昌思思 ，姜黎黎 ，羅春蕊 ，周曉芳 ，寸建萍 ，伏曉慶 ，田炳均

（1）昆明市疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650228；2）云南省疾病預(yù)防控制中心，云南，昆明 650022）

手足口?。╤and foot and mouth disease，HFMD）是由數(shù)十種腸道病毒引起的兒童常見(jiàn)傳染病，以5 歲以下兒童發(fā)病為主。癥狀以發(fā)熱和皮疹和/或皰疹為主要特征。部分病人可并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，并可發(fā)生死亡。少年和成人感染后多不發(fā)病，但能傳播病毒[1]。2008年安徽省阜陽(yáng)市發(fā)生了由EV-A71 引起的“嬰幼兒不明原因重癥肺炎”，該疫情中出現(xiàn)了聚集性手足口病重癥病例和死亡病例，隨后手足口病在全國(guó)大規(guī)模暴發(fā)流行[2-3]。我國(guó)于2008 年 5 月2日將手足口病正式納入丙類法定報(bào)告?zhèn)魅静」芾韀1]，隨后逐步成立了全國(guó)HFMD 實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)并開(kāi)展了對(duì)HFMD 的系統(tǒng)性研究。引起手足口病的病毒屬小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus），大多數(shù)是腸道病毒A 組（enterovirus species A，EV-A）、B 組（EV-B）。其中以EV-A71 及CV-Al6 型最為常見(jiàn)[4-5]。然而，2013 年和2015 年，中國(guó)很多省份報(bào)道了一系列由CV-A6 病毒引起的HFMD 暴發(fā)[6-7]。因此，加強(qiáng)CV-A6 的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)和分子進(jìn)化研究，掌握病毒傳播來(lái)源，是控制病毒流行和傳播的重要手段。

Song Yang[6]等對(duì)1992 年至2015 年中國(guó)分離的520 株和從GenBank 下載的287 株 共807 株CV-A6 病毒VP1 區(qū)基因（915bp）進(jìn)行了較為詳細(xì)的基因分型和分子流行病學(xué)研究，把CV-A6 分為A、B、C 和D 4 個(gè)基因型，B、C 和D 3 個(gè)基因型又被分為B1-B2，C1-C2 和D1-D3 基因亞型，而D3 亞型又被分為D3a 和D3b 兩個(gè)分支。作者認(rèn)為，D3 是最近幾年中國(guó)大陸流行的主要亞型，占研究總數(shù)的比例達(dá)90.95%（734/807），而D3a分支是目前中國(guó)CV-A6 相關(guān)HFMD 暴發(fā)的主要原因。

為探討2020 年云南省曲靖地區(qū)手足口病病例中CV-A6 病毒的分子流行病學(xué)和基因進(jìn)化特征，本研究對(duì)該年度曲靖地區(qū)CV-A6 病毒進(jìn)行基因測(cè)序分型和分子流行病學(xué)分析，為今后曲靖地區(qū)對(duì)由該病毒引起的HFMD 的防控提供分子生物學(xué)和分子流行病學(xué)證據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2020 年曲靖地區(qū)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)、縣及地區(qū)（市）醫(yī)院臨床診斷為HFMD 的門診及住院患兒為研究對(duì)象，病例診斷標(biāo)準(zhǔn)按《手足口病預(yù)防控制指南（2008年版）》[1]進(jìn)行。

1.2 研究方法

收集臨床診斷為HFMD 患兒的姓名、年齡、性別、發(fā)病日期、出疹部位、最高體溫、家庭住址、并發(fā)癥和采樣日期。

采集所有就診和住院患兒的大便、肛拭子或咽拭子。大便標(biāo)本保存于糞便標(biāo)本采集保存管（領(lǐng)因生物科技上海有限公司），肛拭子、咽拭子保存于含3 mL 病毒運(yùn)輸液的病毒采樣管（重慶中元匯吉生物技術(shù)有限公司），置-20℃保存。在冷藏條件下送云南省疾病預(yù)防控制中心手足口病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。

1.3 病毒RNA 提取

病毒RNA 提取試劑盒為QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN 公司），按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶 鏈?zhǔn)椒?應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和病毒型別鑒定

