有其它分析純化學(xué)試劑：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為娃哈哈純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；實(shí)驗(yàn)所需樣品（玉米、小麥、大米）：超市購(gòu)入或從企業(yè)取得。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光定量快速檢測(cè)儀（型號(hào)：FD-600）、檢測(cè)卡恒溫孵育器（型號(hào)：FD-2200）、MD-12旋渦混勻器（型號(hào)：MD-12）：上海飛測(cè)生物科技有限公司；XYZ 3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)：美國(guó)Biodot公司；HGS20可編程切條機(jī)：杭州峰航科學(xué)儀器有限公司；高速離心機(jī)：上海湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電子天平（型號(hào)：BSA3202S-CW）：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；試管旋轉(zhuǎn)混勻儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的制備

1.3.1.1 熒光探針的制備 時(shí)間分辨熒光納米微球表面的羧基和鼠源FB1單克隆抗體的氨基通過酰胺鍵連接制備熒光探針。具體的偶聯(lián)過程如下：準(zhǔn)確移取100 μL超聲混勻后的時(shí)間分辨熒光納米微球和900 μL MES緩沖液（0.05 mol/L，pH 6.0），12 000 r/min離心10 min，去上清，重復(fù)兩次；加入新鮮配制的40 μL 50 mg/mL碳二亞胺（EDC）溶液和40 μL 50 mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）溶液，置于試管旋轉(zhuǎn)混勻儀上20 r/min旋轉(zhuǎn)混勻活化30 min?；罨Y(jié)束后，12 000 r/min離心10 min，去除過量的活化劑，并加入1 mL Tris-HCl緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.0）和鼠源FB1單克隆抗體，置于試管旋轉(zhuǎn)混勻儀上20 r/min反應(yīng)120 min后，12 000 r/min離心10 min，棄上清。再加入100 μL 50 mg/mL BSA溶液20 r/min封閉60 min。最后，12 000 r/min離心10 min，去上清，加入1 mL保存液（0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.0，5%蔗糖，3%海藻糖，0.1% NaN3，1% BSA和1% Tween-20），得到時(shí)間分辨熒光納米微球標(biāo)記FB1單克隆抗體復(fù)合物，即為熒光探針。

1.3.1.2 NC膜和結(jié)合墊的制備 將伏馬毒素B1完全抗原（FB1-BSA）用PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）稀釋至0.4 mg/mL，并加入5%的蔗糖溶液封閉，通過XYZ 3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)以0.8 μL/cm的噴涂量將其固定在NC膜上（距離左端10 mm處），作為檢測(cè)線（T線）；將山羊抗小鼠IgG（H+L）稀釋至1 mg/mL，并加入5%的蔗糖溶液封閉，以0.8 μL/cm的噴涂量固定在T線右側(cè)5 mm處，作為C線；將FB1單克隆抗體-時(shí)間分辨熒光納米微球標(biāo)記復(fù)合物噴涂在結(jié)合墊上作為熒光標(biāo)記物結(jié)合墊；最后將制備好的NC膜和結(jié)合墊37 ℃干燥24 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的組裝 在長(zhǎng)8 cm的PVC底板上，依次搭接樣品墊、熒光標(biāo)記物結(jié)合墊、劃有C/T線的NC膜和吸水紙（相互重疊2 mm）組成完整的試紙條，用切條機(jī)切成規(guī)格為60 mm×4 mm的試紙條，放入配套的塑料卡槽，用壓殼機(jī)壓緊，加入1包1 g的干燥劑，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

取有代表性的待測(cè)樣品500 g至1 000 g，用粉碎機(jī)粉碎后過20目篩，準(zhǔn)確稱取5 g樣品粉末于50 mL離心管中，加入25 mL樣品提取液（80%甲醇水，含2%氯化鈉），渦旋混勻提取3 min，提取結(jié)束后，4 000 r/min，離心2 min，得到樣品提取液。取100 μL樣品提取液加入900 μL樣品稀釋液（0.1 M PBS，0.2%BSA和0.2% Tween 20%），渦旋混勻3～5 s得到待測(cè)樣品稀釋液，備用。

1.3.3 FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的檢測(cè)原理

將待測(cè)樣品稀釋液滴加在加樣孔，樣品中含有的FB1與結(jié)合墊中的時(shí)間分辨熒光納米微球標(biāo)記的FB1抗體結(jié)合，并通過吸水紙?zhí)峁┑膭?dòng)力進(jìn)行毛細(xì)層析作用向前層析，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)T線時(shí)，余下未結(jié)合的時(shí)間分辨熒光納米微球標(biāo)記的FB1抗體與T線噴涂的FB1抗原結(jié)合，多余的熒光探針與FB1結(jié)合形成的熒光復(fù)合物在C線處被山羊抗小鼠IgG（H+L）捕獲，形成清晰可見的熒光條帶。T線上結(jié)合的熒光探針量與樣品中含有的FB1量成反比，質(zhì)控線C與FB1含量無(wú)關(guān)。當(dāng)8分鐘反應(yīng)結(jié)束后，通過FD-600型熒光定量快速檢測(cè)儀讀取T值和C值，并計(jì)算T/C值，再通過儀器內(nèi)置伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣品中伏馬毒素B1的含量。