先用VP4/VP2 結(jié)合區(qū)引物MD91/OL68-1[8-9]對(duì)病毒進(jìn)行RT-PCR 和測(cè)序定型，再用各型病毒的相關(guān)引物[10]擴(kuò)增人類腸道病毒（human enteroviruses，EVs）VP1 區(qū)基因并測(cè)序。RT-PCR試劑盒為Access Quick RT-PCR（美國(guó)Promega 公司）。RT-PCR 程序?yàn)椋?0℃ 30 min，95℃ 15 min；94℃ 30 s，45℃ 30 s，68℃ 50 s，共40 個(gè)循環(huán)，最后在68℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并用Sequencher 4.0 軟件（美國(guó)Gene Codes 公司）進(jìn)行編輯、拼接，得到病毒VP1 區(qū)基因完整序列。測(cè)序結(jié)果在GenBank 進(jìn)行“Blast”搜索定型，再用Mega 5.2 軟件計(jì)算與原型株的核苷酸（nucleotide，NT）相似性和氨基酸（amino acid，AA）同源性，并用Obester[11-12]的經(jīng)典方法確定病毒型別。

1.5 CV-A6 病毒VP1 區(qū)基因參考序列的選擇

本研究以Song Y 等[6]和Mizuta K 等[13]發(fā)表的CV-A6 病毒VP1 區(qū)基因序列為參考，對(duì)曲靖地區(qū)CV-A6 VP1 區(qū)基因進(jìn)行基因進(jìn)化和分子流行病學(xué)分析。

1.6 病毒分子進(jìn)化分析

用Mega5.2 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)制作，制作參數(shù)選“Neighbor-joining method”，和“Kimura 2-parameter substitution model”，boot strap 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析項(xiàng)選1 000 個(gè) “Pseudoreplicate datasets”。

2 結(jié)果

2.1 2020 年病毒總體檢測(cè)情況

2020 年共從500 份標(biāo)本中檢測(cè)到49 株EVs，EVs 陽(yáng)性率為9.80%（49/500）。49 株EVs 中，A組病毒48 份，4 個(gè)血清型（其中CV-A4 3 株，占6.12%，3/49；CV-A6 36 株，占73.47%，36/49；CV-A10 5 株，占10.20%，5/49；CV-A16 4 株，占8.16%，4/49）。B 組病毒1 株，1 個(gè)血清型（CVB4 1 株，占2.04%，1/49）。2020 年曲靖地區(qū)發(fā)生了以CV-A6 為主的HFMD 流行，見(jiàn)表1。

表1 云南省曲靖地區(qū)2020 年500 份標(biāo)本中HFMD 病原分離率（%）Tab.1 Etiological isolation rates from 500 samples of HFMD patients，Qujing prefecture，Yunnan province，2020（%）

2.2 2020 年與2019 年病毒檢測(cè)情況的比較

2019 年李桂滿等[14]用同樣的方法從曲靖地區(qū)470 份糞便樣本中檢測(cè)得到62 株EVs，陽(yáng)性率為13.19%。62 株EVs 中，A 組病毒42 株，占67.74%，其中柯薩奇病毒A4 型（CV-A4）1 株（占1.61%），CV-A6 8 株（占12.90%），CV-A10 21 株（占33.87%），CV-A16 12 株（占19.35%）。62 株EVs 中，B 組病毒9 株（占14.52%），其中E11 和E12 各3 株（各占4.84%），E14 1 株（占1.61%），E30 2 株（占3.22%）。62 株EVs 中，C 組病毒11 株，全為脊髓灰質(zhì)炎病毒病毒1 型疫苗株，占陽(yáng)性總數(shù)的17.74%。2019 年未檢測(cè)FHMD 中最常見(jiàn)的EV-A71（屬A 組病毒），也未檢測(cè)到D 組病毒。總之，2019 年和2020 年都檢測(cè)到了CVA4、CV-A6、CV-A10 和CV-A16 等A 組病毒，2019 年以CV-A10 為多（占33.87%），2020 年以CV-A6 為最多（占73.47%）；2019 年檢測(cè)到到了E11、E12、E14 和E30 等B 組病毒，占1.61%～4.84%，檢測(cè)率都比較低，而2020 年只檢測(cè)到一株B 組病毒（CV-B4，占2.04%，表2）。

表2 2019～2020 年曲靖地區(qū)HFMD 病原檢測(cè)比較n（%）Tab.2 Pathogen detection from HFMD patients，Qujing prefecture，2019～2020 n（%）

本研究對(duì)2020 年曲靖地區(qū)36 株CV-A6 的基因進(jìn)化分析表明，它們均為D3a 亞型，與2019年流行株一致，未檢測(cè)到D3b 亞型，說(shuō)明兩年來(lái)D3a 單一亞型一直在該地區(qū)流行。

2.3 CV-A6 曲靖地區(qū)分離株的基因特征

2020 年，共從500 份HFMD 標(biāo)本中分離到CV-A6 病毒36 株，用MEGA 5.2 軟件對(duì)36 株病毒VP1 基因完整序列（915bp）與SongYang 等[6]和Mizuta K 等[13]發(fā)表的26 株參考株序列共62 株病毒作基因進(jìn)化分析，曲靖地區(qū)所有36 株均為D3a 亞型（圖1）。36 株CV-A6 與原型株Gdula（AY421764）的nt 同源性為82.40%～84.00%（差異率為16.00%～17.60%），AA 相似性為93.70%～96.70%（差異率為3.30%～6.30%）。

圖1 2020 年曲靖地區(qū)CV-A6 的基因進(jìn)化樹(shù)（●和大三角：曲靖地區(qū)分離株）Fig.1 The phylogenetic tree of CV-A6，Qujing prefecture，2020（● and big triangle:Qujing isolates）

2.4 曲靖地區(qū)36 株CV-A6 病毒與原型株Gdula VP1 區(qū)氨基酸位點(diǎn)變異分析

CV-A6 原型株 為Gdula（基因庫(kù)編號(hào)：AY421764），是1949 年由Gilbert Dalldorf 等[15]從脊灰樣病例的糞便標(biāo)本中用乳鼠培養(yǎng)分離出來(lái)的。其VP1 區(qū)全長(zhǎng)為915bp，編碼305 個(gè)氨基酸。用MEGA 5.2 軟件與原型株Gdula 比較，發(fā)現(xiàn)36 株曲靖市CV-A6 毒株的VP1 區(qū)氨基酸在35 個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)10～20 個(gè)變異，每個(gè)位點(diǎn)的變異數(shù)為1～2 個(gè)，如68 號(hào)毒株在8、11、32、98、160、174、194、261、279、305 等10 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異，173 號(hào)毒株在5、8、10、14、26、32、98、160、174、194、261、272、273、275、279、300、301、303、304 和305 等20 個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異。58、59 和67 號(hào)毒株在位點(diǎn)2 由D（天冬氨酸）變?yōu)閂（纈氨酸）。19、55、59、60、61、63、64、65、83、84、85、86、91、92、93、94、98、100、101、102、105、108、109、116、173、178、219等在位點(diǎn)5 由S（絲氨酸）變?yōu)門（蘇氨酸），而57、58、78 和99 等毒株在位點(diǎn)5 則由S（絲氨酸）變?yōu)镻（脯氨酸），這些毒株在位點(diǎn)5 分別發(fā)生了1～2 個(gè)氨基酸的變異（S-T 和/或S-P）。總之，曲靖地區(qū)毒株在每個(gè)位點(diǎn)分別發(fā)生了1～2 個(gè)氨基酸的變異。

3 討論

HFMD 多發(fā)生于兒童和青少年，常常導(dǎo)致發(fā)熱、咽喉痛、手和足部出疹、口腔和舌頭皰疹等。在少數(shù)情況下，患兒會(huì)發(fā)展為神經(jīng)源性肺水腫、無(wú)菌性腦炎和急性遲緩性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。大多數(shù)HFMD是由A 組腸道病毒（EV-A）引起的，尤其是EVA71 和CV-A16。最近幾年，由CV-A6 引起的HFMD 散發(fā)和暴發(fā)事件呈逐年增加的趨勢(shì)[6-7]。