1.3.4 FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的使用

取100 μL“1.3.2 樣品前處理”制備的待測(cè)樣品稀釋液加入到FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的加樣孔中，水平放置于FD-2200檢測(cè)卡恒溫孵育器上37 ℃恒溫孵育8 min，孵育結(jié)束后將檢測(cè)卡插入FD-600型熒光定量快速檢測(cè)儀中，讀數(shù)值即為樣品的實(shí)際檢測(cè)濃度值。若檢測(cè)濃度值大于6 000 μg/kg時(shí)，將待測(cè)樣品稀釋液進(jìn)一步稀釋5倍后再進(jìn)行檢測(cè)，所得讀數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)即為最終檢測(cè)結(jié)果。

1.4 FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的性能評(píng)價(jià)

1.4.1 靈敏度和線性范圍評(píng)價(jià)

分別取10個(gè)無(wú)FB1污染的陰性小麥樣品、10個(gè)無(wú)FB1污染的陰性玉米樣品、10個(gè)無(wú)FB1污染的陰性大米樣品，用FB1熒光定量快速檢測(cè)卡依次檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)1次，檢出限（Limits of Detection，LOD）為測(cè)定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限（Limits of Quantitation，LOQ）為測(cè)定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，LOD和LOQ越小，靈敏度越高。分別在無(wú)FB1污染的陰性小麥樣品、無(wú)FB1污染的陰性玉米樣品、無(wú)FB1污染的陰性大米樣品中添加FB1標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)水平為250、500、1 000、2 000、4 000和6 000 μg/kg，3個(gè)平行，然后用伏馬毒素B1熒光定量快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，以添加濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)B1熒光定量快速檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

1.4.2 準(zhǔn)確度和重復(fù)性評(píng)價(jià)

分別在無(wú)FB1污染的小麥、玉米和大米樣品中添加FB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加標(biāo)水平為250、500、1 000、2 000、4 000和6 000 μg/kg，3個(gè)平行，依次用FB1熒光定量快速檢測(cè)卡檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率和變異系數(shù)，以加標(biāo)回收率表征準(zhǔn)確度，以變異系數(shù)表征重復(fù)性。

1.4.3 與色譜法的對(duì)比

取2個(gè)自然FB1污染的小麥樣品、2個(gè)自然FB1污染的玉米樣品和2個(gè)自然FB1污染的大米樣品，3個(gè)平行，分別采用國(guó)標(biāo)液相色譜法[27]和FB1熒光定量快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算兩種檢測(cè)結(jié)果的符合度（符合度=x/y×100%，x：FB1熒光定量快速檢測(cè)卡3次檢測(cè)結(jié)果的平均值，y：液相色譜法3檢測(cè)結(jié)果的平均值）。

1.4.4 特異性評(píng)價(jià)

考察該FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的特異性，以避免交叉反應(yīng)的發(fā)生，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。分別將其他常見的五種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品（T-2毒素、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素）添加在陰性玉米樣品中，加標(biāo)水平為1 000 μg/kg，3個(gè)平行，然后用FB1熒光定量快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算每種毒素的交叉反應(yīng)率（交叉反應(yīng)率=測(cè)定值/添加濃度×100%），交叉反應(yīng)率越小，表明特異性越好。同時(shí)，采用方差分析中的無(wú)重復(fù)雙因素分析法對(duì)添加濃度和檢出濃度進(jìn)行差異顯著性分析，計(jì)算兩組數(shù)據(jù)的P-value，若P-value大于0.01，小于0.05，表明差異顯著；P-value小于0.01，表明差異極顯著；若P-value大于0.05，表明兩組數(shù)據(jù)無(wú)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對(duì)FB1熒光定量快速檢測(cè)卡和FB1酶聯(lián)免疫試劑盒的影響

選擇玉米加工副產(chǎn)物為檢測(cè)對(duì)象，分別將離心后上清液的pH調(diào)至2、4、6、8、10和12共6個(gè)pH梯度，3個(gè)平行，分別使用FB1熒光定量快速檢測(cè)卡和FB1酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)，并計(jì)算與色譜法檢測(cè)結(jié)果的符合度。檢測(cè)數(shù)據(jù)見圖1，F(xiàn)B1熒光定量快速檢測(cè)卡檢測(cè)不同pH上清液的結(jié)果符合度為104.12%～111.28%，變異系數(shù)CV為5.63%～9.91%，F(xiàn)B1酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)不同pH上清液的結(jié)果符合度為106.99%～119.01%，變異系數(shù)CV為8.20%～14.70%，表明提取液的pH在2～12范圍內(nèi)可以直接檢測(cè)無(wú)需調(diào)整pH，且FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的符合度和重復(fù)性略好于FB1酶聯(lián)免疫試劑盒。

圖1 不同pH對(duì)FB1熒光定量快速檢測(cè)卡和FB1酶聯(lián)免疫試劑盒的影響Fig.1 Effects of different pH on FB1 fluorescence quantitative rapid detection card and FB1 enzyme-linked immunosorbent assay kit

2.2 FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的性能評(píng)價(jià)

2.2.1 靈敏度和線性范圍評(píng)價(jià)

10個(gè)無(wú)FB1污染的陰性小麥樣品、10個(gè)無(wú)FB1污染的陰性玉米樣品、10個(gè)無(wú)FB1污染的陰性大米樣品的檢測(cè)結(jié)果如表1所示，表明FB1熒光定量快速檢測(cè)卡檢測(cè)大米的LOD為35.37 μg/kg，LOQ為117.90 μg/kg，檢測(cè)小麥的LOD為36.00 μg/kg，LOQ為120.00 μg/kg，檢測(cè)玉米的LOD為37.17 μg/kg，LOQ為123.9 μg/kg，表明FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的靈敏度良好。FB1熒光定量快速檢測(cè)卡檢測(cè)小麥、玉米和大米的線性范圍均為250～6 000 μg/kg，回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：大米，y=1.036 3x-59.117，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 2；小麥，y=1.048 4x+4.179 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5；玉米，y=1.084 3x-1.607 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，F(xiàn)B1熒光定量快速檢測(cè)卡線性范圍較寬且線性關(guān)系良好。

表1 伏馬毒素B1熒光定量快速檢測(cè)卡的檢出限和定量限Table 1 Limit of detection and Limit of quantitation of fumonisin B1 fluorescence quantitative rapid detection card

續(xù)表1

2.2.2 準(zhǔn)確度和重復(fù)性分析

FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果（表2）表明不同糧食谷物中FB1的回收率為83.38%～114.66%，變異系數(shù)小于15%，表明FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好。

表2 不同樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性Table 2 Accuracy and repeatability of detection for different samples

2.2.3 與色譜法的對(duì)比

FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果和國(guó)標(biāo)液相色譜法檢測(cè)結(jié)果的符合度，如表3所示，不同糧食谷物中FB1檢測(cè)結(jié)果的符合度為92.53%～106.26%，變異系數(shù)在10.37%以內(nèi)，表明FB1熒光定量快速檢測(cè)卡和國(guó)標(biāo)液相色譜法的檢測(cè)結(jié)果符合度良好。

表3 伏馬毒素B1熒光定量快速檢測(cè)卡與色譜法檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比Table 3 Comparison of the results of Fumonisin B1 by fluorescence quantitative rapid detection card and chromatography

2.2.4 方法特異性分析

五種常見真菌毒素（T-2毒素、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素）的交叉反應(yīng)率均小于5%（表4）。五種常見真菌毒素的添加濃度和檢出平均值的P-value為0.005 6＜0.01，表明添加濃度和檢出濃度的差異極顯著。因此，交叉反應(yīng)率和方差分析的結(jié)果均表明FB1熒光定量快速檢測(cè)卡的特異性良好。

表4 伏馬毒素B1熒光定量快速檢測(cè)卡的特異性Table 4 Specificity of the fumonisin B1 fluorescent quantitative rapid detection card

3 結(jié)論

本研究以時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記的單克隆抗體為熒光探針，基于測(cè)流層析原理和競(jìng)爭(zhēng)抑制的原理建立了伏馬毒素B1熒光定量快速檢測(cè)卡用于不同糧食谷物樣本中FB1的快速定量測(cè)定。樣品提取液的pH在2～12范圍內(nèi)，該伏馬毒素B1熒光定量快速檢測(cè)卡可以直接檢測(cè)無(wú)需調(diào)整pH。FB1熒光定量快速檢測(cè)卡性能評(píng)估結(jié)果表明，其檢出限和定量限遠(yuǎn)低于伏馬菌素的限量標(biāo)準(zhǔn)；在250～6 000 μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2大于0.99）；檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)液相色譜法的符合度較好；具有良好的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和特異性。因此，本研究開發(fā)了一種低成本、操作簡(jiǎn)單、可準(zhǔn)確定量的FB1熒光定量快速檢測(cè)卡，適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品種FB1的場(chǎng)快速、定量檢測(cè)，可減少在大量樣品檢測(cè)時(shí)對(duì)大型昂貴儀器的依賴。