Song Yang 等[6]曾首次對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)的CVA6 病毒全長(zhǎng)VP1 區(qū)序列進(jìn)行了較為全面的研究，將CV-A6 分為A、B、C 和D4 個(gè)基因型。他們把D 基因型又分為D1、D2 和D3 3 個(gè)基因亞型，D3 亞型又分為D3a 和D3b 2 個(gè)進(jìn)化分支（Lineage）。D3a 分支是中國(guó)大陸流行的主要分支。

本文對(duì)云南省曲靖地區(qū)2020 年手足口病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)病原學(xué)監(jiān)測(cè)進(jìn)行了研究并對(duì)36 株CV-A6 病毒VP1 區(qū)基因特征進(jìn)行了分析。共從500 份標(biāo)本中分離到49 株EVs，EVs 總體分離率為9.80%（49/500）。49 株EVs 中，A 組病毒48 株，占絕大多 數(shù)（97.96%，48/49），而B(niǎo) 組病毒只有1 株（2.04%，1/49）。A 組病毒中，CV-A4 病毒3 株，占A 組病毒的6.25%（3/48），CV-A6 病毒36 株，占A 組病毒的75.00%（36/48），CV-A10 病毒5 株，占A 組病毒的10.42%（5/48），CV-A16 病毒4 株，占A 組病毒 的8.33%（4/48）?？?見(jiàn)CV-A6 是2020 年曲靖地區(qū)手足口病的主要病原體，其次是CV-A10 和CV-A16。對(duì)CV-A6 的基因分析表明D3a 亞型是曲靖地區(qū)CV-A6 流行的主要亞型，未分離到其他基因型和亞型。

對(duì)36 株 CV-A6 基因位點(diǎn)的變化分析表明，與1949 年首次發(fā)現(xiàn)的原型株Gdula 相比較，36株病毒氨基酸在VP1 區(qū)35 個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)10～20 個(gè)變異，每個(gè)位點(diǎn)的變異數(shù)為1～2 個(gè)。Mizuta K等[13]用CV-A6 D1 亞型和D3 亞型毒株免疫兔子得到CV-A6 病毒抗血清，對(duì)2001～2017 年日本山形縣115 株CV-A6 分離株和105 個(gè)人血清進(jìn)行了抗原交叉分析，得出結(jié)論：A、B2 和D1～D3各亞型之間存在交叉中和效果，即用一個(gè)亞型作為抗原制備疫苗可以保護(hù)其他亞型病毒。說(shuō)明CV-A6 疫苗開(kāi)發(fā)是可行的。CV-A6 病毒已經(jīng)成為HFMD 的主要病原體，其所致的重癥病例也日益增加[16]。盡快開(kāi)發(fā)CV-A6 疫苗是預(yù)防和控制HFMD 的當(dāng)務(wù)之急。

本研究對(duì)2020 年云南省曲靖地區(qū)手足口病病例的病原體進(jìn)行了監(jiān)測(cè)分析并與2019 年的病原監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，并對(duì)2020 年36 株CV-A6 病毒的基因特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，它們均為D3a 亞型，與2019 年流行株一致，未檢測(cè)到D3b亞型，說(shuō)明兩年來(lái)D3a 單一亞型一直在該地區(qū)流行。本研究結(jié)果對(duì)今后曲靖地區(qū)乃至云南省防控HFMD 尤其是CV-A6 引起的HFMD 提供了非常重要的基因檢測(cè)數(shù)據(jù)。建議今后對(duì)曲靖地區(qū)HFMD 的病原學(xué)和基因進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測(cè)，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)不同的手足口病病原體或同一血清型的不同基因型/亞型或進(jìn)化分支，并對(duì)毒株的基因型和亞型數(shù)據(jù)進(jìn)行更新，這樣對(duì)加強(qiáng)HFMD 病原體的分子流行病學(xué)研究具有重要意義。本研究48 株病毒的VP1 區(qū)基因序列已提交到GenBank，基因庫(kù)編號(hào)為：LC626196-LC626243。